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PRCTICA DE LABORATORIO N 12

INTRODUCCIN
La contaminacin de los alimentos es un problema serio para la
industria alimentaria, debido a que da lugar a la aparicin de productos
inaceptables para el consumo humano. La produccin industrial de
alimentos es un proceso que se desarrolla a gran escala, razn por la
cual las consecuencias de prdidas por contaminacin microbiana son
elevadas y altamente costosas. Este fenmeno generalmente es un
proceso mixto, en el que participan bacterias, levaduras y hongos
filamentosos; al mismo tiempo es un proceso competitivo, en el cual
prevalecen aquellos grupos que muestran la mayor adaptacin a las
condiciones ambientales, que se manifiestan en el producto en
particular. Comparadas con hongos filamentosos y bacterias, las
levaduras juegan un papel secundario en la descomposicin de
alimentos, sin embargo, existen determinadas condiciones relacionadas
con el proceso de preservacin de estos y su propio manejo, que pueden
favorecer el incremento en las poblaciones de levaduras dainas.
Las levaduras son consideradas generalmente como favorables cuando
se asocian a los alimentos, debido al papel que juegan en la obtencin
de productos y bebidas fermentables, entre los que se conocen la
fabricacin de pan y productos de pastelera; produccin de alcohol,
vinos y cidras, cervezas, entre otras bebidas. Esta imagen se ha
fortalecido en la actualidad por el descubrimiento en estos
microorganismos de capacidades nutricionales como son, la produccin
de vitaminas del complejo B, su uso como fuente de obtencin de
protenas para la alimentacin de animales y humanos y ms
recientemente, su uso como hospedero para la obtencin por vas de la
tecnologa del DNA recombinante de compuestos de gran utilidad para
la industria mdico farmacutica, como protenas virales para la
fabricacin de vacunas y otros inmunopotenciadores, hormonas,
interferones, protenas de la sangre y productos afines.
Es lgico pensar que bajo condiciones ptimas de crecimiento, las
poblaciones de bacterias superan el crecimiento de levaduras y hongos
filamentosos, debido a que poseen un tiempo de generacin ms corto.
Esto implica que las levaduras y mohos solo pueden competir con las
bacterias en la alteracin de los alimentos, cuando las condiciones
ambientales afectan de forma severa la actividad bacteriana. Existen
determinadas tcnicas para la preservacin de alimentos que daan el
crecimiento de las bacterias, pero al mismo tiempo favorecen el
crecimiento de las levaduras, lo cual est dado por el hecho de que
estos grupos son mucho ms resistentes a condiciones ambientales
estresantes; entre las que predominan baja actividad de agua, bajos
valores de pH por el uso de cidos orgnicos como preservantes
qumicos, bajos valores de temperatura y uso de antimicrobianos y otros
inhibidores naturales y sintticos. Existe otro problema que incrementa
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PRCTICA DE LABORATORIO N 12

la aparicin de contaminaciones en alimentos y bebidas por levaduras, y

son el uso de tecnologas modernas de elaboracin que utilizan
condiciones de procesamiento menos exigentes para mantener el sabor,
olor y color naturales, con el propsito de consumir productos cada vez
ms sanos, existe una tendencia a reducir el uso de preservantes y a la
produccin de alimentos bajos en caloras, en los cuales no existen
elevadas concentraciones de solutos, que reducen la actividad de agua
(aw) ejerciendo el efecto preservante, por lo que se favorece la aparicin
de levaduras contaminantes en siropes y concentrados de frutas y
vegetales.
Es justo destacar que el grupo de levaduras que se asocia
perjudicialmente a los alimentos es muy reducido: alrededor del 25 % de
las especies identificadas y de stas, un nmero muy bajo de forma
daina. Las levaduras asociadas a alimentos se clasifican en: no
perjudiciales y alteradoras.
Las levaduras alteradoras de alimentos, se definen como especies
particulares capaces de causar deterioro en alimentos y bebidas que han
sido procesados y empacados segn las Normas de Buenas Prcticas
para produccin, manejo y empaque de los alimentos.
Las fuentes de obtencin de alimentos ya sean animales o vegetales han
desarrollado mecanismos naturales para protegerse del ataque de
microorganismos en general, los cuales estn dados en parmetros
intrnsecos tales como el pH, humedad, contenido nutricional y
produccin de sustancias antimicrobianas naturales, que forman parte
de los tejidos y pueden permanecer de forma activa en alimentos
frescos.
La actividad contaminante de las levaduras sobre alimentos puede
inhibirse por dos vas; mediante la aplicacin de mtodos fsicos con
actividad bactericida, entre los que se destacan la esterilizacin por
calor a presin y por filtracin y por la aplicacin de condiciones
ambientales desfavorables con efecto bacteriosttico, tales como
disminucin de la aw, bajos valores de pH y temperatura.

