Prctica de espectrofotometra UVVisible

(Cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer y anlisis de

mezclas)

FUNDAMENTO DE LA TCNICA
Como es sabido, las tcnicas espectroscpicas se basan en la interaccin de la
radiacin electromagntica con la materia. A travs de esta interaccin las molculas
pueden pasar de un estado energtico, m, a otro estado energtico distinto, l, absorbiendo
una cantidad de energa radiante igual a la diferencia energtica existente entre los dos
niveles:
tal que:

E l Em .

Para conseguir esto, las molculas absorben un fotn de una radiacin

hc

E = h=

El

-34

h = Constante de Planck= 6.63.10

Em

= Frecuencia de la radiacin=
10

c = velocidad de la luz=3.10
= longitud de onda

J.s

cm.s

-1

Estos trnsitos energticos son los que dan origen a los espectros que, en definitiva,
no son mas que el registro de las distintas o a las que se producen estos trnsitos
energticos.
Debido a la existencia de diferentes tipos de energa: de los electrones en si, de los
movimientos vibracionales de las molculas, de la rotacin de las mismas...etc, las
molculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnticas de un rango muy amplio
de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopas segn las diferentes
regiones. Un esquema podra ser el siguiente:

/ nm

10

Rayos Rayos x

electrones
Transitos
internos
nucleares
400

10 10
10
10
10
10
UV VIS INFRARROJO MICROONDAS ONDAS RADI O
electrones
externos
500

600

Vibraciones

Rotaciones

RMN

700

violeta ail azul verde amarillo naranja rojo

La espectroscopa UV-Visible (espectros electrnicos), se debe a la transicin de los

electrones mas externos de los tomos de las molculas, desde niveles fundamentales a niveles
mas altos de energa.

Espectrofotometra

pgina 2

LEY DE LAMBERT-BEER
Si se hace incidir radiacin monocromtica sobre una muestra con una
concentracin C de una sustancia que absorbe a esa longitud de onda , la intensidad

de la radiacin que la atraviesa, I, est relacionada con la intensidad incidente I0 y

con el espesor de la muestra,l , por la expresin :

I I 0 10l
c

aplicando logaritmos:

log I log I0 l c

reordenando trminos:

log I 0 log I l c

pudindose escribir :

I0
log I l c

I
Habitualmente, el cociente I0 se denomina trI ansmitancia de la muestra y se
suele
expresar como porcentaje de luz transmitida:
I0 100 . Por otra parte, se define la

absorbancia de la muestra como: A log1/T. Tanto la absorbancia como la

transmitancia son magnitudes que se obtienen directamente en el espectrofotmetro.
Segun estas definiciones, queda finalmente la siguiente expresin que se conoce con
el nombre de la ley de Lambert-Beer:

A l c
donde es la absortividad molar (una medida de la radiacin absorbida), que es un valor
constante para cada sustancia a cada longitud de onda y en unas condiciones
experimentales determinadas; tambin se denomina coeficiente de extincin molar si,
como es frecuente, la concentracin se expresa en moles por litro.
Si se opera, por tanto, a una longitud de onda dada y con una cubeta de un
determinado espesor, l , la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a la
concentracin molar de la muestra, c, lo que constituye el fundamento del anlisis
espectrofotomtrico cuantitativo.
Existen, sin embargo, distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de
Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al
anlisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de
concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de calibrado que relaciona
las absorbancias con las concentraciones.

La ley de Lambert-Beer puede tambin aplicarse al anlisis cuantitativo de mezclas

de dos o ms sustancias, siempre que sus respectivos espectros de absorcin sean lo
suficientemente distintos. El procedimiento se basa en que la absorbancia es una propiedad
aditiva, de tal forma que la absorbancia total de una mezcla es la suma de cada uno de los
componentes. As, para una mezcla de dos componentes, 1 y 2, que absorben radiacin de
una misma longitud de onda, se cumplir que:

A A1 A2 1 l c1 2 l c2
Supongamos, entonces, que nuestro problema es el anlisis de una mezcla de dos
sustancias. En primer lugar se habr de registrar el espectro de absorcin de cada una de
ellas por separado, con lo que nos podremos encontrarnos en una de las dos situaciones
siguientes:
a) Ambos espectros no presentan solapamiento en el margen de longitudes de onda
de trabajo. El problema se reduce, entonces, a sendos anlisis por separado, cada
uno en la zona del espectro en donde cada componente de la mezcla se presenta
como nico absorbente.
b) Ambos espectros presentan solapamiento en una zona determinada de longitudes de
onda. En este caso se han de seleccionar dos longitudes de onda diferentes, 1 y
1

