PRCTICA 1: ESTAFILOCO Y

ESTREPTOCOCO
I.

STAFILOCOCCUS AUREUS
Son cocos Gram positivos, con un dimetro de 0.5 a 1.5 m, agrupados como clulas
nicas, en pares, ttradas, cadenas cortas o formando racimos de uvas. Son bacterias
no mviles, no esporuladas, no poseen cpsula, aunque existen algunas cepas que
desarrollan una cpsula de limo, son anaerobias facultativas. La mayora de los
estafilococos producen catalasa, DNasa, coagulasa y son beta-hemolticas.
En los medios de cultivo tradicionales la mayora de las especies crecen despus de
incubarse durante 18-24 horas, formando colonias de 0.5-1.5 mm de dimetro. Las
colonias de S. aureus se observan lisas, elevadas, brillantes y de bordes enteros,
presentan consistencia cremosa y pigmentacin que va del amarillo a dorado debido a la
produccin de carotenoides.

PROCEDIMIENTO
Se realiz el cultivo de la cepa de Staphylococcus aureus en una placa Petri con
agar Manitol Salado. El cultivo se realiz por agotamiento
Tambin se cultiv en una placa con agar DNasa, en este caso el cultivo se
realiz por estra simple.
-

AGAR MANITOL SALADO

Medio de cultivo selectivo, por la alta concentracin de sal. El extracto de
carne, la peptona de carne y la triptena, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno,
vitaminas y minerales que promueven el desarrollo microbiano. El manitol es el
hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio (que se encuentra en alta
concentracin) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora
acompaante, el rojo fenol es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante.

AGAR DNASA
Medio de cultivo diferencial. Utiliza la triptena como fuente de nitrgeno,
aminocidos, y aporte de nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo
bacteriano. El cido desoxirribonucleico (ADN), se encuentra en grado altamente
polimerizado, y es el sustrato de la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa), la cual lo
hidroliza. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es el agente
solidificante.

RESULTADOS
En el medio de cultivo MANITOL
Se observ el crecimiento adecuado
Staphylococcus aureus; se observ
coloracin amarilla del medio de
que indica que esta bacteria ferment
lo que provoc la acidificacin del
lo que el indicador rojo fenol vir a
Adems en base a la fermentacin de
determina que son estafilococos
positiva; siendo por lo tanto bacterias
En el medio de cultivo AGAR
aadir gotas de HCl 1 N se
zona de transparencia alrededor
colonias. Lo que significa que esta
produce la enzima DNAsa . El
desoxirribonucleico hidrolizado
transparencia, mientras que el
desoxirribonucleico polimerizado,
torna opacidad al medio de

II.

SALADO.
de
adems la
cultivo, lo
el manitol,
medio, por
amarillo.
manitol se
coagulasa
patgenas.
DNASA. Al
observ una
de las
bacteria
cido
presenta
cido
precipita y
cultivo.

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Es una bacteria Gram positiva de 1,2-1,8 m de longitud, que presenta una
forma oval y el extremo distal lanceolado. Es inmvil, no forma endosporas, y es
un miembro alfa-hemoltico del gnero Streptococcus. Generalmente, se
presenta en forma de diplococo y en cadenas. Metablicamente hablando, es un
microorganismo aerobio facultativo, catalasa negativo, que se encuentra dentro
del grupo de las bacterias cido lcticas, ya que este compuesto es el principal
producto resultante de la fermentacin de carbohidratos.

PROCEDIMIENTO
Se cultiv una muestra obtenida por hisopado farngeo, en Agar Sangre y Agar
Azida.
-

AGAR SANGRE
Medio de cultivo enriquecido que permite el cultiv de organismos fastidiosos
y exigentes. El pH ligeramente cido favorece reacciones hemolticas precisas.
Posee todos los componentes del complejo B. Tambin es un medio
diferencial, por las reacciones hemolticas que se dan, que permiten
diferenciar entre los organismos alfa hemolticos de los betas hemolticos.

AGAR AZIDA
Medio de cultivo selectivo, en donde la pluripeptona y el extracto de carne aportan
nutrientes para el desarrollo microbiano. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico y el agar es el agente solidificante. A la concentracin empleada, la azida
de sodio ejerce un efecto bacteriosttico solamente sobre los microorganismos Gram
negativos, otorgando selectividad y favoreciendo el desarrollo de los Gram positivos.

RESULTADOS
- Se observ en el medio de cultivo AGAR
el crecimiento ptimo de colonias
mucosas. No se observ la hemolisis
porque lo que se determin que la
de la cual se obtuvo la muestra, no
presentaba infeccin por
Streptococcus pneumoniae.

