INTRODUCCIN

En la microbiologa el examen microscpico es generalmente el primer paso que se da para la identificacin

de un organismo desconocido; pero el tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resulta
difcil ver con el microscopio ptico, principalmente por la falta de contraste entre la clula y el medio que la
rodea.
Se ha hablado de preparaciones de bacterias vivas, no coloreadas, que no permiten observar la movilidad,
pero que sobre otros hechos morfolgicos de importancia como tamao, formas, agrupacin de las clulas,
posesin de estructuras especiales, como endosporas, flagelos, cpsulas y grnulos intracelulares, no arroja
resultados importantes. La forma ms simple de aumentar el contraste entre las clulas y el medio que las
rodea es por medio de la utilizacin de colorantes, de acuerdo con su morfologa y las reacciones tintoriales
de un organismo se pueden ver los grupos en los que estn clasificadas las bacterias
Leer ms: http://www.monografias.com/trabajos15/examen-microscopico/examenmicroscopico.shtml#ixzz3kuNMneNY
Staphylococcus Aureus:
Es un organismo aerobio con un metabolismo respiratorio tpico. Son catalasa positivos y esta prueba permite
diferenciarlos del Streptococcus y de algunos otros gneros de cocos gram positivos. Los Staphylococcus
pueden separarse fcilmente a partir de las pruebas de oxidacin fermentacin (O / F). Es un organismo
facultativo y produce cido a partir de glucosa, tanto aerbicamente como anaerbicamente. Su composicin
de base del DNA tambin es muy distinta. Tienen un porcentaje de GC bastante bajo. Los Staphylococcus son
parsitos habituales de los humanos y otros animales que pueden causar infecciones graves. En los humanos
se conocen dos formas principales; Staphylococcus epidermis, forma no pigmentada y no patgena, que vive
en la piel y en membranas mucosas, y Staphylococcus Aureus, una forma pigmentada amarilla que est
asociada corrientemente a situaciones patognicas, incluyendo granos y fornculos, neumona, osteomielitis,
meningitis y artritis.
Leer ms: http://www.monografias.com/trabajos15/examen-microscopico/examenmicroscopico.shtml#ixzz3kuNlfUd5
Escehrichia Coli:
Los miembros del gnero escherichia son habitantes casi universales del tracto intestinal de los humanos y de
los animales homeotermos, aunque no son de ninguna manera los organismos mas abundantes en dichos
hbitats. Escherichia puede desempear una funcin nutricional en el tracto intestinal mediante
la sntesis de vitaminas, especialmente de vitamina K. Como aerobio facultativo, este organismo
probablemente tambin ayuda a consumir oxgeno, convirtiendo el intestino grueso en anxico. Las cepas
silvestres de escherichia coli casi nunca muestra requerimientos de ningn factor nutricional y pueden crecer
a partir de una gran variedad de fuentes de carbono y de energa como azcares,
aminocidos, cidosorgnicos, etc. Existen cepas patgenas; algunas pueden causar diarreas infantiles, que
alcanzan proporciones de epidemia en guarderas o en departamentos de obstetricias. Escherichia causa
tambin infecciones del tracto urinario en personas de edad avanzada o en aquellas cuya resistencia se halla
debilitada por tratamientos quirrgicos o por la exposicin a radiaciones ionizantes. Cada vez mas
frecuentemente la participacin de cepas enteropatgenas de E. Coli en infecciones parecidas a la disentera
y en fiebres generalizadas como se ha indicado, estas cepas forman el antgeno K, que permite la adherencia
y la colonizacin del intestino delgado, y una enterotoxina responsable de los sntomas de la diarrea.
Leer ms: http://www.monografias.com/trabajos15/examen-microscopico/examenmicroscopico.shtml#ixzz3kuNtynrJ
Anlisis de Resultados:
Las tcnicas de tincin son muy importantes para el estudio de microorganismos inertes. Para las tcnicas de
tincin se aplica un colorante simple (un solo colorante) o diferencial (dos o mas colorantes)

Existen varios tipos de tinciones, pero las estudiadas fueron: tincin de Gram, tincin simple y tincin de
esporas.
Tincin de Gram:
Est dividido en gram positivo y gram negativo. El organismo estudiado para gram positivo fue la Sarcina ya
que manifest una tonalidad violeta debido a que fij en su estructura el cristal violeta como colorante.
El microorganismo estudiado para gram negativo fue, Escherichia Coli, debido a que mostr una tonalidad
rosada porque fija el colorante safranina.
Este tipo de tincin presenta un inters especial por su importancia en taxonoma bacteriana. Con
este procedimiento de tincin se constituye el punto de partida de cualquier procedimiento de identificacin de
bacterias.
Tincin Simple:
Se estudiaron levaduras, en este experimento se utiliz un solo colorante que fue azul de metileno. Se pudo
observar que estas levaduras estaban contaminadas con cocos; estas clulas bacterianas difieren desde el
punto de vista qumico de su medio externo y por eso se tien contrastando con su alrededor.
Tincin de Esporas:
A pesar del minsculo tamao de las bacterias, con el uso correcto de las tcnicas de tincin es posible
observar alguna de las estructuras internas y anexas a las clulas bacterianas. Particularmente las
endosporas debido a que esta cuando est formada es extremadamente resistente a los mtodos ordinarios
de tincin para esto se utiliza una tcnica de tincin simple debido a que se colorea toda la clula excepto la
espora, (clula vegetativa), mientras que la espora permanece sin colorear y por lo tanto resalta a la vista. El
microorganismo estudiado fue el Bcillus Cereus .
Tambin en tincin de gram se estudi microorganismo de Staphylococcus Aureus pero debido a que se
encontraba muy viejo, no tena capacidad de absorber calor.
Leer ms: http://www.monografias.com/trabajos15/examen-microscopico/examenmicroscopico.shtml#ixzz3kuO3FqKd