OBJETIVOS
Comprender el rol que cumple el ambiente y manipuladores en la
condicin de los alimentos as como en el centro de salud
ocupacional.
Establecer la importancia de la educacin sanitaria en la
proteccin de los productos alimenticios as como la limpieza y
desinfeccin de ambientes de trabajo.
Capacitacin respecto la higiene, BPM o GMP y las placas
operativas de manipulacin y procesamiento de alimentos.

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FUNDAMENTO TEORICO
CRECIMIENTO MICROBIANO EN SUPERFICIES
Las superficies suelen tener considerable importancia como hbitat
microbiano debido a que adsorben nutrientes. En el microambiente de
una superficie, las concentraciones de nutrientes pueden ser muy
superiores a las de toda la solucin. Como consecuencia, la
concentracin de microorganismos que crecen en una superficie suele
ser mayor que la concentracin de los que viven en el agua.
Los portaobjetos sirven de superficies experimentales sobre las cuales
se adhieren y crecen los microorganismos. Si se sumergen un
portaobjetos en un hbitat microbiano, se le deja durante un tiempo y
luego se examina al microscopio, se hace evidente la importancia de las
superficies para el crecimiento de los microorganismos. Sobre dichas
superficies se desarrollan rpidamente microcolonias, de la misma
manera que lo hacen en las superficies naturales. La velocidad de
crecimiento de microorganismos adheridos a una superficie en la
naturaleza puede medirse mediante el examen microscpico peridico
de portaobjetos sumergidos.
La superficie de adherencia puede ser tambin un nutriente, como
ocurre con las partculas de materia orgnica, donde los
microorganismos adheridos catabolizan los nutrientes directamente de
la superficie de la partcula. El material procedente de las plantas
muertas, por ejemplo, es colonizado muy pronto por los
microorganismos del suelo, y mediante tcnicas sencillas de tincin se
detectan poblaciones microbianas adheridas a la superficie slida.

Biofilmes: estructura
Los microorganismos crecen incluidos en biofilmes. Son microcolonias
revestidas de clulas bacterianas adosadas a una superficie mediante
polisacridos adhesivos excretados por las propias clulas. Los biofilmes
atrapan nutrientes para el crecimiento de las poblaciones microbianas y
ayudan a impedir el desprendimiento de las clulas que crecen sobre las
superficies expuestas a corrientes de lquido. Los biofilmes presentan
tpicamente numerosas capas de microorganismos, cada una de las
cuales pueden ser observadas por microscopa lser confocal.
La comunicacin clula a clula es esencial en el desarrollo y
mantenimiento de un biofilme. La adherencia de una clula a una
superficie es una seal para la expresin de genes especficos de un
biofilme. Estos genes codifican protenas que codifican protenas que
sintetizan molculas que actan como seales para la unin clula a
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PRCTICA DE LABORATORIO N 12

clula y el inicio de la formacin de polisacrido. En Pseudomonas

aeruginosa, notable formadora de biofilmes, las molculas que actan
como seal son compuestos denominados homoserina lactonas. A
medida que se van acumulando, estas molculas actan como agentes
quimio tcticos que atraen clulas de P. aeruginosa mediante un
mecanismo denominado percepcin de quorum (quorum sensing),
dando lugar al desarrollo del biofilme. P. aeruginosa interviene en la
fibrosis qustica, enfermedad debida a la formacin de un biofilme en los
plumones, cuyos sntomas son parecidos a la neumona.

