Manual de Inmunología 2013

BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
MANUAL DE LABORATORIO DE
INMUNOLOGA
INDICE
NMERO DE LA
PRCTICA
TITULO DE LA PRCTICA
PGINA
Prctica 1
Diluciones
Prctica 2
Toma de muestra
Prctica 3
Observacin de leucocitos (cuenta diferencial)
10
Prctica 4
Determinacin de grupo sanguneo
12
Prctica 5
15
Prctica 6
Determinacin del ttulo de anticuerpos ABO del

suero.
Pruebas cruzadas
Prctica 7
Diagnstico serolgico de infecciones bacterianas
20
17
(Reacciones febriles)
Prctica 8
Diagnstico serolgico de sfilis
23
Prctica 9
Factor reumatoide
27
Prctica 10
Protena C reactiva
29
Prctica 11
Determinacin de antiestreptolisinas
31
Prctica 12
Determinacin de la hormona gonadotropina
34
corinica humana
Bibliografa
36

PRCTICA No. 1
DILUCIONES
Introduccin
Se les llama diluciones a las soluciones con concentracin menor obtenidas al agregar
volmenes conocidos de diluyente a una solucin de concentracin conocida. Las diluciones
se expresan en forma de una proporcin, por ejemplo 1/10 (1:10) donde la primera cifra o
numerador (1) corresponde al volumen de lo que se est diluyendo y la segunda cifra o
denominador (10) al volumen total en que se encuentra.
Objetivo
Aprender a calcular diluciones en forma directa o en serie.
Desarrollo
As, una dilucin 1/10 indica que se tiene un volumen de la solucin original contenido o
diluido en 10 volmenes totales, de los cuales 9 corresponden al diluyente. Dado que en una
dilucin lo que se indica es la relacin entre el volumen de la solucin original y el volumen
total en que se encuentra, una dilucin 1/10 puede prepararse de diferentes maneras:
Por ejemplo:
1 mL de muestra en 9 mL de diluyente
0.1 mL de muestra en 0.9 mL de diluyente
0.5 mL de muestra en 4.5 mL de diluyente
En la prctica el clculo de las diluciones se puede efectuar de dos maneras diferentes

que cumplen ciertas expectativas, la dilucin directa y la dilucin en serie.
Dilucin directa.
Para realizar una dilucin directa se puede hacer uso de la siguiente expresin:
1/d=Vm/Vt
donde 1/d= dilucin

Vm= volumen de muestra
Vt= volumen total (volumen de diluyente + volumen de muestra)
Ejemplo N1
Lleve 5 mL de muestra a una dilucin 1/10.
Sustituyendo los valores conocidos tenemos:
1/d=1/10
Vm=5 mL
Vt= ?
As:
1/10=5 mL/Vt
despejando Vt tenemos que Vt=10 x 5/1=50 mL
volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra
volumen de muestra = 50-5 = 45 mL
Ejemplo N2
Prepare exactamente 200 mL de una dilucin 1/50.
Sustituyendo los valores conocidos tenemos:
1/d=1/50
Vm=?
Vt= 200 mL
As:
1/50=Vm/200
Despejando Vm tenemos que Vm=200 x 1/50=4 mL
Volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra
Volumen de diluyente = 200-4=196 mL
4
Sin embargo, las diluciones directas tienen el inconveniente de que cuando es