1.1. En fresco:
Este examen se emplea para el estudio de algunas caractersticas de los microorganismos,
como por ejemplo movilidad, aglutinacin, yemacin, entre otras, es decir se realiza una
observacin de los microorganismos vivos. Cuando se observa al microscopio un lquido
orgnico, como sangre, lquido cfalo-raqudeo, orina, pus, etc., se puede tambin estudiar
elementos citolgicos como leucocitos y la presencia o no de bacterias en ellos, glbulos de
pus, parsitos, etc.
Tcnica:
a) Si la muestra es lquida, colocar una gota del material patolgico en un portaobjetos b) Si la
muestra es slida, hacer una suspensin en suero fisiolgico y colocar una gota sobre un
portaobjetos c) Si se desea hacer una observacin en fresco a partir de una colonia aislada,
colocar una gota de suero fisiolgico en un portaobjetos y luego con el asa de cultivo tomar
una porcin de la colonia y hacer una suspensin d) En todos los casos, cubrir la preparacin
con un cubreobjetos e) Cuando se sospecha que existen pocas bacterias en la muestra, se
debe dejar sedimentar o centrifugar f) Cuando la muestra es muy espesa (pus, expectoracin),
suspender en suero fisiolgico y agitar g) Una vez lista la preparacin, observar en

microscopio con el condensador abajo, utilizando el objetivo seco de mayor aumento 1.2. En
preparaciones fijadas y teidas
Las bacterias vivas son casi incoloras y no tienen suficiente contraste con el medio que las
rodea, lo cual hace su observacin dificultosa. Al teirlas se les otorga un contraste de color
respecto al medio que las rodea, ya que el colorante reacciona con la clula pero no con el
medio externo, con lo cual se hacen ms visibles.
Las ventajas principales de la tincin son: - Proporciona un contraste que permite una mejor
observacin de las bacterias - Permite el estudio en detalle de la morfologa de las bacterias Permite el estudio de las estructuras internas y externas de las bacterias (flagelos, esporas,
ncleo, cpsula, pared celular, etc) - Permite lograr un aumento mayor (lente de inmersin)
Antes de teir las bacterias, se realiza primero una extensin del material a examinar y
posteriormente la fijacin del material al portaobjetos.

A) Extensin a) Los portaobjetos deben estar absolutamente limpios y desgrasados, para lo

cul es conveniente mantenerlos sumergidos en una mezcla de alcohol - acetona b) Secar
prolijamente un portaobjetos c) Colocar en el centro una gota del material a examinar, si este
es lquido d) Si se trata de una colonia cultivada en un medio slido, colocar en el centro del
portaobjetos una gota de suero fisiolgico y luego con el asa de cultivo tomar una porcin de
la colonia y hacer una suspensin e) Extender la muestra con el asa, en una capa delgada y
uniforme, sin llegar hasta los bordes del portaobjetos.
B) Fijacin a) La fijacin tiene por objetivo matar los microorganismos, coagular el
protoplasma de la clula y adherir firmemente las bacterias al portaobjetos, evitando as que
se desprenda durante los lavados posteriores b) El calor es un buen agente fijador ya que
preserva las estructuras de la bacteria, en su forma y posicin, sin producir mayores
alteraciones c) Pasar rpidamente la preparacin sobre una llama suave, 2 3 veces d) Dejar
que la preparacin se enfre y volver a pasar por la llama e) Repetir hasta que la preparacin
quede completamente seca f) Posterior a cada paso por el mechero, tocar la parte inferior del
portaobjetos con el dorso de la mano contraria, para calcular la intensidad del calor aplicado g)
No debe calentarse jams hasta quemar la piel h) Tambin se puede fijar la muestra dejndola
secar al aire o mediante fijadores qumicos como alcohol etlico o alcohol acetona
C) Coloracin Los colorantes empleados en bacteriologa son colorantes sintticos. En la
prctica los colorantes se dividen en 2 grupos: cidos y bsicos.

Los colorantes Bsicos estn formados por un catin coloreado y un anin incoloro, mientras
que en los colorantes Acidos es todo lo contrario. Las clulas bacterianas son ricas en cidos
nucleicos que tienen cargas negativas en forma de fosfatos. Estas cargas se combinan con
los colorantes bsicos cargados positivamente, por lo cual la bacteria se tie uniformemente,
ya que existen cidos nucleicos tanto en el ncleo (ADN), como en el citoplasma (ARN). Los
colorantes cidos tienen mayor afinidad a combinarse con el citoplasma de las clulas de
organismos superiores.
En bacteriologa se usan casi exclusivamente los colorantes bsicos (Cristal Violeta, Fucsina,
Safranina, Azul de Metileno, etc).

