TEMA 8: PRODUCCIN INDUSTRIAL DE METABOLITOS

SECUNDARIOS
Dr. Pedro F. Mateos
I. METABOLITOS SECUNDARIOS
DE INTERES INDUSTRIAL

conservacin
microorganismos.

Los metabolitos secundarios son

molculas
sintetizadas
por
determinados microorganismos,
normalmente en una fase tarda de su
ciclo de crecimiento, cuyas
caractersticas son:

De todos los productos tradicionales

obtenidos por fermentacin, los ms
importantes para la salud humana son
los metabolitos secundarios. Donde se
incluyen, adems de los antibiticos,
ciertas toxinas (micotoxinas),
alcaloides (cido lisrgico), factores de
crecimiento vegetal (giberelinas) y
pigmentos.

(i) No son necesarios para el

crecimiento del microorganismo que
los produce. En estado natural, sus
funciones se hallan ordenadas a la
supervivencia de la especie, pero
cuando los microorganismos que los
producen se desarrollan en cultivo puro
los metabolitos secundarios no
desempean esa misin.
(ii) Generalmente se producen como
mezclas de productos muy
relacionados qumicamente entre s.
Por ejemplo, una nica cepa de una
especie del gnero S t r e p t o m y c e s
produce 32 antraciclinas diferentes.

de

estos

Los metabolitos secundarios mejor

conocidos son los antibiticos, de los
que se han descubierto ms de 5000,
cifra que aumenta a razn de una
media aproximada de 300 por ao,
aunque la mayora carecen de utilidad
pues son txicos para los organismos
vivos. Aproximadamente el 75% de los
antibiticos conocidos son producidos
por actinomicetos. Algunas especies
son excepcionales productores de
antibiticos, por ejemplo Streptomyces
g r y s e u s produce al menos 40
antibiticos diferentes.
II. RELACIONES ENTRE
TROFOFASE - IDIOFASE

Diferentes tipos de tetraciclinas

(iii) Cada uno de estos productos es

producido por un grupo muy reducido
de organismos.
(iv) La produccin puede perderse
fcilmente por mutacin espontnea
(degeneracin de la raza), por lo que
son muy importantes las tcnicas de

En el metabolismo secundario las fases

de crecimiento se denominan trofofase,
fase de crecimiento logartmico donde
normalmente no se producen los
metabolitos secundarios, e idiofase,
fase estacionaria donde normalmente
se producen los metabolitos
secundarios. Aunque es una
simplificacin pensar slo en dos
fases, esta simplificacin nos permite
comprender mejor la fermentaccin
industrial de los metabolitos
secundarios. Es decir, si nosotros
34

queremos producir un metabolito

secundario primero debemos asegurar
las condiciones apropiadas durante la
trofofase para un buen crecimiento y
despus, debemos alterar esas
condiciones en el momento adecuado
para asegurar una excelente produccin
del metabolito secundario.

Relacin entre trofofase e idiofase

Este retraso en la formacin de

metabolitos secundarios es uno de los
principales mecanismos mediante el
cual los microorganismos productores
de antibiticos evitan el suicidio,
puesto que al comienzo de la fase
logartmica de crecimiento son
sensibles a su propio antibitico, para
posteriormente, durante la idiofase,
volverse resistentes al antibitico que
estn produciendo.
Los factores que ponen en marcha la
produccin de metabolitos secundarios
al final de la trofofase no se conocen;
nicamente se sabe que este
mecanismo se dispara normalmente
cuando algn nutriente del medio se ha
agotado. En algunas ocasiones el
nutriente responsable es una fuente de
Carbono, en otras, sin embargo es el
Nitrgeno o el Fsforo. La explicacin