necesario hacer una dilucin alta por ejemplo 1/ 10 000, se desperdicia mucho reactivo o se
incurre en un error de medicin. As, una dilucin 1/ 10 000 se preparara con 1 mL de
muestra y 9 999 mL de diluyente o bien 9.999 mL de diluyente y 0.001 mL de muestra.
Dilucin seriada
Este tipo de dilucin soluciona los inconvenientes que presenta el clculo directo de
las diluciones altas. Adems, en microbiologa permite el clculo de la poblacin microbiana
en la muestra de estudio, de la cual se toma una alcuota que se diluye en varios tubos y se
siembra por vertido en placa (ver figura 1). La diferencia entre la dilucin de dos tubos
consecutivo se conoce como factor de dilucin, siendo 2, 4 y 10 los ms usados. En el
ejemplo de la dilucin 1/ 10 000, la muestra se puede diluir 1/ 100 (Vm= 0.1 mL + 9.9 de
diluyente Vt= 10 mL) en un primer tubo y colocar 0.1 mL de esta dilucin en un segundo
tubo con 9.9 de diluyente. El segundo tubo tendr una dilucin 1/ 100, sin embargo como la
muestra ya se encuentra diluida previamente 1/ 100, multiplicando sus denominadores
tenemos:
1/ 100 x 1/ 100= 1/ 10 000
Figura 1.Esquema e diluciones seriadas
En este caso el factor de dilucin es de 100. Debe insistirse en que solo el primer tubo
lleva la alcuota de la muestra sin diluir, los dems tubos toman la alcuota ya diluida del tubo
previo. El nmero de tubos y las diluciones intermedias se plantean considerando el volumen
de los tubos as como el volumen mnimo que se puede medir fcil y exactamente con las
pipetas disponibles.
Cuestionario
1. Cmo lograr exactamente 40 mL de una dilucin 1:40000?
2. Obtener 60 mL de una dilucin 108
3. Prepara 5 mL de una dilucin 1:100000, utilizando diluciones seriadas
4. Qu dilucin se obtendr si mezclo 2 mL de muestra en 58 mL de diluyente?
5. Para realizar diferentes pruebas de diagnstico, usted requiere 500 l de una dilucin
1:30 000 de una muestra de suero y solamente cuenta con 4 mL de solvente.
Utilizando diluciones seriadas indique como obtendra dicha dilucin.

PRCTICA No. 2
TOMA DE MUESTRA
Introduccin
En el laboratorio de inmunologa la muestra a estudiar es principalmente sangre y sus
derivados suero o plasma. En el plasma o suero se determina principalmente la presencia de
anticuerpos, los cuales desde el descubrimiento de la alta especificidad de las reacciones
antgeno-anticuerpo
(Ag-Ac),
se
comprueban
con
propsitos
de
diagnstico
(inmunodiagnstico).
Inicialmente los investigadores se dedicaron a la deteccin de anticuerpos en el suero

del paciente como un signo de infeccin y as a la identificacin serolgica del
microorganismo. Sin embargo, hoy en da la sensibilidad y especificidad de los
inmunoensayos permiten no solo la deteccin de anticuerpos contra una amplia variedad de
organismos infecciosos incluyendo bacterias, parsitos, hongos y virus sino a la identificacin
del propio microorganismo.
An ms, proporcionan un medio para la deteccin y cuantificacin de antgenos no

