Una novela va de sealizacin Control

inducida Resistencia Sistmica en

Arabidopsis
Abstracto
Las plantas tienen la capacidad de adquirir un mayor nivel de resistencia al ataque
de patgenos despus de ser expuesto a los estmulos biticos especficos. En
Arabidopsis, no patgeno, raz colonizadoras de Pseudomonas fluorescensbacterias
desencadenan una resistencia sistmica inducida (ISR) de respuesta frente a la
infeccin por el patgeno bacteriano de la hoja P. syringae pv tomate.En contraste
con la clsica, la resistencia sistmica adquirida inducida por patgenos (SAR), esta
respuesta ISR rizobacterias mediada es independiente de la acumulacin de cido
saliclico y la activacin de genes relacionados con la patognesis. Usando la
respuesta jasmonato mutante jar1 , la respuesta de etileno mutante etr1 , y el
mutante reguladora SAR npr1 , nos demuestran que la transduccin de seales que
conduce a P. fluorescens mediada por WCS417r ISR requiere capacidad de
respuesta
a
jasmonato
y
etileno
y
depende
de
NPR1. Similar
a P. fluorescens WCS417r, jasmonato de metilo y el precursor de etileno 1aminociclopropano-1-carboxilato de metilo fueron eficaces en la induccin de
resistencia
contra P. s. tomate en
plantas
NahG
cido
saliclico
nonaccumulating.Adems, la proteccin inducida por el jasmonato de metilo fue
bloqueada en jar1, etr1 , y npr1 plantas, mientras que la proteccin inducida-1aminociclopropano-1-carboxilato de metilo se vio afectada en ETR1 y npr1plantas,
pero no en jar1 plantas. Por lo tanto, postulamos que mediada por rizobacterias ISR
sigue una va novedosa de sealizacin en el que los componentes de la respuesta
jasmonato y etileno se dedican sucesivamente para desencadenar una reaccin de
defensa que, como SAR, est regulada por NPR1.Proporcionamos evidencia de que
los procesos posteriores de NPR1 en la va de ISR son divergentes de los de la va de
SAR, lo que indica que NPR1 regula diferencialmente las respuestas de defensa, en
funcin de las seales que son provocadas durante la induccin de la resistencia.

INTRODUCCIN
Las plantas de las cuales las races han sido colonizados por cepas seleccionadas de
fluorescente no patgeno Pseudomonas spp desarrollar un mayor nivel de
proteccin contra el ataque de patgenos (revisado en van Loon et al., 1998 ).Colar
WCS417r de P. fluorescens es una cepa de control biolgico que se ha demostrado
para desencadenar una resistencia sistmica inducida (ISR) de respuesta en varias
especies de plantas, incluyendo clavel ( Van Peer et al., 1991 ), rbano ( Leeman et
al., 1995 ), tomate ( Duijff et al., 1996 ), y Arabidopsis (Pieterse et al., 1996 ). En
Arabidopsis, P. fluorescens mediada WCS417r ISR se ha manifestado en contra de la
hoja patgeno bacteriano P. syringae pv tomate , el patgeno fngico raz Fusarium
oxysporum f sp raphani ( Pieterse et al., 1996 ;van Wees et al., 1997 ), y la hoja
hongo patgeno Peronospora parasitica (J. Ton y CMJ Pieterse, datos no publicados),
lo que indica que este tipo de resistencia inducida biolgicamente es eficaz contra
diferentes tipos de agentes patgenos.

ISR-inducir rizobacterias muestran especificidad de hospedador en lo que respecta a