- Se observ en el medio de cultivo

SANGRE
grandes
alfa,
persona

AGAR
AZIDA, el crecimiento de colonias
mucosas.
Se observ alrededor de unas colonias un halo de color verdoso oscuro. Lo
que significa que se produjo la hemolisis alfa, propia del Streptococcus
pneumoniae. Entonces se sospecha que la persona cursa con una infeccin
por esta bacteria. Para comprobar la presencia de la bacteria se debe realizar
la inoculacin de 0.5 ml de esta cepa aislada en CALDO BILIADO. Si despus
de 15 minutos se observa la lisis de colonias de neumococos, se confirma que
son colonias de Streptococcus pneumoniae

PRCTICA 2: SIEMBRA DE MUESTRAS

BIOLGICAS PARA EL AISLAMIENTO DE
NEISSERIA
Las neisserias caractersticas son diplococos gramnegativos inmviles de casi 0.8 m de
dimetro (fi gs. 20-1 y 20-2). Los cocos individuales tienen forma de rin; cuando los
microorganismos estn en pares, los lados planos o cncavos estn adyacentes.
Cocobacilo Gram Negativo. No forma esporas, no presenta capsula; reductor de nitratos,
sin motilidad. Los gonococos oxidan slo glucosa y tienen antgenos diferentes a los de
otras neisserias. Por lo general producen colonias ms pequeas que las dems
neisserias.
Los gonococos aislados de muestras clnicas o conservadas mediante subcultivo selectivo
tienen pequeas colonias tpicas que contienen bacterias con pilosidades. En el subcultivo
no selectivo tambin se forman colonias ms grandes que contienen gonococos sin
pilosidades.
Sus colonias son convexas, brillantes mucoides, transparentes, no pigmentadas, no
hemolticas.

PROCEDIMIENTO
Se realiz la toma de muestra de secrecin uretral. Se coloc el hisopo con la muestra en
el medio de transporte Stuart. Una vez en el laboratorio se realiz la inoculacin de la
muestra en placas Petri con Agar Thayer Martin y Agar Sangre.
-

MEDIO STUART
Medio utilizado para el transporte y
conservacin
de microorganismos patgenos. No posee
una fuente
de nitrgeno lo que impide
considerablemente la multiplicacin de
grmenes. El
glicerofosfato sdico asegura una
supervivencia suficientemente larga de
los
microorganismos. Este medio goza de anaerobiosis dada por el Tioglicolato
sdico; la anaerobiosis es controlada por el indicador redox Azul de metileno.

AGAR THAYER MARTIN

Medio de cultivo selectivo. El medio de Thayer-Martin permite el correcto
aislamiento y recuperacin de las neisserias patgenas dentro de las 24 h,
con una ausencia casi total de contaminantes. El medio de cultivo se prepara
a partir del Agar Base GC(pluripeptona, almidn y fosfatos), con el agregado

de hemoglobina, un suplemento de enriquecimiento (Britalex) y una mezcla

antimicrobiana (VCNT: Vancomicina, colistina, nistatina y trimetoprima)

RESULTADOS
-

En el agar sangre se observ el crecimiento ptimo de las colonias de

Neisseria gonorrhoeae. Colonias pequeas convexas, transparentes. No se
observa hemolisis.

En el agar Thayer Martin se observ

crecimiento ptimo de las colonias de
gonorrhoeae. Colonias pequeas
mucoides convexas. Lo que significa
paciente presenta infeccin por esta

el
Neisseria
que el
bacteria.

PRCTICA 3: ESTUDIO DEL GNERO

BRUCELLAE
Son cocobacilos gramnegativos pero a menudo se tien con irregularidad y son aerobios,
no mviles y no formadores de esporas.
Las brucelas estn adaptadas a un hbitat intracelular y sus necesidades nutricionales
son complejas. Algunas cepas se han cultivado en medios definidos que contienen
aminocidos, vitaminas, sales y glucosa. Las muestras recientes de fuentes animales o
humanas suelen inocularse en agar de tripticasa-soya y medios para hemocultivo.
B.abortus necesita CO2 al 5 a 10%para multiplicarse, en tanto que otras especies se
multiplican en el aire.
Las brucelas utilizan hidratos de carbono pero no producen cido ni gas en cantidades
suficientes para la clasificacin. Cuatro especies que infectan al ser humano son catalasa
y oxidasa positivas. El sulfuro de hidrgeno es producido por muchas cepas y los nitratos
se reducen a nitritos. Las brucelas son moderadamente sensibles al calor y a la acidez.
Son destruidas en la leche mediante pasteurizacin.

Las colonias son pequeas, convexas y lisas aparecen en medios enriquecidos en un lapso
de dos a cinco das.