infecciosos y anticuerpos de importancia clnica tales como la determinacin del grupo
sanguneo, el VDRL, la determinacin de la protena C-reactiva, una prueba que seala un
proceso inflamatorio agudo, la deteccin de antgenos asociados a tumores y la demostracin
de la hormona gonadotropina corinica, una prueba diagnstica del embarazo.
Objetivo
Aprender el procedimiento apropiado para la obtencin de sangre venosa de las venas del
dobles del codo.
Desarrollo
Obtencin de muestra de sangre. Para efectuar anlisis serolgicos, las muestras de sangre
pueden ser de sangre capilar o perifrica y de sangre venosa. Sangre capilar o perifrica. La
sangre capilar o perifrica es la que fluye despus de aplicar una puncin superficial cutnea.
Se puede obtener de la yema del dedo. Algunas pruebas pueden realizarse con sangre capilar
o perifrica y se aconseja cuando no es posible obtener una muestra de sangre venosa o no se
desea puncionar la vena.
Sangre venosa. Esta muestra se obtiene por puncin de una de las tres venas del
pliegue del codo: la baslica, la ceflica o la mediana cubital. Se emplean jeringas desechables
con agujas de tipo 21x32, 20x32 o el sistema para la extraccin de sangre intravenosa al vaco
Vacuntainer . Previamente se realiza la limpieza del rea elegida con torunda y alcohol.
Antes de puncionar se coloca el torniquete aproximadamente a 8 cm de distancia arriba del
pliegue del codo. No debe olvidar soltarlo tan pronto empiece a obtenerse la muestra. La
cantidad mxima de sangre a extraer ser estrictamente la necesaria para las pruebas.
Anticoagulantes. Los anticoagulantes ms usados son el citrato de sodio, oxalato de
sodio y EDTA. El citrato de sodio se emplea al 3.8% y el oxalato de sodio al 1.4%. Se usan en
relacin de una parte de anticoagulante por cada nueve partes de sangre, habitualmente se
usan 0.25mL de la solucin para completar a 2.5mL de volumen total con la muestra de
sangre. El EDTA (cido etilen-diamino-tetra-actico) se utiliza al 10% y es uno de los
anticoagulantes de eleccin para el trabajo de rutina (ver figura 2).
Manejo y conservacin de la muestra. La muestra debe rotularse correctamente y
separase segn el caso en plasma o suero, y dependiendo del tipo de anlisis debe analizarse
inmediatamente o puede conservarse adecuadamente refrigerada entre 4 y 8C
anlisis posterior.
para el
Figura 2. Tubos del sistema vacutainer
Cuestionario
1. Explique la diferencia entre suero y plasma.
2. Es importante solicitarle al paciente que se presente en condiciones de ayuno para la
realizacin de pruebas diagnsticas no metablicas?
3. Mencione pruebas de laboratorio en donde se utilice plasma y en donde se requiera de
suero.
4. Qu concentracin de NaCl se usa en la preparacin de solucin salina isotnica?
5. Mencione los factores que pueden causar hemlisis en las muestras.

PRCTICA No. 3
CUENTA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS
Introduccin
Los cinco principales tipos de leucocitos son los neutrfilos (50-70%), los eosinfilos (1-5%),
basfilos (0.5-1.0%), linfocitos (20-30%), y monocitos (2 6%). Por cuenta diferencial se
entiende la determinacin del porcentaje relativo de cada tipo de leucocito en una muestra de
sangre. Se realiza en extendidos (frotis) preparados cuidadosamente y teidos con colorantes
tales como Wright, el cual tie el ncleo de los leucocitos de un color prpura que facilita la
diferenciacin (ver figura 3).
Figura 3. Tipos de leucocitos
Objetivo
Identificar los diferentes tipos de leucocitos en un frote teido
10
Material y equipo
Portaobjetos
Lancetas desechables
Algodn
Colorante de Wright
Solucin reguladora pH 6.4
Microscopio
Desarrollo
1. A partir de la muestra de sangre preparar 2 extendidos (frotis) siguiendo las
indicaciones del instructor.
2. Dejar secar completamente los frotis, colocar en un puente de tincin y cubrirlos
(contar el nmero de gotas) con colorante de Wright. Dejar el colorante 1 minuto y
aadir el mismo nmero de gotas de solucin reguladora pH 6.4 durante 8 minutos.
3. Lavar suavemente la preparacin por 30 segundos y secar el exceso de agua.
4. Cuando la preparacin est completamente seca, colocar
una gota de aceite de
inmersin y observar al microscopio.

5. Para facilitar la identificacin consultar las lminas a color que ilustran los diferentes
leucocitos.
Cuestionario
1. Elabore una tabla que muestre la principal participacin en la respuesta inmunitaria de
cada una de las clulas blancas.
2. Investigue otra tcnica de tincin diferente a la de Wright.
3. Seale los porcentajes normales de los diferentes tipos de leucocitos que se encuentran
en sangre.
4. Indique cual es la poblacin de leucocitos que predominantemente aumenta en el caso
de infecciones causadas por bacterias, parsitos, hongos, virus.
5. Qu indicara una neutrofilia en un paciente?
11