la obtencin de la resistencia ( Leeman et al., 1995 ; . van Wees et al, 1997 ), lo que
indica que el reconocimiento especfico entre las bacterias de proteccin y la planta
es un requisito previo para la activacin de la cascada de sealizacin que lleva a
ISR. Los acontecimientos de sealizacin corriente abajo en la va de ISR
rizobacterias mediada difieren claramente de los de la va que conduce de la
infeccin por patgenos a la resistencia sistmica adquirida clsico (SAR). SAR es
una forma de resistencia a la enfermedad sistmica inducida que se desencadena
despus de la infeccin por un patgeno necrotizante (revisado enRyals et al.,
1996 ). El estado de SAR se caracteriza por un incremento temprano en cido
saliclico sintetizado endgenamente (SA; Malamy et al., 1990 ; Mtraux et al.,
1990 ) y la activacin concomitante de genes que codifican (PR) protenas
relacionadas con la patognesis ( Ward et al ., 1991 ). SA-nonaccumulating plantas
NahG que expresan la salicilato hidroxilasa bacteriana ( nahG gen) son incapaces de
desarrollar SAR y no muestran PR activacin de genes despus de la infeccin de
patgenos, lo que indica que SA es una condicin necesaria intermedio en la va de
sealizacin de SAR ( Gaffney et al., 1993 ; Delaney et al., 1994 ). En contraste con
patgenos inducida SAR, ISR rizobacterias mediada no est asociado con la
activacin de PR genes ( Hoffland et al., 1995 ; . Pieterse et al, 1996 ; . van Wees et
al, 1997 ). Adems, las plantas NahG que son incapaces de expresar SAR desarrollar
niveles normales de ISR despus del tratamiento de las races con ISR-inducir
rizobacterias ( Pieterse et al., 1996 ; . Press et al, 1997 ;van Wees et al., 1997 ). Esto
demuestra que la resistencia a la enfermedad inducida biolgicamente puede ser
controlada por al menos dos vas que divergen en su requisito para la acumulacin
de SA.
Adems SA, reguladores del crecimiento de la planta de cido jasmnico y etileno
han sido implicados en las respuestas de defensa de las plantas ( Boller,
1991 ;Wasternack y Parthier, 1997 ). El cido jasmnico y sus derivados, referidos
colectivamente como jasmonatos, inducen la expresin de genes que codifican
protenas relacionadas con la defensa, tales como tioninas ( Epple et al., 1995 ) y
los inhibidores de proteinasa ( Farmer et al., 1992 ), mientras que de etileno activa
varios miembros de la PR superfamilia de genes ( Brederode et al., 1991 ; . Potter et
al, 1993 ). Jasmonato y etileno tambin se han demostrado para actuar de forma
sinrgica en la estimulacin inducida por elicitor- PR expresin gnica ( Xu et al.,
1994 ). Adems, ambos reguladores estn implicados en la activacin de genes que
codifican las defensinas vegetales ( Penninckx et al., 1996 y enzimas implicadas en
la biosntesis de fitoalexina) ( Ecker y Davis, 1987 ; Gundlach et al., 1992 ). Tanto
jasmonato y etileno se han notificado a participar en las respuestas de defensa
sistmica inducidas ( van Loon, 1977 ; Farmer y Ryan, 1992 ; . Penninckx et al,
1996 ), aunque su papel es en muchos casos todava no est claro.
Varios mutantes de Arabidopsis afectadas en su respuesta a la molculas de
sealizacin jasmonato, etileno, o SA se han caracterizado en los ltimos aos.Para
obtener mayor conocimiento en la va de sealizacin que controla no patgeno ISR
rizobacterias
mediada,
se
examin
si
la
respuesta
jasmonato
mutante jar1 ( Staswick
et
al.,
1992 ),
la
respuesta
de
etileno
mutante etr1 (Bleecker et al., 1988 ), y la reglamentacin SAR mutante npr1 ( Cao
et al., 1994 ) son capaces de expresar ISR despus de la colonizacin de las races
por P.fluorescens WCS417r. Mutant jar1 exhibe sensibilidad reducida a jasmonato de
metilo (MeJA), lo que lleva a una disminucin en la inhibicin MeJA-inducible de
crecimiento de la raz primaria y la acumulacin MeJA-inducible de una protena de
almacenamiento vegetativo ( Staswick et al., 1992 ). Mutant etr1 ( . Bleecker et al,
1988 ) se altera en su capacidad para percibir y reaccionar a etileno debido a una
mutacin en el ETR1 gen, que codifica un receptor de etileno ( Chang et al.,
1993 ; Schaller y Bleecker, 1995 ). Arabidopsis jar1 plantas, as como plantas de

tabaco de etileno-insensible que expresan el mutante de Arabidopsis ETR1 gen, son

susceptibles
a
microorganismos
oportunistas
(http://www.sheridan.com/aspp/abs/60/1458.html ; . Knoester et al, 1998 ), mientras
que las plantas de tipo salvaje muestran un fenotipo resistente, lo que indica que
ambas mutaciones afectan a eventos de sealizacin que conducen a la resistencia
a enfermedades. Mutantes de Arabidopsis NPr1 , NIM1 , y sai1 se ven afectadas
aguas abajo de SA en la va de sealizacin de SAR y como resultado se bloquean
en la respuesta SAR ( Cao et al., 1994 ; Delaney et al., 1995; . Shah et al,
1997 ) . Los genes implicados son allica y el cdigo para una protena que contiene
la repeticin-ankyrin con homologa con el factor de mamferos transduccin de la
seal I? B?, Que est implicado en las respuestas de resistencia a las enfermedades
en una amplia gama de organismos superiores (Cao et al., 1997 ; Ryals et al. ,
1997 ).
El uso de los mutantes de Arabidopsis jar1 , etr1 y npr1 ,
que P.fluorescens ISR WCS417r mediada contra P. s. tomate en
una va de sealizacin novela que depende de la capacidad de
jasmonato y etileno. Adems, se muestra que similar a la
reguladora NPR1 juega un papel crucial en la expresin de ISR.

nos demuestran
Arabidopsis sigue
respuesta tanto a
RAE, la protena

RESULTADOS
Las rizobacterias mediada ISR Requiere Componentes del jasmonato y Respuesta a
Etileno
Para investigar si jasmonato y / o etileno juegan un papel en ISR rizobacterias
mediada, hemos probado la mutante respuesta jasmonato jar1 y el mutante
respuesta de etileno etr1 por su capacidad para desarrollar resistencia inducida
biolgicamente contra la infeccin por P. s. tomate. Columbia (Col-0) plantas
silvestres,
plantas
NahG
SA-nonaccumulating
transgnicos
y
mutantes jar1 yETR1 plantas fueron cultivadas en suelo que contiene ISR
inductores P.fluorescens bacterias WCS417r. Otro subconjunto de las plantas
recibieron tratamiento SAR mediante la inoculacin de tres hojas inferiores con el
patgeno no virulenta P. s. tomate llevar AvrRpt2 ( Whalen et al., 1991 ) 3 das
antes de la inoculacin desafo con una cepa virulenta de P. s. tomate. Las plantas
de control no recibieron tratamiento antes de la exposicin. Figura 1 muestra que
en los de tipo salvaje Col-0 plantas, la colonizacin de las races
por P. fluorescensWCS417r
y
la
infeccin
de
predisposicin
con P. s. tomate llevar AvrRpt2 result en una reduccin significativa de los
sntomas 4 das despus de la inoculacin desafo con P. s. tomate. Por otra parte,
en plantas Col-0 pretratados con avirulent P. s. de tomate o P. fluorescens WCS417r,
el crecimiento del patgeno difcil fue inhibida ( Tabla 1 ), lo que indica
que P. fluorescens ISR WCS417r mediada e inducida por patgenos SAR se
desencadena en estas plantas.
La Figura 1 y la Tabla 1 muestran que SA-nonaccumulating plantas NahG montados
resistencia contra P. s. tomate infeccin despus de P. fluorescenstratamiento
WCS417r pero no despus preinfeccin con el patgeno no virulenta.Adems, slo
las plantas que expresan de forma concomitante SAR mostraron acumulacin
de PR-1 transcripciones ( Figura 1 ), mientras que las plantas que expresan ISR no lo
hizo, lo que confirma que ISR y SAR son controlados por distintas vas de
sealizacin que divergen en su requisito de SA. Ambos jar1 yETR1 plantas
desarrollaron SAR despus preinoculacin con el avirulent P. s.tomate cepa y mostr
activacin de PR-1 la expresin gnica ( Figura 1 ), apoyando conclusiones

