Biognesis de la membrana externa de bacterias gram-negativa

Bacterias Gram-negativas son delimitadas por dos membranas. La membrana

externa se compone de fosfolpidos, lipopolisacridos, lipoprotenas y protenas
de membrana externa integral, todos los cuales se sintetizan en el citoplasma.
Recientemente, se ha progresado mucho en la elucidacin de los mecanismos
de transporte de estas molculas sobre la membrana interna, a travs de los
periplasma y la membrana externa, en parte aprovechando la extraordinaria
capacidad de Neisseria meningitidis sobrevivir sin lipopolisacrido.
Introduccin
Bacterias Gram-negativas son caractersticamete rodeadas por una membrana
doble: la membrana citoplasmtica o interna (IM), que es una bicapa de
fosfolpidos, y la membrana externa asimtrica (OM), que contiene fosfolpidos
y lipopolisacridos (LPS) en su folleto interno y externo, respectivamente.
Ambas membranas contienen numerosas protenas que sirven una gran
variedad de funciones. Estas membranas, junto con los periplasma que
contiene peptidoglicano (es un copolmero formado por una secuencia alternante de Nacetil-glucosamina y el cido N-acetilmurmico unidos mediante enlaces -1,4. El
peptidoglucano es muy resistente y protege a las bacterias de una ruptura osmtica en
ambientes acuticos y da a los tipos diferentes de bacterias sus formas. La cadena es recta y
no ramificada. Constituye la estructura bsica de la pared celular de las bacterias y de
lasProchlorophyta. Las arqueobacterias no poseen murena, sino pseudopeptidoglicano
formado por N-acetil-glucosamina unida a N-acetiltalosaminomurmico mediante enlace -1,3)
cerrado forman la envoltura celular bacteriana. Escherichia coli ha sido el
sistema modelo favorecido para estudiar los detalles moleculares de la
biognesis de OM. Pero, avances sustanciales en este campo ha recientemente
han hecho uso de otra bacteria, Neisseria meningitidis.
El hallazgo inesperado que N. meningitidis puede sobrevivir sin LPS, que era
considerado esencial para las bacterias Gram negativas [1], ha abierto
posibilidades para identificar los componentes de los mecanismos de la
biognesis de OM por enfoques genticos directos. En este informe, discutimos
la biognesis de los componentes diferentes del OM, con nfasis en los
descubrimientos recientes hechos posibles por el uso de la N. meningitidis
como sistema modelo.
Protenas de membrana externa
Protenas presentes en la OM de cualquiera dos clases: las lipoprotenas, que
estn ancladas a la OM con cola N-terminal de lpidos, y protenas integrales
que contienen regiones que atraviesan la membrana. Las protenas ltimas
referirn ms a como protenas de membrana externa (OMPs). Todas las
protenas destinadas para la OM se sintetizan en el citoplasma como
precursores con secuencias de la seal N-terminal, que son esenciales para la
translocacin a travs de la IM. Se han identificado dos mecanismos de
translocacin: el sistema de la seg, que transloca desdoblar las protenas [2], y
la maquinaria de Tat, que mueve las protenas plegadas sobre el IM [3]. A

nuestro conocimiento, lipoprotenas OM ni OMPs se han demostrado para usar

la va Tat.
Las lipoprotenas
Lipoprotenas bacterianas se unen a la membrana a travs de un N-acildiacilglicerol cistena por su parte N Terminal. Lipidacin y el plegamiento de
las lipoprotenas tienen lugar despus de su translocacin sobre el IM a travs
de la maquinaria Sec. Una seal de clasificacin de las lipoprotenas est
compuesto por los aminocidos que complementa la cistena lipidaca en la
protena madura [4]. Lipoprotenas que carecen de una seal de retencin IM
son transportadas a la OM por el sistema Lol (Figura 1). LolC, ladrillones y LolE
forman un transportador de ATP-binding cassette (ABC) en la IM. A expensas de
ATP, este transportador libera las lipoprotenas en los periplasma donde estn
limitados por el acompaante LolA. El complejo de lipoprotena LolA cruza los
periplasma e interacta con un receptor de OM, LolB. LolB lanza a LolA del
complejo debido a su mayor afinidad por la lipoprotena [5]. LolA y LolB son
estructuralmente muy similares, ambos que contienen una cavidad hidrofbica.
Sin embargo, la cavidad de LolA se compone sobre todo de residuos
aromticos, mientras que la cavidad en LolB est conformada en su mayora
residuos de leucina y la isoleucina, que es probable que explicar la diferencia
en la afinidad de unin a lipoprotenas.
En e. coli, las lipoprotenas todos enfrentan los periplasma, pero en otras
bacterias, en particular en los miembros de la espiroqueta [8], tambin las
lipoprotenas de superficie expuesta de la clula estn presentes.
Si se produce transporte de lipoprotenas por la OM a travs de una extensin
del sistema Lol, o por un sistema de transporte no relacionado es actualmente
confuso.