PRCTICA No. 4
DETERMINACIN DEL GRUPO SANGUNEO
Introduccin
Alrededor de 1900 Karl Landsteiner descubri que en el humano existen cuatro tipos de
sangres con respecto a la presencia o ausencia de dos antgenos especficos denominados A y
B. Estos cuatro grupos se conocen actualmente como tipos A, B, AB y O. Este ltimo se
caracteriza por la ausencia de los antgenos A y B. En 1940 Landsteiner y Wiener reportaron
que el suero de conejo producido contra eritrocitos de mono Rhesus poda aglutinar los
eritrocitos del 85% de una poblacin caucsica. Este antgeno se design inicialmente como
factor Rh, posteriormente se encontr que existe como seis antgenos a los cuales Fisher y
Race designaron con letras C, D, E, c, d, e. Uno de estos antgenos, el D es responsable de la
condicin Rh positivo. La tipificacin de eritrocitos en el laboratorio se realiza con antisueros
especficos contra los antgenos A, B y D, y puede realizarse por mtodos en tubo o en
portaobjetos (ver figura 4).
Figura 4. Sistema ABO
12
Objetivo
Demostrar por medio de una reaccin de aglutinacin la presencia de los Ag eritrocitarios A,
B y D.
Materiales y equipo
Muestras de sangre con anticoagulante
Pipetas graduadas de 1 y 5 mL
Tubos de ensayo de 10 X 75 mm
Solucin salina isotnica
Aplicadores de madera o palillos
Sueros tipificadores anti-A
anti-B
anti-D (Rh)
Placa oscilatoria
Desarrollo
Mtodo en tubo
1. Se obtiene aproximadamente 5 mL de sangre venosa y se colocan en un tubo con

EDTA (0.1 mL de EDTA al 1% por cada mL de sangre). Se centrfuga por 2 min. a
2000 r.p.m. para separar el plasma del paquete celular.
2. Se toman 0.1 mL del paquete celular y se resuspenden en 1.9 mL de solucin salina
para una suspensin aproximada del 5%.
3. Se marcan tres tubos de la siguiente manera: anti-A, anti-B y anti-D, y se agrega una
gota del suero tipificador segn corresponda.
4. Se agregan 4 gotas de la suspensin de eritrocitos a cada tubo y se agitan suavemente.
5. Los tubos se centrifugan 1 min a 2000 r.p.m.
6. Se busca la presencia de aglutinacin agitando suavemente los tubos. La aglutinacin
se reconoce por la formacin de grumos.
7. Si la prueba en el tubo anti-D es negativa se realiza el siguiente procedimiento.
8. Se incuba a 37C por 30 minutos, se centrfuga y se busca la aglutinacin.
9. Si persiste la negatividad se lavan los eritrocitos 3 veces con 0.5 mL de solucin salina
y se elimina perfectamente el sobrenadante.
13
10. Se agrega una gota del suero de Coombs y se agita suavemente, se centrfuga y se
busca la aglutinacin
Interpretacin:
Si aglutina en el paso 6 es Rh positivo
Si aglutina en el paso 10 es Du
Si persiste la negatividad es Rh negativo.
Mtodo en portaobjetos
1. Depositar 2 gotas de sangre en tres diferentes divisiones de un portaobjetos.

2. Agregar de izquierda a derecha una gota del antisuero anti-A, una gota de anti-B y
una gota de anti-D respectivamente.
3. Mezclar los reactivos con un aplicador de madera diferente para cada gota.
4. Agitar suavemente en la placa oscilatoria.
5. Buscar la presencia de aglutinacin.
Cuestionario
1. Cuntos sistemas existen para clasificar a la sangre?
2. Cmo defines aglutinacin y cules son sus ventajas y desventajas?
3. Puede una persona de grupo A y una B tener como descendencia a un hijo de grupo
O? Explique
4. Mencione las ventajas y desventajas de determinar el grupo sanguneo por los dos
mtodos empleados en la prctica.
5. Qu
es
el
factor
Du
qu
14
funcin
tiene
el
suero
de
Coombs?