anteriores (Lawton et al., 1995 , 1996 ) que la transduccin de la seal SAR en

Arabidopsis no requiere componentes de la respuesta jasmonato o etileno. Sin
embargo, ni jar1 ni ETR1 plantas desarrollaron ISR cuando las races fueron
colonizados por P. fluorescens WCS417r, lo que indica que se requiere una
respuesta intacta tanto jasmonato y etileno para el desarrollo de ISR rizobacterias
mediada. Evidentemente, ambos de la jasmonato de fitohormonas y etileno juegan
un papel crucial en la va de sealizacin SA ISR pero no lo hace.

Figura 1.
La cuantificacin de ISR y SAR contra P. s. tomate Infeccin en Arabidopsis Col-0,
NahG,jar1 , etr1 y npr1 Plantas y Anlisis de la PR-1 de la Expresin Gnica.
Se muestra en la parte superior es el ndice de enfermedades de las plantas de
control (Ctrl) y las plantas que recibieron un ISR o tratamiento SAR. El ndice de
enfermedad es la media ( n = 20) de las plantas el porcentaje de hojas con
sntomas en relacin con las plantas de control (100%) 4 das despus de la
inoculacin reto con el patgeno virulento P. s. tomate.Las proporciones absolutas
de hojas enfermas del control tratados con Col-0, NahG, jar1 , ETR1 , y npr1 plantas
eran 60,1, 82,9, 80,6, 60,2, y 68,0%, respectivamente. Dentro de cada marco, letras
diferentes indican diferencias estadsticamente significativas entre los tratamientos
(prueba LSD de Fisher; = 0,05). Las plantas tratadas con inductor de bacterias ISR
fueron cultivadas en suelo que contiene P.fluorescens WCS417r. SAR se indujo 3
das antes de la inoculacin desafo infiltrando tres hojas por planta con el patgeno
no virulenta P.s. tomate llevar AvrRpt2. A continuacin se muestran geles de
agarosa teidos con bromuro de etidio con productos de la competencia RT-PCR
obtenidos despus de la amplificacin de partes iguales de la primera cadena de
ADNc y 500 pg de ADN competidor heterloga (comp. ADN) mediante el uso de la
PR-1 cebadores especfico de .Primera lnea de cDNA se sintetiz en el ARNm que
fue aislado de las hojas de las combinaciones de plantas y tratamiento indicado que
fueron cosechados antes de la inoculacin desafo. Los datos mostrados se toman
de experimentos representativos que se repitieron al menos dos veces con
resultados similares.
Las rizobacterias mediada ISR depende NPR1
NPR1 ha demostrado ser un factor regulador importante en la respuesta
dependiente de SA-SAR ( Cao et al., 1994 ). Para investigar si NPR1 est implicado
en la respuesta ISR SA-independiente, as, hemos probado el mutante de
Arabidopsis npr1 . Figura 1 y Tabla 1 muestran que NPR1 plantas no desarrollaron
SAR y no muestran PR-1 despus de la activacin de genes que predisponen la
infeccin con el avirulent P. s. tomate cepa, lo que confirma que la respuesta SAR se
bloque eficazmente en estas plantas. Sorprendentemente, npr1 plantas tambin
fueron afectados en la expresin de P. fluorescens ISR WCS417r mediada, lo que
indica que ambos tipos de resistencia a la enfermedad inducida biolgicamente
dependen de NPR1.

La colonizacin de la rizosfera por P. fluorescens WCS417r

Para investigar si la incapacidad para expresar ISR en los mutantes fue causada por
la colonizacin insuficiente de la rizosfera por P. fluorescens WCS417r, se determin
el nmero de resistente a la rifampicina P. fluorescens bacterias WCS417r por
gramo de peso fresco de raz al final de cada bioensayo. Tabla 2muestra
que P. fluorescens WCS417r
coloniza
la
rizosfera
de
Col-0,
NahG, jar1 ,etr1 y npr1 plantas con la misma eficacia. Por lo tanto, la prdida de la
capacidad
de
expresar P. fluorescens ISR
en
WCS417r
mediada jar1 , etr1 y npr1 plantas no es causado por cambios en la colonizacin de
la raz bacteriana sino que debe ser el resultado de alteraciones en las propiedades
de los mutantes.