Transporte de lipoprotenas a travs de la envoltura celular bacteriana.

Lipoprotenas, despus del transporte a travs del sistema Sec y modificacin
posterior, se unen a la LolCDE del transportador ABC, siempre y cuando no
poseen un motivo de evitacin jajaja. Energa de la hidrlisis de ATP por
ladrillones es transferido a LolC y LolE y entonces utilizado para abrir la cavidad
hidrfoba de LolA para dar cabida a la lipoprotena. Cuando el complejo de
LolA-lipoprotena interacta con el receptor OM LolB, la lipoprotena es
transferida a LolB y luego insertada en la OM. Transporte posterior al prospecto
externo del OM se produce a travs de mecanismos desconocidos. El motivo de
evitacin jajaja Asp en la posicin 2 (C D) causa la formacin de un complejo
de lipoprotena de fosfatidiletanolamina apretado, dando por resultado la
retencin de la lipoprotena en la IM. Una serina en la posicin 2 (C R)
resultados en la localizacin de la OM.

Protenas de membrana externa integral

OMPs integrales comprenden siempre un nmero par de anfipticos bfilamentos del antiparalelas que doblar en b-barriles cilndricos desde que
punto de residuos hidrofbicos hacia el exterior [9]. In vitro, muchos OMPs
desnaturalizados se han demostrado para doblar correctamente en presencia
de detergentes. Tambin, plegado e insercin de OMPs en liposomas se ha

divulgado, sugiriendo que estos procesos ocurren espontneamente [10]. Sin

embargo, la cintica es mucho ms rpida de estos eventos en vivo y la
especificidad de la insercin de la OMP exclusivamente en el OM argumentan
que en la celda de insercin OMP es asistido. Se han identificado varios
acompaantes periplasmic y plegables catalizadores intervienen en este
proceso. SKP (17 kilodalton protena) une a OMPs directamente despus de que
emergen desde el canal de s. [11]. No se conoce la funcin de Skp, pero podra
prevenir prematuro de plegamiento y agregacin. La peptidil-prolil cis-trans
isomerasa (PPIase) SurA parece actuar como una chaperona especficamente
para OMPs [12], como falta de SurA afecta negativamente la expresin de los
principales trmero porinas OmpC, desaparecidas y cordero, as como de OmpA.
Por otra parte, preferentemente une OMPs desplegados sobre otros similar
tamaos no-OMPs [13] o doblado OMPs. Ambos PPIase dominios de SurA son
prescindibles para la actividad de acompaante [13], una observacin que por
lo menos en parte se explica por la estructura cristalina de SurA, que revel
que un dominio PPIase no particip en la formacin de la hendidura de unin a
pptido putativa [15]. Inactivacin del gen el skp y surA dio lugar a un fenotipo
mortal sinttico, lo que sugiere que el Skp y SurA comparten actividad
chaperona redundante [16]. Adems, la formacin del enlace de disulfuro y
reorganizacin son catalizadas en el periplasma por las protenas DsbA y DsbC
[17], un proceso que precede a insercin de OM, indicando que OMPs se doblan
al menos en parte antes de su insercin de OM.
La exclusiva insercin de OMPs la OM podra estar relacionado con la presencia
exclusiva de LPS en esta membrana. Un papel para LPS de hecho fue sugerido
en estudios in vitro, que muestran un fuerte efecto estimulante del LPS en OMP
plegable [19]. Sin embargo, un mutante de la N. meningitidis que est
totalmente desprovisto de LPS (se vio que haba montado correctamente todas
las OMPs examinadas) debido a la interrupcin del gene de lpxA, codificacin
de la primera enzima de la biosntesis de LPS, haba montado correctamente
todas las OMPs examinadas [20]. As, en vivo, LPS no un papel obligatorio en
clasificacin OMP, plegado o insercin. La insercin de OMPs en OM durante
mucho tiempo ha mantenido un proceso enigmtico. Sin embargo,
recientemente, un componente de una maquinaria de insercin OMP putativo
fue identificado en N. meningitidis. Este componente, una OMP llamado
Omp85, fue demostrado para ser esencial para la viabilidad. Agotamiento de
Omp85 en un condicional mutante, OMPs se encontraron que se acumulan en
una forma desplegada y no fueron insertados en el OM. Por otra parte,
superposicin de experimentos demostrados que Omp85 limita no nativos
porin, indicativo de un papel directo de Omp85 OMP Asamblea [21] y
argumentando que no hay actividad de acompaante es necesaria para la
orientacin de la OMP para Omp85. Un atractivo motivo de reconocimiento
Omp85 puede ser la secuencia de firma de c-terminal en OMPs [22], que
consiste en alternando residuos hidrofbicos en los nueve residuos C-terminal,
con casi invariablemente un residuo final aromtico. El mismo motivo es
reconocido por la proteasa IM-limite DegS, iniciando as respuestas de estrs
periplasmic cuando OMPs desplegados se acumulan en los periplasma.

