Experimento 6.2 . Determinacin de la actividad especfica de la B-galactosidasa.

Antes de abordar en que es la actividad especfica, se hace necesario mencionar las tcnicas
utilizadas para la extraccin y purificacin enzimtica, procesos claves para el estudio del
comportamiento de una enzima en particular. Las enzimas se encuentran formando parte de
mezclas complejas, usualmente en el interior de clulas que adems poseen cientos de otras
enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas,
protenas inertes, cidos nucleicos, polisacridos o lpidos.
Es as como la purificacin debera proporcionar una muestra proteica que contenga solo un
tipo de molcula, en este caso la B-galactosidasa que es la enzima objeto de estudio. El
material de partida para la obtencin de la enzima en particular pueden ser clulas en cultivo o
un rgano propio de un animal, lo primero que se debe hacer es fraccionar la clula en sus
componentes y precisar que componente esta enriquecido en la enzima que nos interesa. Se
forma un homogenado por ruptura de membrana celular, fraccionndose la clula por
centrifugacin y un sobrenadante mas ligero encima, este sobrenadante se centrifuga de
nuevo con una fuerza centrifuga mayor obteniendo un nuevo precipitado y otro sobrenadante.
Este procedimiento se conoce como Centrifugacin diferencial que produce varias fracciones
de densidad decreciente, cada una de ellas consiste en varios cientos de protenas distintas.
Para obtener una enzima en particular se realiza luego un proceso de purificacin, las
protenas se pueden purificar de acuerdo con sus solubilidad, tamao, carga y afinidad. El
mecanismo habitual consiste en que la mezcla de protenas se somete a diferentes
separaciones, basada cada una de ellas en propiedades diferentes, para obtener la enzima
pura. Existen muchas tcnicas de purificacin aplicables, pero hoy nos centraremos solo en
algunas que son las ms utilizadas.

1. Precipitacin Salina: La mayora de las protenas son menos solubles a concentraciones

elevadas de sal, un efecto llamado precipitacin salina. Las concentraciones elevadas
de sal en las que precipita una protena varan de una protena a otra, por lo que la
concentracin que se utilice depender de la enzima que queramos obtener.
2. Cromatografa de filtracin en gel: Se pueden conseguir separacin mas
discriminatorias, basadas en el tamao, por medio de la tcnica de cromatografa en
gel. La muestra se coloca en lo alto de una columna rellena de bolitas prosas
compuestas por un polmero insoluble, pero altamente hidratado. Las molculas
pequeas pueden entrar en estas bolitas, pero no las grandes. El resultado es que las
molculas pequeas se distribuyen tanto en el interior de las bolitas como entre ellas,
mientras que las molculas grandes fluyen ms rpidamente a travs de esta columna
y aparecen antes. Las molculas que son de un tamao intermedio y que pueden
penetrar en las bolitas parcialmente fluirn de la columna en una posicin intermedia,
mientras que las molculas pequeas, que siguen un camino ms largo y tortuoso,
sern las ultimas en salir.

3. Cromatografa de intercambio inico: Las protenas

se pueden separar en base a su carga neta. Si una
protena tiene una carga positiva a pH 7, se unir
normalmente a una columna de bolitas que estn
cargadas negativamente, mientras que una protena
con carga neta negativa no lo har. Las protenas
cargadas positivamente se pueden separar en
columnas de carboximetil-celulosa (CM) cargadas
negativamente. A su vez, las protenas cargadas
negativamente se pueden separar por cromatografa
en columnas de dietilaminoetil-celulosa (DEAE)
cargadas positivamente.

4. Cromatografa de Afinidad: Esta tcnica se

aprovecha de la alta afinidad de muchas protenas
por grupos qumicos especficos. Un ejemplo es la
protena vegetal concanavalina A se puede purificar
pasando un extracto crudo a travez de una columna
de bolitas que contienen residuos de glucosa unidos
covalentemente. La concanavalina A se une a esta
columna debido a su afinidad por la glucosa, que no
tienen otras protenas. La cancanavalina A unida se
libera posteriormente de la columna si se aade una
disolucin centrada de glucosa.
5. Isoelectroenfoque: Las protenas tambin
pueden separarse electroforticamente en base a
sus contenidos relativos de aminocidos acidos o
bsicos. Antes de cargar la muestra, se establece un
gradiente de pH en un gel. Se carga la muestra y se
aplica el voltaje. Las protenas migraran hacia el
lugar en el que no tienen carga neta.