PROCEDIMIENTO
Se realiz el hemocultivo, en donde se tom una muestra de sangre de un paciente con
sospecha en fase aguda de la enfermedad.
La sangre se inocul en la fase liquida del medio Ruiz Castaeda; se inclin suavemente 2
o 3 veces, se llev a incubar a 37C. A intervalos de 48 horas se inclin el frasco para que
la fase lquida inocule a la fase slida (Transferencia). Si las colonias aparecen despus de
las 96 horas (despus de la segunda transferencia) se sospecha que son colonias de
Brucela.
Posteriormente se cultiv las colonias sospechosas en agar Brucella spp, Agar fucsina y
Agar tionina.
-

MEDIO DE RUIZ CASTAEDA

Medio utilizado para realizar el hemocultivo. Tiene dos fases:
Fase liquida: Compuesto por Caldo Triptosa; PSS (anticoagulante, inhibie
fagocitosis) ; Listena, que permite viabilidad; dextrosa y sulfato de magnesio.
Fase slida: Agar triptosa

AGAR BRUCELLA SPP

Medio selectivo, usado para el aislamiento y cultivo de Brucela. Contiene
bisulfato de sodio, que favorece el desarrollo microbiano. Se le aaden
medicamentos como la bacitracina, polimixina y cicloheximida, que dan la
selectividad al medio.

AGAR FUCSINA-TIONINA
Agares usados para la tipificacin de especies de Brucella, de acuerdo al
crecimiento o inhibicin, se logran diferenciar los tres tipos ms comunes de
Brucella.
Fucsina

Tionina

B. Melitensis

B. Abortus

B. Suis

RESULTADOS
-

En el cultivo en el medio Brucella spp se observ el adecuado crecimiento de

colonias pequeas y lisas de Brucela.
En el cultivo en los medios Fucsina- Tionina, se observ el adecuado
crecimiento en ambas placas. Lo que nos indica que estamos frente a colonias
de Brucella melitensis.

PRCTICA 4: AISLAMIENTO DE ENTEROPATGENOS COPROCULTIVO

PROCEDIMIENTO
1. Una vez obtenida una muestra se inocula la muestra en el medio de transporte
CARY BLAIR.
Medio Cary Blair
El medio utilizado para el transporte Cary y Blair se utiliza para el transporte de
muestras fecales. Tiene un bajo contenido de nutrientes, un bajo potencial de
oxidoreduccin y un alto pH. El medio de transporte Cary-Blair, es semislido debido
a la baja concentracin de agar. Tiene un mnimo aporte de nutrientes que permite
la recuperacin de los microorganismos sin que haya replicacin. El tioglicolato de
sodio se incluye para proveer un bajo potencial redox; y el pH relativamente alto
minimiza la destruccin bacteriana por acidificacin.
2. Una vez en laboratorio se inocula la muestra por estria por agotamiento en agar
Mac Conkey.
Agar Mac Conkey
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil
desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que
utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies
de la familia Enterobacteriaceae se desarrollan en el mismo.
3. Una vez obtenido el aislamiento en Agar Mac Conkey, se realizan los siguientes
pasos.
- Si existe sospecha de Salmonella-Shiguella se obtiene una muestra y se
siembra por puntura en el Caldo Selenito.
Caldo selenito
Medio que permite el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de
muestras clnicas, especialmente heces y orinas. En el medio de cultivo, la peptona
aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la lactosa es

el hidrato de carbono fermentable, el selenito de sodio inhibe la flora Gram positiva y

la mayora de la flora entrica excepto Salmonella spp. durante las primeras 8-12
horas de incubacin.

Se siembran en Agar TSI y Agar LIA, las muestras, con sospecha de Escherichia Coli,
Salmonella, Shiguella y Klebsiella; para su estudio bioqumico.
AGAR LIA
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes
para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable y la
lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa
y deaminasa. El citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio son los indicadores
de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de
pH (su color es amarillo a pH igual o menor a 5.2 y violeta a pH igual o mayor a 6.8) y
el agar es el agente solidificante.

4. Las muestras obtenidas en el caldo Selenito, se sembraran en el Agar Salmonellashiguella; para despus realizar su estudio bioqumico en Agar TSI y LIA.
Agar Salmonella Shiguella
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, est dada por la sales
biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas,
de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.
Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido
sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio.

RESULTADOS
MEDIO DE CULTIVO MAC CONKEY
En el medio de cultivo Mac Conkey, se observ la coloracin roja intensa, que nos indica la
presencia de Escherichia Coli. La coloracin roja significa que esta bacteria es lactosa
positiva, ya que al degradar la lactosa, acidificar el medio, que ser neutralizado por el
indicador rojo neutro. Tambin se observaron zonas rosadas, que nos indica la presencia
de Klebsiella, que tambin es una lactosa positiva.
Tambien se observaron zonas transparentes, lo que indica la presencia de Shiguella, que
es una bacteria lactosa negativa, por lo que no hay viraje de color. Adems se observaron
zonas transparentes con puntos negros , lo que indica la presencia de Salmonella, ya que
esta bacteria es lactosa negativa y tambin produce H2S.
AGAR SALMONELLA SHIGUELLA
En este medio de cultivo se observ el crecimiento de colonias transparentes, que nos
indican la presencia de Shiguella y el crecimiento de colonias con puntos negros, que nos
indica la presencia de Salmonella.
ESTUDIO BIOQIMICO

Escherichia coli:
En el agar TSI, se observa el tubo
amarillo, debido a la degradacin de los tres
sacarosa y glucosa), tambin se observa la
En el agar LIA, se observa el tubo
violeta, debido a la descarboxilacin de

Klebsiella
En el agar TSI, se observa el tubo
amarillo, debido a la degradacin de los tres
sacarosa y glucosa), tambin se observa el
la degradacin de peptona.
En el agar LIA, se observa el tubo
violeta, debido a la descarboxilacin de

completamente
azucares (lactosa,
pico rojo, debido a
completamente
lisina.