1
las
2, y obtener, con disoluciones de las sustancias
respectivas
2
, 2 ,puras,
,
absortividades molares a cada longitud de onda:
1
2
2 . Con estos datos
1
se pueden determinar las concentraciones de los dos componentes de la mezcla a
partir de las medidas de la absorbancia de la misma a las longitudes de onda de
trabajo seleccionadas, A y A . El clculo se realiza resolviendo el siguiente
sistema de 2 ecuaciones con 2 incgnitas:
1

1 1

Al c

l c

1
2

l c

l c

CARACTERSTICAS DE UN ESPECTROFOTMETRO

UV-VISIBLE

Lmpara
Lente

Fototubo

Rendija de entrada

Objetivo

Pa n

Rendija de salida

Prisma

Filtro
Cubeta

La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotmetro, que en

esencia consta de un monocromador (prisma o red de difraccin) que controla la longitud de
onda de la radiacin que se hace incidir sobre la muestra. La radiacin no absorbida se
detecta y mide convenientemente. La absorbancia de la muestra se compara con la de una
referencia que consta estrictamente de disolvente.
Las instrucciones generales de manejo de un espectrofotmetro seran:
1.- Encendido de lmparas :
1.1. Lmpara de tungsteno (zona del Visible, 900 a 340 nm), encendido instantneo.
1.2. Lmpara de Deuterio (zona del UV, 340 a 200 nm aprox.), necesita un calentamiento
previo.
2.- Adaptacin del espejo a la lmpara adecuada, atendiendo al rango de longitud de
onda de trabajo (slo en los espectrofotmetros no automticos).
3.- Seleccionar el valor de longitud de onda con el mando correspondiente.
4.- Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda del mando Ajuste
del cero, hasta que aparezca CERO en la pantalla.
5.- Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la referencia, que
normalmente es el disolvente de la muestra, utilizando para ello el mando A-T.
6.- Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra.
Las cubetas empleadas en el espectrofotmetro (1.00 cm de espesor) deben estar
escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas.
No es conveniente secarlas o limpiarlas con papel ordinario por el carcter abrasivo de ste
sino con un papel suave.

APLICACIONES DE LA TCNICA
Una de las aplicaciones prcticas de mayor inters de la espectrofotometra de
absorcin UV-Visible es la del anlisis cuantitativo, basada en la aplicacin de la ecuacin de
Lambert-Beer

OBJETIVO DE LA PRCTICA

Se trata de analizar la composicin de una disolucin que contiene una mezcla del indicador
Azul de Bromotimol en su forma molecular HA (cida) y disociada A (bsica), las cuales
presentan absorcin en
la
regin VISIBLE del espectro. Las propiedades
espectrofotomtricas del Azul de Bromotimol en ambas formas son diferentes, lo que
permite su cuantificacin en disoluciones en las que aparecen mezcladas. Para ello habr
que registrar los espectros de absorcin de las dos formas (cida y bsica) y obtener las
correspondientes rectas de calibrado a dos longitudes de onda seleccionadas.

MATERIALES Y REACTIVOS

Espectrofotmetro UV-Visible y 6 cubetas de plstico.

Matraces aforados de 10 mL
Vasos de precipitados de 100 mL
Pipetas graduadas de 10 mL y de 5 mL.
4 Frascos de almacenamiento.
-5
Disolucin de Azul de Bromotimol en medio cido (HA) de concentracin 5.10 M
-5
Disolucin de Azul de Bromotimol en medio bsico (A ) de concentracin 5.10 M
-2
Disolucin diluyente cida: HCl 10 M.
-2
Disolucin diluyente bsica: NaOH 10 M.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
a) Preparacin de disoluciones de la forma cida del Azul de Bromotimol:
Tomando como base una disolucin de partida, facilitada por el profesor, de Azul de
-5
Bromotimol 5.00.10 M en medio cido (HCl), preprense por dilucin las siguientes
disoluciones:
Disolucin A: En un matraz de 10 mL pipetear 8 mL de disolucin de partida y
enrasar con diluyente cido (HCl).
{ Disolucin B: En un matraz de 10 mL pipetear 6 mL de disolucin de partida y
enrasar con diluyente cido.
{ Disolucin C: En un matraz de 10 mL pipetear 4 mL de disolucin de partida y
enrasar con diluyente cido.
{ Disolucin D: En un matraz de 10 mL pipetear 2 mL de disolucin de partida y
enrasar con diluyente cido.
{