PRCTICA No. 5
DETERMINACIN DEL TITULO DE ANTICUERPOS ABO DEL
SUERO.
Introduccin
El sistema de grupo sanguneo ABO posee una caracterstica nica; la presencia de
anticuerpos fuertemente reactivos en el suero de los que carecen
de los antgenos
correspondientes. Estos anticuerpos pertenecen a la clase IgM y son producidos en respuesta

a una inmunizacin. Se dice que estos anticuerpos se producen de manera natural en base
a que los inmungenos son probablemente de origen bacteriano, dado que algunas bacterias
presentan sustancias similares a los antgenos A o B.
El ttulo es una medida relativa de anticuerpos o antgenos en una reaccin
serolgica. Se determina realizando a partir del suero problema diluciones seriadas. El ttulo
de anticuerpos A o B del suero se reporta como el recproco de la mxima dilucin en la cual
es posible observar eritrocitos aglutinados.
Objetivo
Establecer a travs de diluciones seriadas el concepto de ttulo aplicado en las reacciones
serolgicas
Material
Suspensin de eritrocitos de grupo A o B al 5 % en SSI
Suero (plasma) de grupo O
Pipetas graduadas de 1 y 5 mL
Tubos de ensayo de 10 X 75 mm
15

Sueros tipificadores anti-A
anti-B
Desarrollo
1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos rotulados del 1 al 6 y se agregar 0.1 mL
de solucin salina cada uno de ellos.
2. Agregar 0.1 mL del suero problema al tubo n 1, mezclar bien y transferir 0.1 mL al
tubo n 2 y as sucesivamente hasta el tubo n 6 del cual se desechan 0.1 mL.
3. Agregar 4 gotas de la suspensin de eritrocitos a cada tubo y mezclar.
4. Incubar a 37C por 15 minutos, mezclan suavemente y centrifugar a 1000 r.p.m.
durante 1 minuto.
5. Desprender el botn suavemente y buscar la presencia de aglutinacin.
Interpretacin
1. El ttulo de anticuerpos en el suero problema se determina como el recproco de la

dilucin mxima en la que se observa aglutinacin.
2. Adems de la aglutinacin se puede observar hemlisis, por lo que se debe comprobar
la presencia de hemoglobina libre
Cuestionario
1. Cul es la dilucin utilizada en cada uno de los tubos?
2. Explique porqu puede variar el ttulo de Ac en la muestra para cada paciente
3. Qu es lo que se diluye en cada uno de los tubos para la cuantificacin, los Ac o los
eritrocitos?
4. Porque es importante determinar el ttulo de anticuerpos en una muestra serolgica.
5. Cite tres ejemplos de pruebas serolgicas donde la determinacin del ttulo de
anticuerpos ayude en el diagnstico y vigilancia de una determinada enfermedad.
16

PRCTICA No. 6
PRUEBAS CRUZADAS
Introduccin
El objetivo de una transfusin es el proporcionar al paciente (receptor) el tipo preciso de
sangre. Por supuesto este objetivo es difcil de lograr, pero es posible aproximarse mucho si
se realizan las pruebas correctas de hemaglutinacin. En primer lugar, deben determinarse con
exactitud los anfgenos de los grupos sanguneos principales: el grupo ABO y el Rh del
paciente, sobre la base de estos grupos se selecciona la unidad de sangre de grupo ABO y Rh
compatible y se procede a efectuar las denominadas pruebas cruzadas mayor y menor.
La prueba cruzada mayor, denominada prueba de compatibilidad, se realiza mezclando

el suero del receptor con los eritrocitos del donador. Si se produce hemaglutinacin, esta
sangre no puede darse al receptor porque tiene anticuerpos capaces de reaccionar y destruir la
sangre administrada. En la prueba cruzada menor, los eritrocitos del receptor son incubados
con suero del donador y se observa si hay aglutinacin. Si se produce hemaglutinacin, la
sangre del donador no debe administrase (ver figura 5).
En ambas pruebas una suspensin de los eritrocitos respectivos se mezclan con el