Omp85 es una protena conservada evolutiva que est presente en todos los
genomas Gram negativas genomas secuenciados hasta la fecha [21] as como
en las mitocondrias relacionadas evolutivas. El homlogo Omp85 mitocondrial
de levaduras fue demostrado para ser esencial para la viabilidad celular y a la
funcin de ensamblaje OMP [24-26]. As, el homlogo Omp85 mitocondrial,
tambin conocida como Tob55 o Sam50, parece ser funcionalmente similares a
Omp85. Omp85 bacteriana y el homlogo mitocondrial residen en un complejo
[24,27]. La identificacin de los componentes de estos complejos ser esencial
para desentraar toda la maquinaria de ensamblaje OMP. En las mitocondrias,
dos de los componentes, Mas37 y Sam35/Tob38, fueron encontrados [28,29,
30], pero todava ninguna funcin ha sido asignada a ellos. No homlogos
bacterianos de estas protenas podran ser identificados ([28], Bos MP,
Tommassen J, indito). En el cloroplasto OM, un homlogo Omp85, sealado
Toc75, est presente. Sin embargo, su funcin parece haber desviado desde el
homlogo bacteriano: Toc75 tiene una topologa invertida comparada con
Omp85 y funciona como un componente de la maquinaria de importacin de la
protena del cloroplasto [31] (vase tambin actualizacin).
Podemos ya imaginamos cmo Omp85 podra funcionar en un mecanismo de
insercin de OMP? La estructura del Omp85 fue predicha para ser un 12trenzados b-barril con un N-terminal largo extensin periplasmic que contiene
repeticiones de un dominio conservado sugiere tener acompaante-como
cualidades [21,32]. Estas POTRA llamada (para asociados de transporte
polipptido) dominios estn presentes en miembros de OM de Omp85 y
secrecin socio dos familias [33] y en la familia de FtsQ/DivIB de IM protenas
que actan como acompaantes en los procesos de divisin celular [34]. Los
dominios Omp85 POTRA se pueden implicar en vinculante la OMP desplegado,
con lo cual plegamiento puede tener lugar con la OMP sigue siendo accesible a
diferentes catalizadores plegables periplasmic. Posteriormente, la OMP podra
introducir en un canal que se forma en el interior del complejo Omp85.
Estudios de microscopia electrnica de complejos Tob55 purificadas revelaron
la existencia de canales con un dimetro interno de 7 nm que debe ser lo
suficientemente grande como para acomodar un barril b 16-22 b-filamentos
[24]. El complejo entonces debera abrirse lateralmente para permitir la
insercin estable de la OMP en la bicapa lipdica de la membrana (Figura 2),
que se asemeja a la insercin de protenas IM travs del translocon del Sec [2].
En otro estudio, la protena Omp85 meningoccica fue postulada para ser
involucrados en LPS y la transferencia de fosfolpidos a la MO y no en Asamblea
OMP [35]. Esta conclusin se bas en experimentos de separacin de
membrana mostrando mislocalization (es decir, acumulacin en el IM) de LPS y
fosfolpidos en bacterias Omp85-agotado. Sin embargo, un OM carente de
OMPs insertados tendr una densidad disminuida y probablemente ser
fraccionar aberrantemente en gradientes de sacarosa a fracciones donde IMs
tambin terminan. Adems, como se explicar a continuacin, una OMP es
necesaria para el transporte de LPS en la superficie de la clula bacteriana.
Agotamiento de Omp85 afectar el correcto montaje de este OMP y de tal
modo el transporte de LPS, que luego puede acumularse en el IM. Adems,

dada la abundante evidencia de una funcin de conjunto OMP de la homlogo

Omp85 en las mitocondrias, los datos de Genevrois et al [35] deben
probablemente ser reinterpretados.