Shiguella
En el agar TSI se observa el pico alcalino rojo,
degradacin de la peptona, y el fondo amarillo
fermentacin de la glucosa.
En el agar LIA se observa coloracin roja, con el
amarillo por la fermentacin de glucos. El LIA es
debido a que no descarboxila ni desamina.

completamente
azucares (lactosa,
presencia de gas.
completamente
lisina

por la
debido a la
fondo cido
negativo,

Salmonella

En el agar TSI se observa el pico alcalino rojo,

degradacin de la peptona, y el fondo amarillo
fermentacin de la glucosa. Se observa
coloracin negra, que evidencia la produccin
En el agar LIA se observa la descarboxilacin
lo que la coloracin es violeta, adems el color
evidencia la produccin de H2S

por la
debido a la
adems la
de H2S
de lisina, por
negro

PRCTICA 5: ESTUDIO DE LOS GNEROS

HAEMOPHILUS Y BORDETELLA
I.

HAEMOPHILUS
Este es un grupo de pequeas bacterias polimorfas gramnegativas que necesitan
medios enriquecidos, que por lo general contienen sangre o sus derivados, para
su aislamiento. En las muestras de infecciones agudas, los microorganismos son
bacilos cocoides cortos (1.5 m), que a veces se encuentran en pares o cadenas
cortas. En los cultivos, la morfologa depende de la edad y del medio. A las 6 a 8
h en un medio enriquecido, predominan las formas cocobacilares pequeas. Ms
tarde hay bacilos ms largos, bacterias que experimentan lisis y muchas
variantes polimorfas. Los microorganismos en cultivos jvenes (6 a 18 h) en un
medio enriquecido tienen una cpsula definida. La cpsula es el antgeno que se
utiliza para la tipificacin de H. influenzae.

PROCEDIMIENTO
-

Se inocul una muestra obtenida por hisopado farngeo, en una placa Petri
con Agar Chocolate. Se utiliz la tcnica de estra por agotamiento. Se llev a
anaerobiosis y se incub a 37C por 24 horas.
Se inoculo una muestra obtenida por hisopado farngeo en una placa Petri con
Agar sangre. Se utiliz la tcnica de estra por agotamiento. Se realiz la
inoculacin por puntura de Staphylococcus aureus. Se llev a anaerobiosis y
se incub a 37C por 24 horas.
AGAR CHOCOLATE
Medio enriquecido, es ampliamente nutritivo por la presencia de peptona, triptena,
extracto de levadura, extracto de corazn y almidn. El agregado de sangre y
suplemento Britalex con solvente aporta nutrientes, vitaminas y minerales
adicionales. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es el agente
solidificante. Este agar contiene los factores V y X, necesarios para el crecimiento y
de desarrollo de bacterias exigentes, como el Haemophilus

RESULTADOS
- En el caso del Agar sangre. Se observ el crecimiento de colonias pequeas

II.

transparentes alrededor del crecimiento de las colonias mucoides grandes de

Staphylococcus aureus. Este crecimiento se da por el fenmeno de
Satelitismo, que se da debido a que el S. Aureus lisa los glbulos rojos,
presentes en el agar sangre; liberando as a los factores V y X, necesarios
para el crecimiento de Haemophilus.
En el caso de del Agar chocolate. Se observ el crecimiento de colonias
pequeas transparentes, lo que indica el crecimiento de colonias de
Haemophilus.

BORDETELLA PERTUSIS
Los microorganismos son cocobacilos gramnegativos diminutos que se parecen a
H. influenzae. En la tincin con azul de toluidina, se pueden demostrar grnulos
metacromticos bipolares. Contienen una cpsula.
El microorganismo es un aerobio estricto y forma cido pero no gas a partir de
glucosa y lactosa. No necesita factores X y V en el subcultivo. La hemlisis del
medio que contiene sangre se relaciona con B. pertussis virulento.

PROCEDIMIENTO
Se obtendr la muestra de un paciente con sospecha de tos compulsiva. Se le
har toser en la placa con agar Bordet Gengou. Se incubar la placa a 37C por
24 horas.
-

AGAR BORDET-GENGOU
La base agar Bordet Gengou es una modificacin del medio originalmente
descrito por Bordet y Gengou para el cultivo de Bordetella pertussis . En este
medio, la infusin de patata proporciona nitrgeno y vitaminas. Muchos
compuestos pueden inhibir el crecimiento de B. pertussis, incluidos los cidos
grasos presentes en las secreciones nasales o el algodn de la torunda de
recogida. El almidn, presente en la infusin de patata, absorbe los cidos
grasos. El glicerol es una fuente de carbono. El cloruro de sodio conserva el
equilibrio osmtico del medio. La adicin de sangre de carnero al 15%
proporciona factores de crecimiento complejo esenciales. Tambin se le aade
cefaxilina y penicilina para inhibir el crecimiento de Gram positivos .