puede ser que al faltar nutrientes se

alteren los metabolitos primarios y se
originen inductores de los enzimas
encargados de la sntesis de los
metabolitos secundarios. Otra
explicacin puede ser que al faltar la
fuente de Carbono cesa la represin
por catabolito, sintetizndose a partir
de este momento los enzimas
necesarios para la biosntesis de estos
metabolitos secundarios.
Cualquiera que sea el mecanismo
general por el que se dispara el
metabolismo secundario al final de la
trofofase, es un hecho que en este
punto hay unos cambios muy fuertes
en la composicin enzimtica de las
clulas, apareciendo los enzimas que
estn especficamente relacionados con
la formacin de metabolitos
secundarios. Sin embargo, e
independientemente de este aspecto
general del metabolismo secundario, se
ha puesto de manifiesto la existencia
de sistemas de regulacin que juegan
un papel importante en la sntesis de
determinados productos industriales.
III. EFECTO DE LOS
PRECURSORES
Las manipulaciones, tanto del medio
de cultivo como de las condiciones
ambientales que se llevan a cabo
durante el screening secundario de una
forma sistemtica, incluyen la adicin
de centenares de aditivos en los medios
de cultivo que puedan actuar como
posibles precursores del producto que
estamos investigando. Ocasionalmente
se encuentra un precursor que
incrementa de forma notable la
produccin de este metabolito
secundario. El precursor puede incluso
dirigir la sntesis de un determinado
producto de entre varios que se
producan anteriormente; es lo que se
conoce como biosntesis dirigida.
35

Como ejemplos de precursores estn el

cido fenilactico en el caso de la
produccin de bencil penicilina;
determinados aminocidos especficos
en la produccin de actinomicinas y
tirociclinas; cidos benzoicos
sustituidos en la formacin de
novobiocinas.

productor. Precisamente, estudiando

estos efectos se puso de manifiesto que
los mecanismos reguladores de los
microorganismos ejercen un efecto
notable en la produccin de los
metabolitos secundarios.
IV. INDUCCION ENZIMATICA
A lo largo de los estudios sobre el
papel que el triptfano juega como
estimulador de la biosntesis de
alcaloides por Claviceps (Cornezuelo
del centeno) se puso de manifiesto que
la induccin enzimtica juega un papel
importante en la produccin de
metabolitos secundarios.
Si bien el triptfano es un precursor en
la biosntesis de estos alcaloides, no es
un factor limitante; ya que su efecto
estimulador se debe en gran parte a la
induccin de la sntesis de los enzimas
que dan lugar a la sntesis de los
alcaloides. Existen tres razones que
han llevado a esta conclusin:
(i) Los anlogos del triptfano, que no
se incorporan a la molcula del
alcaloide, es decir, que no son
precursores, estimulan la produccin
de los alcaloides.

Precursores de metabolitos secundarios

En muchas fermentaciones, sin

embargo, los precursores no muestran
ninguna actividad. Esto es debido a
que su sntesis por el microorganismo
no es el factor limitante de la
produccin del metabolito secundario.
En estos casos, la adicin de aditivos
ha revelado efectos dramticos, tanto
estimuladores como inhibidores en la
produccin del metabolito secundario
por parte de una molcula no
precursora. Este efecto se debe
normalmente a la interaccin de estos
compuestos con los mecanismos
reguladores del microorganismo

(ii) El triptfano se debe aadir durante

la trofofase ya que si se aade durante
la idiofase tiene poco efecto.
(iii) El triptfano aadido es absorbido
por la clula durante la fase de
crecimiento y alcanza su mayor
concentracin intracelular justo antes
de la sntesis de los alcaloides.
Otro efecto de induccin similar es el
de la metionina en la biosntesis de
cefalosporina por Cephalosporium
a c r e m o n i u m . A pesar de que la
metionina provee azufre al antibitico,
la estimulacin de la formacin de
36

cefalosporina C se debe a un efecto de

induccin. Se lleg a esta conclusin
ya que la metionina debe aadirse
durante la trofofase; adems, la
metionina puede ser reemplazada por
su anlogo norleucina que no tiene
azufre en su molcula, por lo que su
efecto no puede ser debido al hecho de
aportar azufre.
La induccin tambin juega un papel
muy importante en determinar la
relacin entre los componentes de la
mezcla que se produce en una
fermentacin. Por ejemplo, en la
fermentacin para la produccin de
estreptomicina
se
produce
estreptomicina
y
mansido
estreptomicina. La conversin de
mansido estreptomicina en
estreptomicina se cataliza mediante el
enzima a -D-manosidasa que es
inducido por manano.