Secuencia de eventos de sealizacin

Respuesta ISR Para dilucidar la secuencia de los eventos de sealizacin implicadas
en la jasmonate-, etileno, y NPR1-dependiente, hemos probado la capacidad de
induccin de la resistencia de MeJA y 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC), el
precursor natural de etileno , en Col-0, NahG, jar1 , etr1 ynpr1 plantas. Figura
2A muestra que aplican ACC se convierten fcilmente en etileno por actividad de la
ACC oxidasa endgena. H 2 O- y plantas tratadas con MeJA mostraron niveles
basales de produccin de etileno, mientras que en las plantas tratadas-ACC, un
aumento de 10 a 25 veces en etileno se observa la produccin ( Figura 2B ). Como
se muestra en la Figura 2C , el pretratamiento de Col-0 plantas con MeJA o ACC
dado lugar a una reduccin del 50% de los sntomas causados
por P. s. tomate infeccin. Tabla 3 muestra que el crecimiento de P. s. tomate se
inhibi tambin, lo que indica que la reduccin observada de los sntomas es
causada por la activacin de una respuesta de resistencia.
Aplicacin de MeJA o ACC a las plantas NahG tambin result en una reduccin de
los sntomas, aunque el nivel de proteccin fue algo menor que la observada en el
tipo salvaje Col-0 plantas. En jar1 plantas, aplicacin de MeJA no provoc una
respuesta de resistencia, que la aplicacin del ACC dio lugar a niveles de tipo
salvaje de proteccin. Mutant ETR1 plantas eran no sensibles al tratamiento ACC
sino tambin fallaron en responder a MeJA-tratamiento, lo que indica que
componentes de la respuesta de etileno acto aguas abajo del jasmonato en la va
de sealizacin que conduce a la proteccin contra P. s. tomate. En npr1 plantas,
capacidad de respuesta a MeJA o ACC estaba bloqueado y fuertemente reducido,
respectivamente, indicando que los componentes del jasmonato y etileno respuesta
acto aguas arriba de NPR1 en la regulacin de la expresin de la resistencia
inducida contra P. s. tomate.

La Figura 2.
Produccin de Etileno y plantas de Arabidopsis La cuantificacin de la proteccin
inducida en MeJA- y el CAC-Tratados.
(A) La produccin de etileno en hojas de Arabidopsis ecotipo Col-0 despus del
tratamiento de las hojas con diferentes concentraciones de ACC. Los puntos de
datos son medias (microlitros de etileno producido por gramo de peso fresco [FW]
de tejido de la hoja en el primero 24 h despus del tratamiento) con errores
estndar de tres muestras independientes que recibieron el mismo tratamiento.
(B) La produccin de etileno en hojas de Col-0, NahG, jar1 , etr1 y npr1plantas en
las primeras 24 horas despus del tratamiento con H 2 O, 100 mM MeJA o mM ACC
1. Las barras representan errores estndar de seis muestras independientes que
recibieron el mismo tratamiento.
(C) MeJA- y proteccin ACC-mediadas contra P. s. tomate en Col-0,
NahG, jar1 , ETR1 y npr1 plantas. Las plantas se trataron previamente con H 2 O,
100 mM MeJA, o 1 mM ACC 3 das antes de la inoculacin desafo
con P. s. tomate. Cuatro das despus de la inoculacin desafo, el ndice de
enfermedad se determin (vase la leyenda a la Figura 1 ). Las proporciones
absolutas de hojas enfermas del control tratados con Col-0, NahG, jar1 , ETR1 ,
y npr1 plantas eran 49,9, 78,2, 74,8, 61,0, y 70,0%, respectivamente. Dentro de
cada trama, letras diferentes indican diferencias estadsticamente significativas
entre los tratamientos (prueba de LSD de Fisher; n = 20; = 0,05).
ISR no est asociado con Jasmonate- y la activacin de genes-etileno Responsive
La participacin de los componentes de la respuesta jasmonato y etileno en ISR
mediada por rizobacterias sugiere que ISR podra estar asociado con procesos
jasmonate- y inducidos por el etileno. Para investigar si el tratamiento
con P.fluorescens WCS417r estimula jasmonate- conocida o respuestas de etilenoinducible, se estudi la expresin del gen de jasmonato inducible Atvsp , que
codifica una protena de almacenamiento vegetativo ( Berger et al., 1995 ), la
etileno-inducible Hel gen, que codifica una Hevein-like protena con actividad
antifngica ( Potter et al., 1993 y la jasmonate- de etileno-inducible de genes de
defensina de la planta), y PDF 1.2 (, que codifica una protena pequea con
actividad antifngica , 1996 Penninckx et al. ). Figura 3 muestra que la aplicacin de
MeJA o ACC a las hojas activan la expresin de la Atvsp o Hel gen, respectivamente,
lo que demuestra que tanto MeJA y ACC activan su va de respuesta
correspondiente especficamente. Como era de esperar, tanto MeJA y ACC
inducidos PDF 1.2 acumulacin de transcripcin en las hojas. Sin embargo, en races
y hojas de P. fluorescens plantas inducidas WCS417r, sin aumento deAtvsp , Hel ,
o PDF 1.2 niveles de transcripcin fue detectado, lo que indica que la expresin
de P. fluorescens mediada por WCS417r ISR no coincide con una fuerte estimulacin
de la respuesta jasmonato y etileno.
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DISCUSIN
Hemos demostrado previamente que las plantas que expresan patgenos inducida
SAR o rizobacterias mediada ISR contra P. s. tomate infeccin desarrollar
significativamente menos sntomas en comparacin con las plantas noninduced y
muestran una fuerte inhibicin del crecimiento de patgenos en las hojas (Pieterse