RESULTADOS
En este caso, no se pudo encontrar una muestra de Bordetella pertussis, sin
embargo los resultados esperado son el crecimiento de colonias pequeas, de color
blanco y con forma de cpula, brillantes y similares a perlas divididas en dos.

PRCTICA 6: ESTUDIO DE BACILOS

AEROBIOS ESPORULADOS: BACILLUS Y
CORYNEBACTERIUM
I.

BACILLUS
El gnero Bacillus comprende grandes bacilos aerobios grampositivos que se
organizan en cadenas. La mayor parte de los miembros de este gnero es
saprfita y vive en la tierra, agua y aire, y en la vegetacin, como Bacillus cereus
y Bacillus subtilis. Algunos son patgenos para los insectos. B. cereus puede
crecer en los alimentos y producir una endotoxina o una toxina emtica que
genera intoxicacin alimentaria. Estos microorganismos algunas veces producen
enfermedades en las personas inmunodeprimidas (p. ej., meningitis,
endocarditis, endoftalmitis, conjuntivitis o gastroenteritis aguda). B. anthracis,
que causa el carbunco, es el principal microorganismo patgeno del gnero.

PROCEDIMIENTO
Se sembr por estra las cepas de Bacillus en una placa de Agar Sangre y en
Agar almidn.
Se sembr por puntura en Medio SIM y en tubos con gelatina
Se incub a 37C por 24 horas las placas y tubos.

MEDIO SIM
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol
y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo.
Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

MEDIO GELATINA
Est compuesto por peptona, gelatina y extracto de carne. La gelatina es una
protena que tiene la propiedad de formar gel. Puede ser atacada por algunas
bacterias que la priven de su propiedad gelificante.

AGAR ALMIDN

El medio de agar-almidn es utilizado en la seleccin de microorganismos

productores de amilasas y tambin en los cultivos de hongos. La actividad amiloltica
es revelada colocando al medio unos gotas de solucin de Lugol, que tie el almidn
de azul y deja un halo claro en el lugar donde el almidn fue digerido
enzimticamente.

RESULTADOS
Se observaron los siguientes resultados.
-

En el agar sangre se observ un halo blanquecino, que evidencia la ocurrencia

de beta-hemlisis.
El agar almidn es hidrolizado.
La gelatina fue licuada, debido a que la bacteria produce enzima gelatinasa.
Se observ la movilidad en el medio SIM. Ya que el crecimiento se realiz a lo
largo de la puntura y por debajo de esta.
En base a todos estos resultados, se determin que la bacteria es Bacillus
subtilis.

II.

CORYNOBACTERIUM
Las corinebacterias tienen un dimetro de 0.5 a 1 m y de varios micrmetros de
longitud. Es caracterstico que posean tumefacciones irregulares en un extremo
que les da el aspecto de forma en palillo de tambor (fi g. 12-1). Con una
distribucin irregular dentro del bacilo (a menudo cerca de los polos) se
encuentran los grnulos que se tien profundamente con colorantes de anilina
(grnulos metacromticos) que le confieren al bacilo un aspecto de abalorio. Las
corinebacterias individuales en frotis teidos tienden a acomodarse en forma
paralela o en ngulos agudos entre s. Pocas veces se observan verdaderas
ramificaciones en los cultivos.

PROCEDIMIENTO
Se sembr por estra por agotamiento en placa con Agar Telurito de Potasio. Se
incub por 24 horas a 37C.
-

AGAR TELURITO DE POTASIO

Medio de cultivo diferencial para bacterias reductoras del telurito de potasio.

Este medio de cultivo adems puede ser utilizado para el diagnstico
diferencial de otras bacterias tolerantes al telurito, y capaces de reducirlo,
tales como Staphylococcus aureus y Corynebacterium diphtheriae. Las
bacterias capaces de tolerar y reducir telurito de potasio producen colonias de
color negro, en tanto que el desarrollo de la mayora de los Gram negativos
resulta inhibido por el efecto toxico de este aditivo.
RESULTADOS
Se observaron el crecimiento de
color negro brillante. Lo que indica
crecimiento adecuado de colonias
Corynebacterium diphtheriae.

colonias de
el
de

PRCTICA 7: GNERO CLOSTRIDIUM

Los clostridios son grandes bacilos anaerobios, grampositivos, mviles. Muchos de ellos
descomponen protenas o forman toxinas y algunos llevan a cabo ambas acciones. Su
hbitat es la tierra o el intestino de animales y seres humanos, donde viven como
saprfitos. Algunos de los clostridios patgenos son los que generan botulismo, ttanos,
gangrena gaseosa y colitis seudomembranosa.
Las esporas de los clostridios por lo general son ms amplias que el dimetro de los bacilos a
partir de los cuales se forman. En las diversas especies, la espora tiene una ubicacin central,
subterminal o terminal. La mayor parte de las especies de clostridios es mvil y posee fl agelos
peritricos.