Inductores de metabolitos secundarios

V. REGULACION POR
RETROALIMENTACION
La regulacin por retroalimentacin
tambin parece jugar un papel
fundamental en el metabolismo
secundario. Por ejemplo, el
cloranfenicol al igual que la
cicloheximida, penicilina y otros
antibiticos limitan su propia
produccin
actuando
por
retroalimentacin generalmente sobre
el primer enzima de la ramificacin
que conduce a la sntesis de este
metabolito.
Otro caso de regulacin por
retroalimentacin sucede cuando la
ruta metablica ramificada, mediante
la cual se sintetiza el metabolito
secundario, conduce a su vez a la
sntesis de un metabolito primario,
como es el caso de la lisina y la
penicilina en P e n i c i l l i u m
chrysogenum. En un primer momento
se encontr que la L-lisina disminua la
produccin de penicilina, pero no se
saba porqu; hasta que se descubri
que el a -aminoadipato es un
intermediario en la biosntesis de los
dos, lisina y penicilina. La disminucin
en la formacin de penicilina por lisina
est causada por la inhibicin por
retroalimentacin de la homocitrato
sintasa, que es el primer enzima en la
biosntesis de lisina.
Otro camino mediante el cual acta la
regulacin por retroalimentacin en la
formacin de metabolitos secundarios
implica la inhibicin y la represin de
las fosfatasas por fosfato. Muchas
fermentaciones se inhiben por
ortofosfato (H3PO4) a concentraciones
(>10 mM) que no son inhibidoras para
el crecimiento. En algunos casos se
explica ya que los intermediarios de la
ruta metablica del producto que nos
interesa estn fosforilados, aunque el
37

producto final no lo est. Las

fosfatasas actuaran en estos
intermediarios.
Un ejemplo lo tenemos en la
biosntesis de estreptomicina donde
actan varias fosfatasas en la
formacin de estreptidina y en el
ltimo paso, desfosforilacin de la
estreptomicina fosfato, donde el
enzima que cataliza esta reaccin
tambin est inhibida por el fosfato
inorgnico.

Produccin de penicilina

Biosntesis de estreptomicina

VI. REGULACION CATABOLICA

La represin catablica fue observada
en la industria de antibiticos mucho
antes de que se conociera y se
entendiera el significado general de
este fenmeno. Durante el desarrollo
de la produccin de penicilina se
observ que la glucosa, que era una
magnfica fuente de carbono para el
crecimiento del microorganismo, era
un sustrato muy malo para la
produccin de penicilina; sin embargo,
se observ que la lactosa, que soporta
un crecimiento muy pobre, es un buen
sustrato para la produccin de
penicilina. Por lo tanto, el medio
clsico de Jarvis y Johnson lleva una
mezcla de glucosa y lactosa.

Los mecanismos moleculares de la

regulacin catablica se esclarecieron
en la dcada de los 70. Hoy sabemos
que la regulacin catablica est
mediada por el nivel intracelular de un
nucletido especial, el monofosfato
cclico de adenosina (AMPc), cuyo
nivel intracelular es inverso a la
concentracin de glucosa en el medio
de cultivo. Mientras existe glucosa en
el medio de cultivo el nivel intracelular
de AMPc es sumamente reducido,
debido a que la glucosa inhibe la
actividad adenilciclasa, enzima que
interviene en la sntesis de AMPc.
Cuando la glucosa del medio se agota,
la concentracin intracelular de AMPc
aumenta rpidamente. El AMPc
sintetizado forma un complejo con una
protena existente en la clula,
denominada "protena receptora de
AMPc". Este complejo de protena
receptora y AMPc acta sobre el gen
promotor al objeto de inducir la
sntesis de los enzimas necesarios para
la utilizacin de otras fuentes de
carbono distintas a la glucosa. La
glucosa inhibe gran cantidad de
metabolitos secundarios: cido
giberlico, cido lisrgico, penicilina,
38