Modelo de insercin y ensamblaje OMP. Tan pronto como OMPs emergen de la

Sec IM translocon estn obligados por la chaperona periplasmica Skp, que
pueda afectar el plegamiento y agregacin prematura. Despus del transporte
del complejo a travs de los periplasma, la OMP est limitado por los dominios
POTRA (P) situados en la parte amino terminal de Omp85. Otros acompaantes
y catalizadores plegables, como SurA, pueden actuar en la OMP. Despus de
doblar, la OMP se inserta en el canal formado por el complejo en el OM, que
entonces lateralmente se abre para permitir la insercin estable de la OMP
completamente doblada en la bicapa lipdica Omp85.

Lipopolisacrido
LPS se compone de un anclaje de membrana hidrofbica, lpido A, sustituido
con una regin del ncleo oligosacrido que puede extenderse en algunas
bacterias por un oligosacrido de repeticin, el antgeno O. Estos diferentes
componentes LPS son sintetizados en el folleto citoplsmico de la IM. El Oantgeno se transporta sobre el IM por separado de la moiety del lpido A la
base por cualquiera de las tres rutas diferentes: la Wzy, ABC-vas de
transportador o sintasa dependiente [36]. La ligadura posterior del antgeno O
a los lpidos de un ncleo en el lado periplasmic de la IM es un proceso

incompleto entendido que implica por lo menos el ligase de WaaL. La

traslocacin de la regin de la base de lpidos de la A sobre el IM es mediada
por un transportador ABC familia, MsbA, como se infiere de la acumulacin de
LPS en la IM en un mutante de msbA de e. coli sensible a la temperatura a la
temperatura restrictiva [38]. La funcin de la MsbA no se limita a transporte
LPS, como lo sugiere la presencia de homlogos MsbA en bacterias Grampositivas y su capacidad para actuar como un transportador del multidrug [39].
Los pasos subsecuentes en transporte LPS hacia el exterior de la bacteria han
permanecido oscuros por mucho tiempo. Sin embargo, recientemente, un
componente de OM para la aparicin del LPS en la superficie de la clula
bacteriana fue identificado [40]. Este componente es un OMP conocido como
Imp (permeabilidad de la membrana mayor) o OstA (tolerancia a disolvente
orgnica) debido a cepas de e. coli expresan versiones mutantes de esta
protena mostraron alteracin de permeabilidad de la membrana [41]. Imp es
una protena esencial en e. coli. Un mutante condicional imp produce
membranas con una proporcin de lpidos: protenas alteradas que demuestran
un papel del Imp en la clula envolvente biognesis. El papel exacto de Imp fue
demostrado en N. meningitidis: Imp no era esencial en esta especie bacteriana,
lo que es posible obtener un imp mutante de eliminacin. El fenotipo de este
mutante demostraron un papel para Imp en biognesis LPS: producen menos
del 10% de los niveles de tipo salvaje de LPS, que no eran accesibles a las
enzimas modificadores de LPS presentes en el OM o aadido al medio
extracelular. Por lo tanto, Imp tiene funciones en transporte LPS sobre la OM a
la superficie de la clula. Los niveles reducidos de LPS producidos por el
mutante de imp estn probable que sean una consecuencia de la inhibicin de
la regeneracin debido a LPS se estanc en la va de transporte. Un papel vital
para Imp en biognesis LPS es apoyado ms por su alta conservacin entre los
Gram-negativos y su ausencia de Gram-positivos.
Una cuestin sin resolver restante en transporte LPS es el paso a travs de los
periplasma (Figura 3). LPS podran ser transportadas a sitios de contacto de
membrana conocidos como uniones de Bayer [43,44]. Posiblemente, MsbA
junto con Imp, constituyen el completo translocon LPS. Alternativamente,
podra estar implicado un componente periplasmic. En ese sentido, la
homologa de la protena MsbA HlyB, un transportador ABC que forma parte del
tipo sistema de secrecin de protenas, es interesante. Tipo I secrecin
sistemas consisten en una OMP, un transportador ABC de IM y una protena de
la fusin de la membrana llamados, que conecta los componentes de IM y OM
[45]. Posiblemente, el LPS translocon es semejantemente organizadas (Figura
3), aunque tales modelos deben tener en cuenta que el lpido una parte de la
base debe ser accesible en el periplasmic lado de la IM de la ligasa de WaaL
para fijacin de antgeno O. Por el contrario, transporte periplasmic puede
requerir un componente soluble que se asemeja a la acompaante LolA de la
lipoprotena.