suero y la mezcla se incuba a 37C durante unos 30-60 minutos. Despus del periodo de
incubacin los eritrocitos se lavan para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los
eritrocitos, y se aade el reactivo de Coombs (anti-globulina).
Objetivo
Realizar las pruebas de compatibilidad sangunea denominadas Pruebas Cruzadas
Material
Muestras de sangre con y sin anticoagulante
Pipetas graduadas de 1 mL y 5 mL
17
8 tubos de ensaye de 10 X 75 mm
Solucin salina isotnica.
Bao serolgico
Centrfuga
Solucin de albmina bovina al 10%
Desarrollo
1. Se obtiene una muestra de sangre del donador y receptor .
2. Se disponen 4 tubos etiquetados como sigue:
PM/S =Prueba Mayor en solucin salina
pm/s
=Prueba Menor en solucin salina
PM/A =Prueba Mayor en albmina

pm/a =Prueba Menor en albmina
3. Se agregan a cada tubo los siguientes reactivos en el orden indicado:
PM/S.
2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del donador
pm/s.
2 gotas del suero del donador + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del receptor
PM/A.
2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de albmina + 1 gota de eritrocitos (al
5%) del donador
pm/a.
2 gotas del suero del donador + 4 gotas de albmina + 1 gota de eritrocitos (al
5%) del receptor
4. Se mezclan bien y se incuban a 37C por 30 minutos.

5. Se centrifugan 1 minuto a 2000 r.p.m. y se busca la presencia de aglutinacin.
6. En caso de que no se presente la aglutinacin, los tubos se centrifugan nuevamente y
se descarta el sobrenadante. Se lava el paquete celular de cada tubo con 1 mL de
solucin salina y se centrifuga nuevamente descartando el sobrenadante. Repetir el
lavado 2 veces.
7. Al paquete celular se le agrega una gota del suero de Coombs
8. Se centrifugan 1 minuto a 2000 r.p.m. y se busca la presencia de hemaglutinacin
18
Figura 5. Compatibilidad entre grupos sanguneos
Interpretacin:
Si hay aglutinacin en cualquiera de los tubos, ser indicativo de que hay
incompatibilidad entre el posible donador y el receptor (paciente). Si no la hay, las sangres
son compatibles.
Cuestionario
1. Qu significa una prueba cruzada positiva y una negativa?
2. Qu factores pueden interferir en los resultados de una prueba cruzada?
3. Qu caractersticas debe tener un donador sanguneo ideal?
4. Cul es el objetivo de utilizar a la albmina?
5. Porque a las personas con grupo O Rh positivo se les conoce como donadores
universales? Esto es correcto?
19

PRCTICA No. 7
DIAGNSTICO SEROLGICO DE INFECCINES BACTERIANAS
(REACCIONES FEBRILES)
Introduccin
La aglutinacin de clulas bacterianas con antisueros es una de las pruebas serolgicas ms
antiguas de la inmunologa prctica. Se inici como un mtodo para el diagnstico de las
infecciones bacterianas y fue propuesta por Widal en 1896. La pruebas de aglutinacin
bacteriana tienen dos aplicaciones principales en el diagnstico; las clulas bacterianas
desconocidas pueden identificarse por medio de anticuerpos conocidos, o bien utilizando
bacterias conocidas pueden identificarse los anticuerpos en el suero del paciente.
La identificacin bacteriolgica completa del agente patgeno es un proceso que lleva