et al., 1996 ; van Wees et al., 1997 ). A pesar de estas semejanzas fenotpicas, las
vas de sealizacin que conducen a las dos respuestas de resistencia inducida
biolgicamente divergen en sus requisitos para SA. Por otra parte, la expresin de
SAR est acompaada por la activacin de PR genes, mientras que esta respuesta
es deficiente durante la expresin de ISR ( Pieterse et al., 1996 ). En este estudio,
hemos utilizado mutantes de Arabidopsis bien caracterizados en nuestro intento de
dilucidar los pasos implicados en la va de sealizacin SA-independiente control de
rizobacterias mediada ISR. Resistencia sistmica inducida por rizobacterias no
patgeno fue bloqueada en los mutantes de Arabidopsis jar1 , etr1 , y npr1 ( Figura
1 y Tabla 1 ), lo que indica que los componentes de la respuesta jasmonato y
etileno, as como NPR1 juegan un papel crucial en la va de sealizacin ISR. De
acuerdo con nuestras observaciones, Lawton et al. ( 1995 , 1996 ) anteriormente
demostraron que ambos jar1 y etr1 no se vean afectados en su capacidad para
desarrollar SAR. As, el ISR rizobacterias mediada y SAR vas de sealizacin
inducida por patgenos divergen en sus requisitos para SA, por un lado, y por
jasmonato y etileno, por otro lado.
Varias lneas de evidencia indican que la proteccin MeJA- y el CAC-inducida
contra P. s. tomate siguen la misma va de sealizacin como P. fluorescens ISR
WCS417r mediada. En primer lugar, P. fluorescens WCS417r, MeJA, y el CAC de
induccin de resistencia frente P. s. tomate en plantas NahG (Figuras 1 y 2C ),
indicando que estos agentes activan un mecanismo de resistencia SAindependiente. Esto es apoyado por el hecho de que P. fluorescens WCS417r-, MeJAy tratados con ACC plantas no muestran un aumento en SA-inducible PR-1la
expresin de genes ( Figura 3 ). El nivel de proteccin en las plantas NahG despus
de la induccin por estos agentes se compar inferior con la observada en los de
tipo salvaje Col-0 plantas. Esto puede ser debido al hecho de que las plantas NahG
son ms susceptibles a la infeccin por patgenos ( Delaney et al., 1994 ;
Figuras 1 y 2 , y Tabla1 ), resultando en una menor eficacia de los agentes
inductores de ISR. Sin embargo, un papel modulador de SA en la respuesta ISR no
puede
ser
descartada. La
segunda
lnea
de
evidencia
que
indica
que P. fluorescensWCS417r, MeJA, y el CAC a desencadenar la misma va de
sealizacin que controla la resistencia inducida contra P. s. tomate es la
observacin de que la resistencia inducida por estos tres agentes requiere
capacidad de respuesta a etileno y depende de NPR1 que se expresa
plenamente. Todos juntos, esto sugiere fuertemente que la resistencia inducida
por P. fluorescens WCS417r, MeJA, o ACC se alcanza mediante la activacin de la
misma va de defensa.

Figura 3.
Expresin de Jasmonate-, etileno-y Genes SA-inducible en respuesta
a P. fluorescensWCS417r, MeJA, CAC, SA y Tratamiento.

Los resultados del anlisis de transferencia de gel de ARN de Atvsp , Hel , PDF 1.2 ,
yPR-1 se muestran la expresin gnica. Races y hojas de las plantas que se
cultivaron en suelo suplementado con 10 mM MgSO 4 (Ctrl)
o P. fluorescens bacterias WCS417r (WCS417r) fueron cosechadas cuando las
plantas fueron 5 semanas de edad. Los tratamientos qumicos se realizaron por
inmersin de las hojas de plantas de 5 semanas de edad en una solucin que
contiene 0,01% (v / v) Silwet L-77 y MeJA (100 mM), ACC (1 mM), o SA (5 mM). Hojas
de control se trataron con 0,01% (v / v) Silwet L-77 solamente. Hojas tratadas
qumicamente se recogieron 2 das despus de la aplicacin de los productos
qumicos. Arabidopsis Atvsp , Hel , PDF 1.2 , y la PR-1 sondas de genes especficos
se utilizaron para hibridaciones de transferencia de gel de ARN.
Usando MeJA y ACC como agentes inductores, se determin la secuencia de eventos
de sealizacin implicadas en la va que conduce a la resistencia contraP. s. .
tomate Figura 2C muestra claramente que la proteccin mediada por MeJA
contra P. s. tomate requiere una respuesta intacta al etileno, mientras que el CAC
est completamente activo en jar1 plantas. Por lo tanto, componentes de la
respuesta de etileno actan aguas abajo de jasmonato. Por otra parte, MeJA- y la
proteccin inducida por el CAC se bloquean o muy disminuidos en npr1 plantas, lo
que indica que NPR1 acta aguas abajo del jasmonato y etileno en la va de
sealizacin que conduce a la resistencia contra P. s. tomate. Por lo tanto,
postulamos
que
durante
la
transduccin
de
seales
que
conduce
a P. fluorescensmediada WCS417r ISR, las respuestas jasmonato y etileno participan
sucesivamente para desencadenar una respuesta de defensa que est regulada por
NPR1 ( Figura 4 ).
La observacin de que la proteccin mediada por ACC no se bloque
completamente en npr1 plantas ( Figura 2C ) sugiere la existencia de una va de
defensa de etileno-inducible paralelo que no requiere NPR1. Una va candidato
podra ser la va de etileno-inducible que conduce a PDF 1.2 la expresin de genes
que se ha demostrado ser NPR1 independiente ( Penninckx et al.,
1996 ).Alternativamente, este bajo nivel de proteccin en npr1 plantas puede ser
causada por la doble mayor produccin de etileno despus de ACC tratamiento
( Figura 2B). Sin embargo, parece poco probable que esta ltima posibilidad porque
un aumento del doble de la produccin de etileno en los de tipo salvaje Col-0
plantas, aplicando mM ACC 2.5 a las hojas en vez de 1 mM, no se traduce en un
mayor nivel de proteccin contra P. s. tomate infeccin (SCM van Wees, resultados
no publicados). En s misma, la mejora del nivel de produccin de etileno en
tratados-ACC npr1 plantas es intrigante porque demuestra que npr1 plantas
muestran dos veces mayor actividad de la ACC oxidasa que hacer plantas de tipo
silvestre. Curiosamente, la infeccin por patgenos tambin causa un aumento
significativamente mayor en la produccin de etileno en npr1 plantas (CMJ Pieterse,
resultados no publicados), lo que sugiere que no slo SA de respuesta sino tambin
el metabolismo de etileno se ve alterada por la npr1 mutacin.
Obtencin
de
un
semejante
va
de
defensa
SA-independiente
contra P. s. tomateinfeccin por P. fluorescens WCS417r, MeJA, y ACC implica que
ISR se asocia con un aumento en la produccin de jasmonato o etileno. Sin
embargo, P. fluorescensmediada por WCS417r ISR no coincide con la expresin de
genes jasmonate- y de etileno-sensible ( Figura 3 ), lo que sugiere que la produccin
de jasmonato y etileno no est fuertemente estimulada. Cuando las plantas se
trataron con concentraciones ms bajas de MeJA o ACC (25 mM y 0,25 mM en lugar
de 100 mM y 1 mM, respectivamente), que claramente desarrollaron una mayor
proteccin contra P. s. tomate , sin activar Atvsp , Hel , o PDF 1.2 la expresin
gnica (SCM van Wees, resultados no publicados). Por lo tanto, P. fluorescens ISR