Biofilmes: consecuencias y control

El desarrollo de biofilmes tiene implicaciones significativas en la salud
humana y en diversas industrias (p. ej., en la industria alimentaria o
cosmtica). En el cuerpo, las clulas bacterianas de un biofilmes se
encuentran protegidas ante ataques del sistema inmunitario y los
antibiticos, y otros agentes antimicrobianos, suelen fracasar en el
intento de penetrar en el biofilme. Adems en la fibrosis qustica, los
biofilmes aparecen en diversas alteraciones dentales, entre ellas la
periodontitis, en la formacin de clculos en el rin, en la tuberculosis,
en la legionelosis y en infecciones por Staphylococcus. Los implantes
mdicos son tambin, por desgracia, medios excelentes para el
desarrollo de biofilmes. Entre ellos se incluyen los catteres urinarios, as
como las implantes alargo plazo tales como las articulaciones artificiales.
Se estima que en Estados Unidos, 10 millones de personas al ao sufren
infecciones por biofilmes debidas a implantes u otros procedimientos
mdicos intrusivos. Los biofilmes son la razn de que la rutina en la
higiene dental sea tan importante. La placa dental es un biofilme tpico y
contiene bacterias productoras de cido responsables de la caries
dental.
En la industria, los biofilmes pueden reducir el flujo de agua, aceite o
cualquier otro lquido que circule a travs de tuberas y acelerar la
corrosin del propio tubo. Tambin inician la degradacin de los objetos
sumergidos, tales como componentes estructurales de plataformas
petrolferas, barcos e instalaciones costeras. La calidad del agua potable
puede verse afectada por los biofilmes que se forman en los conductos
de distribucin, algunos de los cuales, en Estados Unidos, tiene de 50 a
100 aos. Aunque las bacterias que se encuentran en los conductos de
agua son en su mayora inocuas, si algunas patgenos consiguieran
colonizar el biofilme, la cloracin estndar podra ser insuficiente para
matarlos. La liberacin peridica de clulas puede llevar a brotes de
enfermedad. Existe preocupacin por la posibilidad de que Vibrio
cholerae, el agente causante del clera, pueda ser dispersado de esta
manera.

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PRCTICA DE LABORATORIO N 12

El control de biofilmes requiere un gran esfuerzo y hasta el momento

slo se dispone de un repertorio limitado de instrumentos para
combatirlos. La industria dedica miles de millones cada ao al
tratamiento de tuberas y otras superficies para mantenerlas limpias de
biofilmes. En la estrategia de lucha contra estos invasores, se incluye el
descubrimiento de nuevos antibiticos capaces de penetrar en ellos y
frmacos que interfieren en la comunicacin intracelular y la
consecuente formacin de biofilmes. En este ltimo aspecto hay una
clase de productos qumicos, las furanonas, que en las pruebas
experimentales han dado resultados alentadores. Como las furanonas
son compuestos estables y no txicos para los humanos, tambin
pueden tener aplicacin como agentes antibiofilme en medicina.

METODOLOGA
Materiales a usarse en los experimentos

Placas Petri
ensayo

Mechero Bunsen
analtica

Tubos de

Balanza

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Esptula de drigalsky
Incubadora

Torundas
Bao Mara

LABORATORIO N12

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Pipeta

Reactivos usados en los experimento

10 mL de agua
peptonada (0.1 %) +
Tween 80 (1%)
10 mL de agua
peptonada al 0.1
%.
Agar TSA
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Agar ENDO
Agar m Enterococos
Agar Manitol salado
Agar Sabouraud Dextrosa
(4%)

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Mtodo del hisopo o torundas (Swab)
1. Humedecer los hisopos
estriles en 10 mL de
agua
peptonada
+
tween 80.
2. Elegir una superficie de
muestra (o rea de
muestreo) y delimitarla
con la
plantilla
de
aluminio.
3. Tomar el primero de tres
hisopos a usar y frotar
la superficie con una
inclinacin de 30 en
lneas verticales.
4. Seccionar la porcin del
hisopo que contiene la
muestra para sumergirla
en 10 mL de agua
peptonada.
5. Tomar
un
segundo
hisopo y proceder a
frotar esta vez en lneas
horizontales.
6. Repetir el paso 4.
7. Tomar el tercer hisopo y
frotar ahora de forma
oblicua (de esta manera
se asegura cubrir gran

2. Control de manipuladores
LABORATORIO N12

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parte
del
rea
delimitada).
8. Repetir el paso 4.
9. Agitar el tubo con las
tres secciones durante
20 (este proceso se
lleva
a
cabo
para
realizar la revivificacin
de los microrganismos).
10. Tomar 0.1 mL del
agua con las muestras,
para cada medio de
cultivo a incubar: Agar
TSA,
ENDO,
mEnterococos,
Manitol
Salado
y
Sabouraud
Dextrosa (4%).
11. Incubar a 35 37 C
por 48 h (con placas
invertidas) a todos los
medios menos el agar
Sabouraud.
12. El agar Sabouraud se
incubar a 20 24 C
(temperatura ambiente)
por 5 das, con las
placas sin invertir.