tiempo (3 o ms das), mientras se intenta el reconocimiento del agente es posible la
identificacin serolgica. En la aglutinacin de los antgenos bacterianos con sus anticuerpos
portaobjetos produce un agregado macroscpico (ver figura 6).
Objetivo
Demostrar en el suero problema anticuerpos contra los antgenos bacterianos.
Material
Muestras de sueros problema
Placa de vidrio marcada en 6 cuadros
Pipetas graduadas de 1 y 0.2 mL
Pipeta Pasteur
Placa oscilatoria
Equipo con antgenos:
20
O de Salmonella typhi
H de Salmonella typhi
H de Salmonella enteritidis Paratyphi A
H de Salmonella enteritidis Paratyphi B
Brucella abortus
Proteus OX-19
Figura 6. Aglutinacin en placa
Desarrollo:
1. En una placa de vidrio perfectamente limpia se depositan 0.08 mL del suero problema
en cada una de las seis divisiones.
2. Se agrega una gota de cada antgeno comenzando por la izquierda arriba, respetando el
orden establecido.
3. Se mezclan las gotas con palillos diferentes y se agita suavemente en la placa de
rotacin durante dos minutos.
4. La lectura se hace observando la aglutinacin macroscpica.
5. Si aparece aglutinacin con alguno de los antgenos, continuar con el siguiente paso.
6. Se toma otra placa y se depositan 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, y 0.005 mL del suero
problema.
7. Se agrega una gota del antgeno seleccionado, se mezclan con un palillo y se revisa la
presencia de aglutinacin.
21
Interpretacin:
1. Los volmenes de suero empleados corresponden respectivamente a diluciones 1/20,

1/40, 1/80, 1/160 y 1/320.
2. El ttulo de anticuerpos del suero problema se reporta como el recproco de la mxima
dilucin que muestra aglutinacin.
3. La mayora de los ttulos mayores de 160 son presuntivos de infeccin.
4. La mejor indicacin de una infeccin activa es un aumento en el ttulo de dos
determinaciones sucesivas con una diferencia
de 5-7 das concomitantes a la
infeccin.
Cuestionario
1. Cul es el fundamento del mtodo para la determinacin de las reacciones febriles y
mencione 3 enfermedades que se diagnostiquen por este mtodo?
2. Cul sera un ttulo clnicamente significativo en las reacciones febriles y como se
interpretara?
3. Cul es la razn de utilizar una suspensin de Proteus OX-19 para el diagnstico de
tifo?
4. Por qu se dice que es un mtodo cuantitativo?
5. Adems de las reacciones febriles, que otras pruebas de laboratorio de deben realizar
para diagnosticar Salmonelosis y Brucelosis.
22

PRCTICA No. 8
DIAGNSTICO SEROLGICO DE SIFILIS
(Prueba Rpida de Reagina, RPR)
Introduccin
La prueba de RPR es una prueba de floculacin no treponmica macroscpica que es utilizada
para detectar y cuantificar reaginas, un anticuerpo anti-lipdico encontrado en el suero o
plasma de personas con sfilis y ocasionalmente en personas con infecciones agudas o
crnicas en otras condiciones aparte de la sfilis.
El antgeno utilizado en el equipo es una modificacin del antgeno VDRL que

contiene micropartculas de carbn para realzar la diferencia entre un resultado positivo y
negativo. Si una muestra contiene reaginas, ocurre la floculacin con las partculas de carbn
contenidas en la suspensin del antgeno, la cual aparece como un cmulo negro. Las
muestras no reactivas se observan con un ligero color gris.
Objetivo
Demostrar en el suero problema anticuerpos anti-lipdicos de personas con sfilis.
Material
Muestras de sueros problema
Tarjetas de Prueba (crculos de aproximadamente de 18 mm)
Equipo con antgeno: Suspensin de Antgeno RPR conteniendo micropartculas de carbn
activado.
Control Positivo RPR.
Control Negativo RPR.
Rotador mecnico
Lmpara
23
Desarrollo
Procedimiento cualitativo
1. Lleve a temperatura ambiente la suspensin del antgeno de RPR, los controles y las
muestras.
2. Tome la pipeta/agitador del extremo sellado. Al tiempo que oprime y mantiene

presionado dicho extremo, coloque la pipeta dentro de la muestra. Suelte para permitir
que la pipeta aspire un poco de muestra.
3. Sostenga en posicin vertical la pipeta/agitador directamente sobre un crculo de la

tarjeta de prueba y coloque una gota de muestra sobre esta rea.
4. Utilizando el extremo plano de la pipeta/agitador, extienda la muestra para cubrir el