mediada por WCS417r puede implicar una estimulacin moderada o localizada de la

respuesta jasmonato y etileno que est por debajo del nivel de umbral necesaria
para Atvsp ,Hel , y PDF 1.2 activacin de genes. Sin embargo, no se puede
descartar que simplemente la disponibilidad de jasmonato y de sealizacin de
etileno intermedios es suficiente para facilitar la induccin de la
ISR. Recientemente, Schweizer et al. ( 1997 ) demostraron que durante la infeccin
de arroz con el hongo patgeno Magnaporthe grisea , genes-jasmonato inducible se
activan sin un aumento en los niveles endgenos de jasmonato. Por otra parte, Tsai
et al. (1996 ) proporcionan evidencia de que un aumento en la sensibilidad de
etileno en lugar de la produccin de etileno es el evento inicial para desencadenar
la senescencia jasmonato mejorada en hojas de arroz independientes. Por lo tanto,
respuestas de las plantas de etileno-y jasmonato dependientes se pueden activar
sin un aumento concomitante en los niveles de estas fitohormonas. Ya sea mayor
sensibilidad a cualquiera de jasmonato o etileno juega un papel en rizobacterias
mediada ISR necesita ser dilucidado.

La Figura 4.
Modelo propuesto para el mediado por rizobacterias no patgenas ISR va de
sealizacin como parte de la Red de vas de control biolgico inducido Resistencia
Sistmica.
P. fluorescens bacterias WCS417r desencadenan una va SA-independiente en el
que los componentes de la jasmonato (JA) y actuar respuesta de etileno en
secuencia para activar una respuesta de resistencia sistmica que es dependiente
de la protena reguladora NPR1. Las acciones de la va de sealizacin ISR eventos
que se inician en la infeccin por patgenos, pero no es asociada con PR o PDF
1.2 la expresin gnica. Esto indica que P. fluorescens bacterias WCS417r
desencadenan una va novedosa de sealizacin y que la resistencia inducida por
estos rizobacterias no patgeno implica la produccin de compuestos defensivos
hasta ahora no identificados que son activos contra P. s. tomate. La va de control
de NPR1 dependiente de PRexpresin gnica y la va de NPR1-independiente que
lleva a PDF 1.2expresin gnica estn de acuerdo con Ryals et al. ( 1996 ) y
Penninckx et al. ( 1996 ), respectivamente.
Activacin sistmica inducida por patgenos del gen defensina planta
Arabidopsis PDF 1.2 es independiente de SA y requiere componentes tanto de la
jasmonate- y las vas de etileno-respuesta ( Penninckx et al., 1996 ). Por lo tanto,
esta reaccin de defensa parece compartir eventos de sealizacin especficos
con P. fluorescens ISR WCS417r mediada. Sin embargo, este ltimo no est
asociado con un aumento en PDF 1.2 niveles de transcripcin ( Figura 3 ).Adems,
la transduccin de seales que conduce a PDF 1.2 se inform de la activacin de