PRCTICA DE LABORATORIO N 12

1. Elegir como superficie

de muestra la mano de
un compaero.
2. Humedecer un hisopo
esterilizado en 10 mL de
agua
peptonada
+
tween 80.
3. Frotar
la
superficie
externa e interna (la
palma), las zonas entre
los dedos, las yemas de
los dedos y las uas.
4. Seccionar la porcin del
hisopo que contiene la
muestra para sumergirla
en 10 mL de agua
peptonada.
5. Agitar el tubo con la
seccin
del
hisopo
durante 20.

6. Tomar 0.1 mL del agua

con las muestras, para
cada medio de cultivo a
incubar:
Agar
TSA,
ENDO, m-Enterococos,
Manitol
Salado
y
Sabouraud
Dextrosa
(4%).
7. Incubar a 35 37 C por
48
h
(con
placas
invertidas) a todos los
medios menos el agar
Sabouraud.
8. El agar Sabouraud se
incubar a 20 24 C
(temperatura ambiente)
por 5 das, con las
placas sin invertir.

3. Control de ambientes
1. Elegir
una
zona
estratgica
para
exposicin de los agares
al aire.
2. Colocar
los
medios
indicados
en
dichas
zonas.

LABORATORIO N12

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3. Abrir
las
tapas
y
exponer los agares por
15.
4. Cerrar las tapas.
5. Incubar las placas para
bacterias a 35 37 C
por 48 h (invertidas).
6. Incubar las placas para
hongos a 20 24 h por
5 das (sin invertir).

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PRCTICA DE LABORATORIO N 12

OBSERVACIONES/RESULTADOS
Manipuladores
Bacterias:
Medio

Nmero de
colonias
148

Agar TSA
Agar
Manitol
salado
Agar
mEnterococos
Agar Endo

Caractersticas
Colonias cremas amarillentas,
circulares.
Colonias cremas blanquecinas

Hongos y levaduras:
Medio
Sabouraud
Mohos
Levaduras

Numero de mohos y/o

levaduras
1
-

Caractersticas
pequeo
blanquecino

Superficies
Bacterias:
Medio
Agar TSA
Agar
Manitol
salado
Agar
mEnterococos
Agar Endo

Nmero de
colonias

Caractersticas

Hongos y levaduras:
Medio
Sabouraud
Mohos
Levaduras

Numero de mohos y/o

levaduras
1
1

Caractersticas
pequeo
Color anaranjado

Ambiente
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PRCTICA DE LABORATORIO N 12

Bacterias:
Medio

Nmero de
colonias
incontable

Agar TSA
Agar
Manitol
salado
Agar
mEnterococos
Agar Endo

Caractersticas
Colonias diseminadas por la
superficie.
Colonias cremas blanquecinas

Hongos y levaduras:
Medio
Sabouraud
Mohos
Levaduras

Numero de mohos y/o

levaduras
8
7

Caractersticas
Blancos y verdosos,
medianos y chicos
Blanquecinas y verdosas

DISCUSION Y CONCLUSIONES
Hubo crecimiento, lo que significa que hay hongos el ambiente lo
cual nosotros no lo percibimos al igual que las levaduras.
El ambiente del laboratorio no se puede decir que es estril debido
a los resultados de las muestras lo cual indica que cualquier
prueba microbiana en el laboratorio puede que nno sea muy
precisa.
Aprendimos el mtodo del hisopado o torundas, control de
manipuladores y control de ambientes detalladamente.
En los resultados obtenidos segn las tablas de los lmites
mximos permisibles las manos de muestra estn contaminadas.
En cuanto a la superficie demuestra que existe contaminacin por
enterococos por bacterias hetertrofas (> limite RAM).

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RECOMENDACIONES
Tener cuidado con los hisopo, estos no deben ser contaminados.
Diseminar cerca del mechero para evitar que se contamine.
Desinfectar la esptula de Durham antes de diseminar las
muestras en lo agares.
Tener siempre el control microbiolgico del medio donde
laboramos.
Manejar con cuidado los instrumentos de vidrio.

BIBLIOGRAFIA
Raquel Granados Prez, Bacteriologa. Medios de cultivo y pruebas
bioqumicas. Micologa General. Parasitologa General Tomo ll,
Segunda Edicin, Paraninfo, Madrid, 2003.
Alonso Urmeneta y otros. Manual Prctico de Microbiologa.
Raquel Granados Prez, Bacteriologa. Medios de cultivo y pruebas
bioqumicas. Micologa General. Parasitologa General Tomo l,
Segunda Edicin, Paraninfo, Madrid, 2003.

ANEXOS
Galera

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