PROCEDIMIENTO

Se inocula la muestra de cepa de Clostridium en tubo con caldo carne, se incub por 24
horas a 37C.
CALDO CARNE
Medio de cultivo utilizado para el crecimiento de bacterias anaerobias.

RESULTADOS
Se observ el crecimiento de bacterias por debajo de la superficie del medio de cultivo,
debido a que esta bacteria es anaerobia y el oxgeno es toxica para ella.

PRCTICA 8: FAMILIA
PSEUDOMONADACEAE
Las pseudomonas son bacilos gramnegativos, mviles y aerobios, algunos de los cuales
producen pigmentos hidrosolubles. Las pseudomonas tienen una amplia distribucin en el
suelo, el agua, las plantas y los animales. Pseudomonas aeruginosa a menudo est
presente en pequeas cantidades en la microflora intestinal normal y en la piel del ser
humano y es el principal microorganismo patgeno del grupo. Otras pseudomonas pocas
veces producen enfermedad. La clasificacin de las pseudomonas se basa en la
homologa de rRNA/DNA y en las caractersticas de cultivo comunes.
P. aeruginosa es mvil, tiene forma de bastn, mide casi 0.6 2 m. Es gramnegativo y
muestra una disposicin en bacterias individuales, en pares y a veces en cadenas cortas.

PROCEDIMIENTO
Se realiz el cultivo de cepa de Pseudomona Aeruginosa por estra por agotamiento, en el
Agar Cetrimida.
AGAR CETRIMIDA
Su formulacin permite el crecimiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y estimula la
formacin de pigmentos. Es ste un medio muy semejante al King A, en el cual la peptona
de gelatina aporta los nutrientes para el desarrollo microbiano. el cloruro de magnesio y el
sulfato de potasio promueven la formacin de piocianina, pioverdina, piomelanina y
fluorescena de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catinico que acta como
agente inhibidor, libera el nitrgeno y el fsforo de las clulas de casi toda la flora
acompaante, aunque inhibe tambin algunas especies de Pseudomonas. El agar es el
agente solidificante.

RESULTADOS
Se observ el crecimiento ptimo de la cepa
Pseudomona Aeruginosa. Se observa adems
de un color verde-azulado que corresponde a la
piocianina, mientras que un color verde
la produccin de pioverdina.

de
La presencia
produccin de
corresponde a

PRCTICA 9: FAMILIA
SPIROCHAETACEAE
Las espiroquetas componen un gran grupo heterogneo de bacterias mviles espirilares.
Una familia (Spirochaetaceae) de la orden Spirochaetales consiste en tres gneros de
grandes microorganismos espirilares de vida libre. La otra familia (Treponemataceae)
incluye tres gneros, cuyos miembros son patgenos para el hombre: 1) treponemas, 2)
borrelias y 3) leptospiras.
Las espiroquetas poseen muchas caractersticas estructurales en comn, como lo
ejemplifica Treponema pallidum. Son bacilos gramnegativos, largos, finos, helicoidales,
espirilares o a manera de sacacorcho. Los bacilos de este orden poseen una vaina
externa o una cubierta de glucosaminoglucanos. En el interior de la cubierta est la
membrana externa que contiene peptidoglucano y que conserva la integridad estructural
del microorganismo. Los endoflagelos (filamentos axiales) son los organelos a manera
de flagelos en el espacio periplsmico, rodeados por la membrana externa. Los
endoflagelos comienzan en cada extremo del microorganismo y describen una curva a su
alrededor que se extiende hasta un punto medio, y lo cubren. En el interior de los
endoflagelos est la membrana interna (citoplsmica) que confi ere estabilidad osmtica y
cubre el cilindro protoplsmico. Dentro de la clula, cerca de la membrana interna se
encuentra una serie de tubos citoplsmicos (fibrillas corporales).
COLORACIN UTILIZADA
Se realiz la tincin con coloracin Gram y colorante Azul de Metileno. Se observaron leptospiras
y borrelia.

PRCTICA 10: GNERO MICOBACTERIUM

Las micobacterias son bacterias aerbicas de contornos cilndricos, que no forman
esporas. No captan fcilmente los colorantes, pero una vez teidas resisten la
decoloracin por cido o alcohol y por esa razn se les ha llamado bacilos cidoalcoholresistentes o acidorresistentes.