Existen 2 mtodos de coloracin principales:

1) Coloracin Simple 2) Coloracin Doble
1) Coloracin Simple: consiste en hacer actuar sobre la preparacin fijada un solo colorante
(Azul de Metileno, Safranina, Fucsina diluda al 10%, etc).
Tcnica
a) Cubrir la preparacin con el colorante b) Dejar actuar por 1 - 2 minutos c) Lavar con agua
corriente d) Secar con papel absorbente y luego a la llama suave ( sin quemar ) e) Observar
con el condensador arriba y con objetivo de inmersin

2) Coloracin Doble: consiste en hacer actuar 2 colorantes diferentes, con una decoloracin
intermedia, sobre una preparacin fijada. La coloracin doble consta en general de 4 pasos: Coloracin primaria - Adicin de un mordiente, que es una sustancia que aumenta la afinidad
o atraccin clula colorante. La bacteria se tie ms intensamente bajo la accin del
mordiente, siendo mucho ms difcil lavar el colorante posteriormente. Ejemplos de
mordientes son algunos cidos, bases, sales metlicas y solucin yodo-yodurado Decoloracin - Tincin con colorante de contraste

2.1. Tincin de Gram: es la coloracin ms empleada en bacteriologa por su gran utilidad en

la clasificacin de las bacterias. Descubierta por Christian Gram (1884), mientras desarrollaba
una tincin para bacterias en tejidos, descubri un mtodo de tincin diferencial para las
bacterias. Esta tincin es de gran utilidad ya que permite una clasificacin taxonmica de las

bacterias, en Gram positivas y negativas, que se relaciona adems con otras propiedades
morfolgicas (Figura 11).
Tcnica a) Teir la preparacin ya fijada con Cristal Violeta durante 2 minutos b) Eliminar el
exceso de colorante y cubrir con Lugol durante 1 minuto (mordiente) c) Decolorar rpidamente
con Alcohol Acetona d) Lavar con agua corriente (en este momento las bacterias Gram
positivas estn teidas de color violeta y las Gram negativas estn decoloradas) e) Teir con
Fucsina fenicada durante 30 segundos f) Lavar con agua corriente g) Secar con papel
absorbente y luego a la llama suave ( sin quemar ) h) Observar con el condensador arriba y
con objetivo de inmersin i) Las bacterias Gram positivas se tien de color Violeta y las Gram
negativas de color Rojo.
Figura 11. Diferencias entre bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. http://educativa.catedu.es/44700165/aula/archivos/repositorio/3250/3408/html/22_pared_bacteriana.h
tml
2.2 Tincin de ZielhNeelsen: se emplea para diferenciar bacterias cido-alcohol resistentes
(principalmente el Mycobacterium de la tuberculosis), de los que no lo son. Las bacterias
Acido Alcohol resistentes tienen en la pared celular una gran cantidad de Acido Miclico el
cual esta unido covalentemente a un fosfolpido (Arabino galactano), el cual forma un
complejo estable con la Fucsina, de carcter altamente hidrofbico que impide la penetracin
del decolorante.
Tcnica
a) Teir la preparacin ya fijada con Fucsina concentrada de Zielh Neelsen durante 3 a 5
minutos, calentando la preparacin suavemente con la llama del mechero, hasta la emisin de
vapores ( La preparacin de no se debe secar y el colorante no debe hervir) b) Decolorar
rpidamente con Acido-Alcohol hasta que se desprenda el colorante (en este momento las
bacterias cido-alcohol resistentes estn teidas de color rojo y las no resistentes estn
decoloradas) c) Lavar con agua corriente d) Teir con Azul de Metileno durante 2 minutos e)
Lavar con agua corriente f) Secar con papel absorbente y luego a la llama suave ( sin
quemar ) g) Observar con el condensador arriba y con objetivo de inmersin h) Las bacterias
cido-alcohol resistentes se tien de color Rojo y las no resistentes de color Azul

Cmo se ven las bacterias tras realizar una tincin de Gram?

A travs de la tincin de Gram pueden valorarse la afinidad tintorial, forma y
agrupaciones de las bacterias.

-Afinidad tintorial. Permite dividir a las bacterias en 1) grampositivas (violetas)

que retienen el colorante principal tras la decoloracin con alcohol o alcohol-acetona y 2)
gramnegativas (rojas) que pierden el colorante principal tras la decoloracin por lo que es
necesario aplicar un colorante de contraste para visualizarlas. Esta diferencia de coloracin
est basada en la diferencia estructural de la pared. En las grampositivas el colorante se fija
fuertemente al peptidoglicano que lo "retiene" e impide que "salga" con el decolorante. En
las gramnegativas el colorante es retenido con menos fuerza al ser ms delgada la capa de
peptidoglicano. Adems la mayor cantidad de lpidos presentes hace que el colorante se
elimine al solubiliarse los lpidos en el alcohol.