Criterios de pureza
La ausencia de otras actividades enzimticas medibles
Actividad especfica constante despus de varias cristalizaciones
Homogeneidad en un campo electrofortico (una sola banda)
Homogeneidad en campo gravitacional (una sola fase luego de una centrifugacin)
Curva de solubilidad al agregar cantidades crecientes de la enzima
Especificidad inmunolgica
Para determinar el xito de un protocolo de purificacin de protenas, se puede controlar
midiendo la actividad especfica. Por lo tanto el grado de pureza relativa de una azima se
puede conocer si se expresa la actividad (unidades) en funcin de la cantidad de protenas de
la preparacin. Se denomina actividad especfica de una enzima a las unidades de enzima por
una unidad de masa de protenas, habitualmente por miligramo. En general se dice que la
pureza y la actividad especfica son directamente proporcionales, por lo que un mayor grado
de pureza determinara una mayor actividad especfica.

En el experimento 6.2 se determino la actividad especfica de una enzima en particular, la cual

es la B-galactosidasa. La -galactosidasa es una enzima que cataliza la hidrlisis de
galactsidos a monosacridos. Un galactsido est compuesto por un glicsido que contiene
galactosa. Es decir, el hidrogeno del grupo hidroxilo del carbono 1 de la galactosa es sustituido
por un resto orgnico. Dependiendo del enlace glicosdico entre la galactosa y el resto
orgnico, los galactsidos se clasifican en -galactsidos o -galactsidos. El -galactsido ms
comn es la lactosa, un disacrido entre galactosa y glucosa ( 1,4 Galactosa-Glucosa). En los
humanos, la -galactosidasa hidroliza la lactosa en el tubo digestivo para poder ser absorbida
como galactosa y glucosa. El sndrome de Morquio es una enfermedad autosmica recesiva en
donde el cuerpo carece o no tiene suficiente sustancia necesaria para descomponer cadenas
largas de azcares. Los dos tipos del sndrome de Morquio son el tipo A y el tipo B. En el tipo A
hay una deficiencia o carencia de galactosamina 6-sulfatasa y en el tipo B de -galactosidasa.
[5] Uno de los estudios recientes con respecto a esta enzima involucra terapia genica para
insertar ADN bacterial en el genoma humano para que la protena se exprese con normalidad.
[6]
En Escherichia coli el gen de la -galactosidasa, LacZ est presente como parte del opern lac
que es activado en presencia de lactosa con niveles bajos de glucosa. En biologa molcular
esta enzima es usada como un marcador para monitorear expresin de genes en ADN
recombinante. La -galactosidasa puede ser separada en dos pptidos: LacZ and LacZ. Estos
pptidos no son activos individualmente pero si estn en presencia del otro se activan
espontneamente. Esta propiedad es usada porque si se insertan fragmentos de ADN en el
vector, el gen se ve interrumpido y las clulas no van a mostrar actividad de -galactosidasa.
Esta actividad puede ser detectada por X-gal que tie de azul cuando es hidrolizado por la galactosidasa, por lo tanto si hubo una insercin de ADN al vector, la tincin se ve blanca.

T optima: 37C y pH optimo: 6-8.

Activadores: Na+, Mg++, b-mercaptoetanol.
Inhibidores: Cu++, K+, Cs+, Rb+, Li+.

Para determinar en una alcuota de preparacin enzimtica la concentracin de protenas se

utilizo el mtodo de Coomasie. Este mtodo est basado en el cambio de color del colorante
Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este
compuesto interacciona con aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. Esta
unin del colorante con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del
colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul
Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul.
La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena.
Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).
Algunas ventajas y/o desventajas del Mtodo

La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y

aromticos.
El complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin lo cual es
imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medicin de protenas.

 La unin colorante-protena es un proceso muy rpido (2min) y el complejo

permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo de
este un proceso muy rpido, y que no requiere un tiempo crtico para el ensayo.
Se pueden utilizar un gran nmero de muestras (muy reproducible) y es adaptable a la
automatizacin.
Las interferencias o no existen o son mnimas por cationes tanto sodio como potasio y
carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en el ensayo son los
agentes fuertemente alcalinos (fcilmente solucionable con la utilizacin de buffers).
Los nicos componentes encontrados que dan una excesiva interferencia en el color
del ensayo, son altas concentraciones de detergentes como el SDS, Triton X-100, etc.