Mycobacterium tuberculosis causa tuberculosis y es un patgeno de extraordinaria

importancia para los seres humanos. Mycobacterium leprae causa la lepra.
Mycobacterium avium-intracellulare (complejo de M. avium, o MAC [M. avium complex]) y
otras micobacterias no tuberculosas suelen infectar personas con SIDA, son patgenos
oportunistas en otros individuos inmunodeficientes y a veces causan enfermedad en
personas con sistemas inmunitarios normales. Se conocen ms de 125 especies de
Mycobacterium, incluidas muchas formas saprfitas.

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
En los tejidos, los bacilos tuberculosos son fInas estructuras rectas cilndricas que miden
0.4 3 m, aproximadamente En medios artificiales se les identifica por ser formas
cocoides y filamentosas, cuya morfologa vara con la especie. Es imposible clasificarlas
micobacterias en grampositivas o gramnegativas. Una vez que captan los colorantes
bsicos el alcohol no las decolora, independientemente del tratamiento con yodo.
Los bacilos tuberculosos verdaderos se caracterizan por su resistencia a la decoloracin,
es decir, la mezcla de alcohol etlico al 95% y cido clorhdrico al 3% (cido-alcohol),
decolora rpidamente todas las bacterias, excepto las micobacterias. Tal resistencia
depende de la integridad de la cubierta crea.
TCNICA DE ZIEHL NEELSEN
Se emplea para la tincin y la identificacin de las bacterias acidorresistentes;
En la que se utilizan los siguientes reactivos:
- Solucin de fucsina fenicada
- Solucin de alcohol acido
- Solucin de Azul de Metileno o Solucin saturada de cido pcrico.
Los microorganismos que retienen el calor rojo a pesar de la decoloracin son los
llamados alcohol cido resistentes y destacando en un fondo de color azul.

Los medios para el cultivo primario de micobacterias deben incluir uno de tipo no
selectivo y otro selectivo. Los de este ltimo tipo contienen antibiticos para evitar la
proliferacin excesiva de bacterias y hongos contaminantes. Se conocen tres frmulas
generales que pueden utilizarse para los dos tipos mencionados de medios.
1. Medio de agar semisinttico.
Los medios de esta categora (como Middlebrook 7H10 y 7H11) contienen sales
definidas, vitaminas, cofactores, cido oleico, albmina, catalasa y glicerol; el medio
7H11 contiene tambin hidrolizado de casena. La albmina neutraliza los efectos
txicos e inhibidores de los cidos grasos en la muestra o el medio de cultivo. Los
medios de agar semisintticos se utilizan para observar la morfologa de las

colonias para evaluar la susceptibilidad y si se les agrega antibiticos y verde de

malaquita, sirven como medios selectivos.
2. Medios de huevo espesado.
Los medios en cuestin (como el de Lwenstein-Jensen) contienen sales definidas,
glicerol y sustancias orgnicas complejas (como seran huevos frescos o yemas de
huevo, harina de papa y otros ingredientes en combinaciones). Se incluye el verde
de malaquita para inhibir la proliferacin de otras bacterias. Los inculos pequeos
en muestras teidas de los pacientes proliferarn en dichos medios en un lapso de
tres a seis semanas. Los medios en cuestin, con la adicin de antibiticos, se
utilizan como medios selectivos.
3. Caldos (como medios).
Los caldos sealados (Middlebrook 7H9 y 7H12) permiten la proliferacin de
inculos pequeos. Por lo comn, las micobacterias proliferan en cmulos o masas,
dado el carcter hidrfobo de la superficie celular. Si se agregan steres
hidrosolubles de cidos grasos (tweens), humedecen la superfi cie y permiten la
proliferacin dispersa en el medio lquido. En ellos es ms rpida la multiplicacin
de los microorganismos que en medios complejos.

PRCTICA 11: OBSERVACIN DE

LMINAS COLOREADAS CON
RICKETTSIA. COLORACIN DE
MACHIAVELLO
Las rickettsias son cocobacilos pleomrfi cos con aspecto de varillas cortas (0.3 1 a 2
m) o de cocos (0.3 m de dimetro). No se tien bien con colorante de Gram pero se
observan fcilmente
bajo el microscopio de luz cuando se tien con colorante de Giemsa, colorante de
Gimenez, naranja acridina y otras tinciones.
Las rickettsias crecen fcilmente en sacos vitelinos de huevos con embrin. Es posible
obtener preparaciones puras de rickettsias para emplearlas en pruebas de laboratorio por
medio de la centrifugacin diferencial de suspensiones de saco vitelino.
Muchas cepas de rickettsia tambin crecen en cultivo celular, donde el intervalo de
generacin es de 8 a 10 h a 34C. Por razones de bioseguridad, las rickettsias slo se
deben aislar en laboratorios de referencia.
Las rickettsias poseen paredes celulares gramnegativas con cido murmico que contiene
peptidoglucano y cido diaminopimlico. Los grupos del tifus y las fiebres exantemticas
contienen lipopolisacrido. En las paredes celulares contienen protenas de superfi cie
OmpA y OmpB, que son importantes para la respuesta inmunitaria humoral y
proporcionan la base para la
serotipificacin.
Las rickettsias crecen en distintas partes de las clulas. Las del grupo del tifus suelen
encontrarse en el citoplasma; las del grupo de fiebres exantemticas en el ncleo.
Coxiella crece slo