Modelo para el transporte de LPS a travs de la envoltura celular bacteriana.

LPS es sintetizado en el prospecto interno de la IM. Luego se transporta sobre
la IM por el transportador ABC MsbA. (a) LPS que recorre entonces los
periplasma por un mecanismo desconocido, que podra implicar una chaperona
periplasmic soluble (C). (b) por otra parte, el transporte puede tener lugar en
sitios de contacto entre las dos membranas. Estos sitios de contacto pueden
implicar interacciones directas entre MsbA y Imp o componentes adicionales
que tiende un puente sobre los periplasma. Imp es necesaria para transferir
LPS a su destino final, el prospecto externo de la OM, tal vez actuando como un
flippase.
Fosfolpidos
Los principales fosfolpidos de OM de e. coli son fosfatidiletanolamina y
fosfatidilglicerol. Los fosfolpidos son sintetizados en el lado citoplsmico de la
IM [46,47]. Para llegar a la OM, primero tienen que girar ('flip-flop') sobre la
membrana. No est claro si un flippase dedicado es necesario para este
proceso. El transportador de LPS MsbA tambin estuvo implicado en transporte
de fosfolpidos, el condicional de e. coli msbA mutante acumulada LPS y
fosfolpidos en su IM bajo condiciones restrictivas [38]. No obstante, un
mutante de msbA de N. meningitidis apareca viable y an una doble
membrana, demostrando que al menos en esta bacteria, MsbA no es requerido
para el transporte de fosfolpidos (Tefsen B, Bos MP, Tommassen J, de Cock H,
indito). Por otra parte, inducida por varios pptidos que atraviesan la
membrana a-helicoidal, pero, curiosamente, no MsbA, translocacin de
fosfolpidos cuando incorpora en bicapas de lpidos sintticos [48]. Por lo tanto,

flip-flop de los fosfolpidos no requerir un transportador especfico, sino

simplemente la presencia de las regiones que atraviesan la membrana una
helicoidal tpica de algunas protenas IM. Los prximos pasos en la biognesis
de fosfolpidos (es decir, transporte a travs de los periplasma y la
incorporacin y el confinamiento al prospecto interno de la OM) siguen siendo
obscuros y no los componentes implicados en estos pasos se han identificado.

Conclusiones
En los ltimos aos, el mecanismo de transporte de las lipoprotenas se
desentraa en detalle considerable. Adems, se han identificado los primeros
componentes de los mecanismos de insercin de OMP y LPS en el OM. Estos
fueron logros muy esperados en el campo de la biognesis OM bacteriana.
Estos descubrimientos sern sin duda instigadores de ms investigacin para
finalmente desentraar los mecanismos exactos de diferentes maquinarias
montaje de OM, ya que abre la posibilidad de identificar a otros componentes
de las maquinarias y para reconstituirlos in vitro. Adems, OMPs bacterianas
han demostrado para ser susceptibles de anlisis estructural por cristalografa
de rayos x, y la resolucin de las estructuras cristalinas de Omp85 y Imp, que
se puede alcanzar en un futuro prximo, sin duda proporcionar visin
mecanicista en los procesos que participan en. Estudios sobre los mecanismos
de insercin mitocondriales OMP tambin, por comparacin, contribuir a
entender la maquinaria bacteriana y proporcionan nuevas perspectivas sobre
los procesos evolutivos que han ocurrido desde la mitocondria se convirti de
un endosimbiosis procariota [49]. Adems, discute la naturaleza esencial de los
mecanismos bacterianos y su localizacin superficial hacerlos objetivos
atractivos para el desarrollo de nuevos antimicrobianos y vacunas.
Actualizacin
Trabajo reciente ha demostrado que Toc75 tambin participa en la Asamblea de
OMPs en el cloroplasto OM [50].