genes para ser independiente de NPR1 ( Penninckx et al., 1996 ), mientras

que P. fluorescens WCS417r mediada ISR requiere NPR1 ( Figura 1 ). Por lo tanto, las
vas
de
sealizacin
correspondientes
deben
ser
diferentes
( Figura
4). Recientemente, el anlisis de la transduccin de la seal SAR
mutante cpr5revel que las vas de sealizacin que controlan NPR1 dependiente
de SAR y NPR1 independiente de PDF 1.2 la expresin del gen estn conectados en
los pasos y la rama de principios de transduccin de seales aguas arriba de SA
(Bowling et al., 1997 ). Aqu, mostramos que la va ISR est conectado con el de la
RAE tambin en que ambos requieren NPR1. Al parecer, las respuestas de
resistencia sistmicos biolgicamente inducidos en plantas estn conectadas a
travs de una compleja red de vas de sealizacin que implican que no slo SA,
sino tambin la accin concertada de jasmonato y etileno ( Figura 4 ).
Mutant npr1 se aisl originalmente en una pantalla para mutantes SAR que estn
bloqueados en la ruta de respuesta que conduce de SA a PR activacin de genes
(Cao et al., 1994 ). Aunque ISR es independiente de la acumulacin de SA y no est
asociada con PR activacin de genes, esta respuesta de resistencia se bloquea en el
mutante npr1 tambin. Por lo tanto, NPR1 no slo se requiere para la expresin
dependiente de SA- PR genes que se activan durante SAR sino tambin para el
jasmonate- y la activacin de etileno-dependiente de las respuestas de defensa
hasta ahora no identificados que estn involucrados en ISR mediada por
rizobacterias. Por lo tanto, NPR1 diferencialmente regula la expresin de genes de
defensa, dependiendo de la va de sealizacin que se activa aguas arriba de la
misma. Las investigaciones futuras deberan revelar las bases moleculares de este
fenmeno.

MTODOS
Los cultivos bacterianos
Resistencia sistmica inducida (ISR) -inducing Pseudomonas fluorescensbacterias
WCS417r ( van Peer et al., 1991 ) se cultivaron en placas de medio de agar King B
( King et al., 1954 ) durante 24 horas a 28 C. Se recogieron las clulas
bacterianas, se resuspendieron en 10 mM MgSO 4 , y se ajustaron a una
concentracin de 10 9 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml (OD 600 = 1,0)
antes de la mezcla a travs del suelo.
El patgeno no virulenta P. syringae pv tomate DC3000 que lleva un plsmido con el
gen de avirulencia AvrRpt2 ( Whalen et al., 1991 ) se utiliz para la induccin de
resistencia sistmica adquirida (SAR). Las bacterias se cultivaron durante la noche a
28 C en King de medio lquido B ( King et al., 1954 ) suplementado con 20 mg / L
de tetraciclina para seleccionar para el plsmido. Las clulas bacterianas se
recogieron por centrifugacin, se resuspendieron en 10 mM MgSO 4 , y se ajustaron
a una concentracin de 10 7 ufc / ml antes de la infiltracin de presin en las hojas.
El
patgeno
virulento P. s. tomate DC3000
sin
el
plsmido
que
lleva AvrRpt2 (Whalen et al., 1991 ) se utiliz para inoculaciones de
desafo. P. s. tomatebacterias se cultivaron durante la noche en el Rey del medio
lquido B a 28 C.Despus de la centrifugacin, las clulas bacterianas se
resuspendieron a una concentracin final de 2,5 10 7 ufc / ml en 10 mM
MgSO 4 que contiene 0,01% (v / v) del tensioactivo Silwet L-77 (van Meeuwen
Chemicals BV, Weesp, Holanda) .

Cultivo de Plantas
Las semillas de tipo salvaje de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia (Col-0)
plantas, las plantas transgnicas que albergan el NahG bacteriana nahG gen
(Delaney et al., 1994 ), y mutante jar1 ( Staswick et al., 1992 ), etr1 ( Bleecker et
al ., 1988 ), y npr1 plantas ( Cao et al., 1994 ) se sembraron en arena de
cuarzo.Plntulas de dos semanas de edad se transfirieron a 60 ml macetas que
contenan una mezcla de arena y tierra para macetas que haba sido tratado en
autoclave dos veces durante 1 hr. Las plantas se cultivaron en una cmara de
crecimiento con un da 9-hr (200 E m -2 seg -1 a 24 C) y 15-hr noche (20 C) ciclo
y 70% de humedad relativa. Las plantas se regaron en das alternos y una vez a la
semana se suministran con solucin nutritiva de fuerza media modificada de
Hoagland (2 mM KNO 3 , 5 mM Ca [No 3 ] 2 , 1 mM KH 2 PO 4 , 1 mM
MgSO 4 elementos, y trazas , pH 7; Hoagland y Arnon, 1938 ) que contiene 10 mM
Sequestreen (Novartis, Basilea, Suiza).
Tratamientos de induccin
Las plantas se trataron con rizobacterias no patgenas,-ISR inducir mediante la
mezcla de una suspensin de P. fluorescens bacterias WCS417r todo el suelo a una
densidad final de 5 10 7 ufc / kg justo antes de se plantaron las plantas de
semillero tal como se describe por Pieterse et al. ( 1996 ).
SAR se indujo 3 das antes de la inoculacin desafo infiltrando tres hojas inferiores
por planta con el patgeno no virulenta presin P. s. tomate llevarAvrRpt2 a 10 7 ufc
/ ml en 10 mM MgSO 4 mediante el uso de una jeringa de 1 ml sin aguja, tal como
se describe por Swanson et al. ( 1988 ).
Los tratamientos qumicos se realizaron 3 das antes de la inoculacin desafo por
inmersin de las hojas de plantas de 5 semanas de edad en una solucin que
contiene 0,01% (v / v) Silwet L-77 y, o bien jasmonato de metilo (MeJA; 100 mM),
cido saliclico (SA ; 5 mM), o 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC; 0,25, 0,5,
1,0, 2,5, o 5,0 mM), pH 6. Las plantas de control fueron tratadas con 0,01% (v / v)
Silwet L-77 solamente. MeJA se adquiri de Serva, Brunschwig Chemie (Amsterdam,
Pases Bajos), ACC de Sigma-Aldrich Chemie BV (Zwijndrecht, Pases Bajos), y SA de
Malinckrodt de Baker BV (Deventer, Pases Bajos).
Desafo Inoculacin y Evaluacin de Enfermedades
Inoculaciones reto se realizaron por inmersin de las hojas de plantas de 5 semanas
de edad en una suspensin bacteriana de la patgeno virulento P. s.tomate a 2,5
10 7 ufc / ml en 10 mM MgSO 4 , 0,01% (v / v) Silwet L-77. Cuatro das despus del
desafo, gravedad de la enfermedad se evalu mediante la determinacin del
porcentaje de hojas con sntomas por planta (20 plantas por tratamiento) y
examinando el crecimiento del patgeno desafiante en hojas. Las hojas se anot
como enferma al mostrar lesiones necrticas o empapadas de agua rodeadas de
clorosis. El nmero de P. s. tomate bacterias en las hojas inoculadas se evalu en
tres series de 20 hojas seleccionadas al azar por tratamiento. Las hojas se pesaron,
enjuagados en agua estril, y homogeneizados en 10 mM MgSO 4 . Posteriormente,
diluciones apropiadas se extendieron sobre agar de medio B de King suplementado
con 50 mg / L de rifampicina y 100 mg / L cicloheximida. Despus de un tiempo de
incubacin de 48 horas a 28 C, se determin el nmero de unidades formadoras
de colonias resistentes a rifampicina por gramo de tejido de hoja infectada.