cefalosporina,cloranfenicol, bacitracina
actinomicina.
La represin catablica tambin juega
un papel importante en la
determinacin de la concentracin
relativa de cada uno de los antibiticos
de una misma familia qumica que se
producen en una fermentacin. Este es
el caso de la produccin de
estreptomicina por S t r e p t o m y c e s
gryseus. Como ya hemos dicho, el
manano es el inductor de la
manosidasa que convierte la mansido
estreptomicina en estreptomicina; sin
embargo, este enzima no se sintetiza si
hay glucosa (>0,5%) en el medio
debido a la represin catablica. Slo
cuando la glucosa ha desaparecido se
produce el enzima que es inducido por
manano. En este caso la represin
catablica juega un papel fundamental
en el porcentaje de mansido
estreptomicina producido en esta
fermentacin.

difieren en que la cepa menos

productora tiene de 2 a 4 veces ms
ATP que la ms productora. En ambas
cepas la concentracin de ATP
aumenta en la trofofase y disminuye en
la idiofase, durante la produccin de
clortetraciclina.
VIII. INCREMENTO DE LA
PRODUCCION DE METABOLITOS
SECUNDARIOS
La mayora de los controles descritos
en este captulo se eliminan mediante
manipulacin ambiental o mediante la
obtencin de mutantes mal regulados.
1.- Manipulacin ambiental
Catabolito: eliminacin de la glucosa
del medio.
Induccin: adicin de manano al
medio.
Carga energtica: disminucin de
fosfato en el medio.

VII. REGULACION POR EL

ESTADO O CARGA ENERGETICA
La produccin de clortetraciclina se
reduce en gran cantidad cuando existe
fosfato inorgnico en el medio. En las
fermentaciones para la produccin de
clortetraciclina, la idiofase comienza
cuando se agota el fosfato en el medio.
Puesto que en la biosntesis de
clortetraciclina donde intervienen 72
intermediarios, ninguno de ellos
fosforilado, este efecto del fosfato no
se debe a la regulacin por
retroalimentacin de fosfatasas. Sin
embargo, es posible que esta
regulacin est mediada por la carga
energtica ya que el contenido en ATP
de dos cepas de S t r e p t o m y c e s
aureofaciens, una poco productora
(200 g/mL) y la otra muy productora
(2000 g/mL) de clortetraciclina,

Precursores: adicin de precursores al

medio.
2.- Seleccin de mutantes mal
regulados
A. Revertientes
La estrategia consiste primeramente en
seleccionar las mejores cepas
productoras del antibitico. Estas cepas
se someten a mutacin con un agente
mutgeno (UV, luz ultravioleta o NTG,
nitrosoguanidina). De los mutantes
obtenidos se seleccionan aquellos que
no sean productores del antibitico (se
seleccionan aquellas cepas que poseen
una protena inactiva). Estos mutantes
se vuelven a someter a mutacin y se
seleccionan aquellas cepas que sean de
nuevo productoras del antibitico (se
39

obtienen mutantes dobles desregulados

en un gen en el que acta esa protena
inactiva).

+ UV
NTG
++
C1---------->C1.1----------->C1.2

Revertientes superproductores

Mutasntesis

B. Resistencia a anlogos
La estrategia es la misma que la
descrita con los metabolitos primarios.
Aunque en este caso el metabolito
secundario debe compartir la ruta
biosinttica con un metabolito
primario.
_____ P1
/
P1
/
A------>B----\
\_____ P2
Mutantes superproductores resitentes a
anlogos

C. Mutasntesis
Se realiza mediante la mutacin en el
gen que codifica para un precursor del
antibitico natural, con lo que se
consigue la sntesis de una molcula de
antibitico incompleta. Cuando se
aade al medio el precursor que no
puede sintetizar el microorganismo,
ste reanuda la produccin del
antibitico natural. De esta manera se
pueden obtener nuevos antibiticos
simplemente aadiendo precursores
con estructuras ligeramente diferentes.

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