Nota: El pKa del azul de bromotimol es 7.30, al encontrarse en medio

cido no hay duda de que el indicador se encuentra totalmente bajo su
forma cida:

HA A H

(pKa=7.30)

b) Preparacin de disoluciones de la forma bsica del Azul de Bromotimol:

Tomando ahora como base una disolucin de partida, facilitada por el profesor, de
-5
-2
Azul de Bromotimol 5.00.10 M en medio bsico (NaOH 10 M), preprense por
dilucin las mismas disoluciones que en el apartado anterior pero ahora
enrasando con diluyente bsico (NaOH).

Nota: Como el pKa del indicador es 7.30 no hay duda de que ste se encuentra
-2
totalmente bajo su forma bsica en NaOH 10 M .

c) Obtencin de los espectros de la forma cida y bsica del indicador:

Para ello vamos a utilizar las disoluciones A respectivas preparadas anteriormente.
En cada caso, llenaremos una cubeta con la referencia adecuada y otra con la
muestra a medir. A continuacin, iremos midiendo el valor de la absorbancia de la
muestra a distintas longitudes de onda entre 400 y 680 nm, haciendo las medidas
a intervalos de 10 nm. Es importante tener en cuenta que, cada vez que se
modifique el valor de la longitud de onda, hay que ajustar de nuevo el cero de
absorbancia con la referencia.
Finalmente, se representan los datos en papel milimetrado, de manera que
figure la absorbancia A en ordenadas frente a longitud de onda en abcisas:

Forma
bsica

1.000

Forma cida

0.000
400

500

700

600

Longitud de onda / nm
d) Obtencin de las rectas de calibrado para las formas cida y bsica del Azul de
Bromotimol:
A la vista de los espectros de absorcin de la forma cida y bsica del
indicador, se apreciar un mximo para la forma bsica en torno a 620 nm y un
mximo para la forma cida alrededor de 440 nm. Elegidos estos valores de longitud
de onda como los mas idneos, se mide la absorbancia de cada una de las
disoluciones preparadas en el apartado a) (disoluciones de la A a la D), ajustando
previamente el cero de absorbancia a cada longitud de onda con la referencia
adecuada. Con los datos de Absorbancia se elaboran las dos
tablas
correspondientes, una para la forma cida y otra para la forma bsica, que sern del
tipo:

Disolucin
-1
C / mol L
Absorbancia a 440
Absorbancia a 620

A continuacin se representan en papel milimetrado los datos de las dos tablas

anteriores (absorbancia frente a concentracin) y se obtienen las 4 rectas de
calibrado que confirman el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer:

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

-5

c /10 M

Las rectas que se obtienen son del tipo y ax, de forma que al compararlas con la ley de
Lambert-Beer se deduce que:

pendiente

y
x

y2y 1
x2x 1

pendiente

de donde:

Como la longitud de la cubeta es de 1.00 cm se obtiene el valor de en M cm . Por tanto

habremos determinado las cuatro absortividades molares que estabamos buscando:
440
620
440
620
-1

HA

HA

-1

, A

e) Anlisis de una muestra desconocida de azul de bromotimol

A partir de una muestra facilitada por el profesor se trata de determinar las
concentraciones de HA y A que hay en la muestra. Para ello se medir la
absorbancia de la muestra a 440 y 620 nm y a partir de las ecuaciones
correspondientes se obtendrn las concentraciones de HA y A .

f) Comprobacin del pKa del azul de bromotimol

Con los datos obtenidos en el apartado anterior y recordando la ecuacin de
Henderson-Hasselbalch se puede calcular el valor del pKa del indicador:
A
A

pH pKa log

HA

pKa pH log

HA

por tanto sabiendo las concentraciones de HA y A y midiendo el pH de la muestra se

puede calcular el pKa.

Si la suposicin de que la absorbancia era aditiva es correcta, el pKa as obtenido ha

de cerrar con el pKa determinado potenciomtricamente para este indicador.
Sabiendo que el valor tabulado es de 7.30, podra discutir la validez de nuestras
suposiciones y calcular los errores relativos cometidos por el experimentador.

Bibliografa
CONNOR, K.A., "Curso de anlisis farmacutico", Ed. Revert. 1980.
MIONES, J., "Manual de tcnicas instrumentales", Crculo editor Universo.

1978.