Rizosfera Colonizacin
La colonizacin de la rizosfera de tipo salvaje, transgnicos, y plantas mutantes por
resistente a la rifampicina P. fluorescens bacterias WCS417r se examin al final de
cada bioensayo. En duplicado, races de seis plantas por tratamiento se recogieron,
se pesaron, y se agitaron vigorosamente durante 1 min en 5 ml de 10 mM
MgSO 4 que contiene 0,5 g de perlas de vidrio (0,17 mm de dimetro).Diluciones
apropiadas se extendieron sobre agar de medio B de King suplementado con
cicloheximida (100 mg / L), ampicilina (50 mg / L), cloranfenicol (13 mg / L), y
rifampicina (150 mg / L), que es selectivo para rifampicina resistente,
fluorescente Pseudomonas spp ( Geels y Schippers, 1983 ).Despus de la
incubacin durante la noche a 28 C, se determin el nmero de unidades
formadoras de colonias resistentes a rifampicina por gramo de peso fresco de raz.
Reaccin inversa competitiva en cadena de la polimerasa
Anlisis de PR-1 la expresin de genes se realiz utilizando la reaccin en cadena
inversa competitiva transcriptasa-polimerasa (RT-PCR) como se describe por Siebert
y
Larrick
( 1992 ). Un PR-1 par
de
cebadores
especfico
de
(5'GTAGGTGCTCTTGTTCTTCC-3 'y 5' TTCACATAATTCCCACGAGG-3 '), produciendo
productos de RT-PCR de 422 pb, fue elaborado con base en la Arabidopsis PR1secuencia de ADNc descrito por Uknes et al. ( 1992 ). Un fragmento de ADN
competidor heterlogo 900-bp, que compiten por el mismo conjunto de cebadores,
se obtuvo segn lo descrito por Siebert y Larrick ( 1992 ). Cincuenta nanogramos de
poli (A) + ARN, aislado a partir de hojas congeladas, se convierten en la primera
cadena de ADNc. Posteriormente, porciones iguales de cDNA se amplificaron en
presencia de 500 pg de ADN competitivo mediante el uso de laPR-1 par de
cebadores especfico de. Los productos se resolvieron a continuacin en un gel de
agarosa teido con bromuro de etidio.
Etileno Medicin
Treinta minutos despus de la aplicacin de los productos qumicos, las hojas se
separaron, se pesaron y se colocaron en frascos de suero hermticos a los gases de
25 ml que posteriormente se incubaron durante 24 h bajo condiciones de la cmara
climtica. La acumulacin de etileno se midi por cromatografa de gases como se
describe por De Laat y Van Loon ( 1982 ).
Anlisis de transferencia de RNA Gel
ARN total fue extrado de races y hojas de control de 5 semanas de edad y las
plantas que expresan ISR y de las hojas recogido 2 das despus de la aplicacin
qumica, utilizando el mtodo de extraccin de RNA-hidrocloruro de guanidina como
se describe por Logemann et al. ( 1987 ). Para el anlisis de transferencia de gel de
ARN, 15 g de RNA total se separ por electroforesis en geles desnaturalizantes de
formaldehdo de agarosa y se transfirieron a Hybond-N +membranas (Amersham, 'sHertogenbosch, Pases Bajos) mediante transferencia capilar, segn lo descrito por
Sambrook et al. ( 1989 ). Transferencias en gel de ARN se hibridaron y se lavaron
como se ha descrito previamente ( Pieterse et al., 1994 ) y se expusieron a una
pelcula AR Kodak X-OMAT. Las sondas de ADN fueron marcadas con - 32 P-dCTP
mediante el etiquetado del cebador aleatorio (Feinberg y Vogelstein, 1983 ). Sondas
para la deteccin de Atvsp y Heltranscripciones se prepararon mediante PCR con
cebadores basados en secuencias obtenidas a partir de los nmeros de acceso de
GenBank Z18377 yU01880 , respectivamente. Las sondas para PDF 1.2 y PR-1 se

derivan de un Arabidopsis PDF 1.2 y un PR-1 clon de ADNc, respectivamente

( Uknes et al., 1992 ; Penninckx et al., 1996 ).