en vacuolas citoplasmticas. La proliferacin de las rickettsias aumenta en presencia de

sulfonamidas y las rickettsiosis son ms graves con estos frmacos. La tetraciclina y el
cloranfenicol inhiben la proliferacin de las rickettsias y en ocasiones son eficaces desde
el punto de vista teraputico.
COLORACIN DE MACHIAVELLO
Utilizado para la observacin de rickettsias. Las bacterias se colorearan de rojo-rosado, en
un fondo azul

Se utilizan 3 soluciones:
-

Solucin A:Fucsina bsica al 0.25% en agua destilada

Solucin B: cido ctrico fresco al 0.4% en agua destilada
Solucin C: Azul de metileno al 1% en agua destilada

Clulas infectadas con Rickettsia rickettsii

PRCTICA 12: OBSERVACIN DE

LMINAS CON BARTONELLA
Las tres especies mdicamente importantes del gnero Bartonella son B. bacilliformis, que
causa la fiebre de Oroya y la verruga peruana; B. quintana, la causa de la fiebre quintana
de la Primera Guerra Mundial y algunos casos de angiomatosis bacilar, y B. henselae, que
origina la linforreticulosis benigna y se ha vinculado con la angiomatosis bacilar. Los
cuadros en cuestin poseen muchas caractersticas en comn. Se conoce un conjunto
adicional pequeo de especies y subespecies de Bartonella que rara vez han causado
enfermedades de seres humanos, y tambin un grupo mucho mayor que son propias de
animales, y que posiblemente no se han transmitido a personas.
Las especies de Bartonella son bacilos gramnegativos pleomrficos, de proliferacin
lenta, y difciles de aislar en el laboratorio. Se les identifica en los tejidos infectados
teidos con la tcnica de impregnacin argntica de Warthin-Starry
En el laboratorio se utiliz la coloracin de Leishman.
COLORACIN DE LEISHMAN
Colorante preparado para la tincin de parsitos sanguneos formado por una mezcla al 50 % de eosina y azul de metileno
en metanol con 0,25 grs/100 ml.

PRCTICA 13: MYCOPLASMA

Se han identificado ms de 150 especies de bacterias sin pared (pared defectuosa), y
como mnimo, 15 de ellas, segn expertos, son de origen humano, en tanto que las otras
se han aislado de animales y plantas. En los seres humanos, cuatro especies son de
importancia primordial: Mycoplasma pneumoniae causa neumona y se le ha vinculado
con infecciones articulares y de otros sitios. Mycoplasma hominis a veces causa fiebre
puerperal y se le ha identificado junto con otras bacterias en infecciones de trompas
uterinas. Ureaplasma urealyticum es causa de uretritis no gonoccica en varones y puede
ocasionar neumopatas en prematuros de bajo peso. Mycoplasma genitalium tiene gran
semejanza con M. pneumoniae y se ha dicho que causa infecciones uretrales y de otro
tipo. Otros miembros del gnero Mycoplasma son patgenos de aparatos respiratorio y
urogenital y de articulaciones de animales.
Los micoplasmas son los microorganismos de menor tamao que pueden vivir libres en la
naturaleza y replicarse por s mismos en medios de laboratorio.
Poseen las caractersticas siguientes:
-

Los ms pequeos tienen 125 a 250 nm de tamao

Son muy pleomrfi cos porque no tienen una pared rgida y en vez de ella
estn circundados por una membrana unitaria trilaminar que contiene un
esterol (se necesita la adicin de suero o colesterol a medios de cultivo para
que los micoplasmas generen esteroles y proliferen)
Los micoplasmas son absolutamente resistentes a la penicilina porque no
tienen estructuras de la pared en las cuales acte dicho antibitico, pero son
inhibidos por tetraciclinas o eritromicina.
Los micoplasmas se reproducen en medios acelulares; en el agar, el centro de
toda la colonia est situado de manera caracterstica por debajo de la
superficie
La proliferacin de micoplasmas es inhibida por anticuerpos especficos.
Los micoplasmas muestran afinidad por membranas de clulas de mamferos.

CULTIVO
El cultivo de micoplasmas patgenos para los humanos obliga a usar medios con suero o
lquido de ascitis, factores de crecimiento, extracto de levadura o un sustrato metablico
como la glucosa o la urea. No existe un solo medio ptimo para todas las especies porque
muestran propiedades y necesidades de sustrato diferentes.
Los medios de cultivo especiales utilizados son :
-

Caldo Mycoplasma base

Agar Mycoplasma base

Se reconocen por la formacin de colonias en huevo frito, estas colonias son visibles con
aumento por ser muy pequeas.