total de la superficie del crculo. Deseche la pipeta/agitador. Repita el mismo
procedimiento para cada muestra.
5. Agite el frasco de la suspensin del antgeno antes de utilizarlo. Sostngalo en

posicin vertical y dispense varias gotas en la tapa del frasco para asegurarse de que el
paso por la aguja es correcto. No limpie la aguja. Coloque una gota de la suspensin
del antgeno sobre cada muestra. NO EXTIENDA!
6. Agite por 8 min a 100 rpm en un rotador mecnico.
7. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador y agtela breve y suavemente.
8. Lea macroscpicamente bajo una lmpara de luz intensa.
Interpretacin
Reactivo: Presencia de flculos grandes o pequeos en el centro o la periferia del
crculo de prueba.
Dbil reactivo: Presencia de flculos pequeos pero definidos.
No reactivo: Apariencia lisa, uniforme pero sin flculos visibles.
24
Los resultados positivos deben ser confirmados mediante pruebas de las muestras
utilizando procedimientos cuantitativos. Se recomiendan pruebas serolgicas confirmativas
como el ensayo de microhemaglutinacin para anticuerpos treponmicos (MHA-TP). El
diagnstico final debe estar en base a la correlacin de los resultados de prueba junto con
otros hallazgos clnicos.
Procedimiento cuantitativo
1. Seleccione los sueros positivos obtenidos en la prueba cualitativa.
2. Colocar en una gradilla cuatro tubos 12 x 75 mm y numerarlos.
3. Agregar a cada uno de ellos 0.5 mL de solucin salina.
4. Depositar 0.5 mL de suero problema en el tubo No. 1 y mezclar.
5. Pasar 0.5 mL del tubo No. 1 al tubo No. 2 y mezclar.
6. Continuar esta operacin hasta el tubo No. 4.
7. Depositar 0.05 mL de cada una de las diluciones sobre anillos diferentes de la placa de
reaccin. Extienda sobre el total de la superficie de cada crculo donde se colocaron
las diluciones.
8. Aadir una gota de la suspensin del antgeno previamente resuspendido, exactamente
sobre cada una de las gotas de las diluciones anteriores utilizando el frasco gotero al
cual se le ha insertado la aguja No. 18 sin bisel.
9. Agite por 8 min a 100 rpm en un rotador mecnico.
10. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador y agtela breve y suavemente.
11. Leer el resultado macroscpicamente.
Interpretacin
La ltima dilucin que contenga agregados macroscpicos indica el ttulo de la muestra (ver
tabla 1).
Tabla 1. Ejemplo de lectura para obtener el ttulo
Nmero de tubo
Dilucin del suero
Resultado
1:2
Positivo
1:4
Positivo
1:8
Positivo
1:16
Negativo
25
El ttulo del suero problema ser: 1:8.
Limitaciones de la prueba
El diagnstico de la sfilis no debe ser hecho basado en un resultado positivo nico de

una prueba no treponmica, sin el soporte de una historia positiva o evidencia clnica. Las
muestras de suero que son reactivas en pruebas cualitativas deben ser cuantificadas para
establecer un tratamiento en el cual los cambios de ttulo puedan ser determinados como un
indicador de la respuesta al mismo. Las muestras de plasma no deben ser utilizadas para
pruebas cuantitativas. Las muestras que son no-reactivas pero dudosas, se deben de repetir y
cuantificar ya que se pueden detectar reacciones poco frecuentes de prozona.
Cuestionario
1. Menciona al agente etiolgico de la sfilis y menciona las caractersticas de la
enfermedad, tomando en cuenta signos y sntomas del paciente
2. Porque se han clasificado las pruebas para el diagnstico de sfilis en treponmicas y
no treponmicas?, menciona una de cada una
3. Menciona el fundamento del VDRL e indica algn caso en donde sea solicitada la
prueba 4.- Qu ventajas tiene la prueba de RPR sobre el VDRL?
4. Qu enfermedades pueden dar resultados falsos positivos en las pruebas no
treponmicas.?
26

PRCTICA No. 9
FACTOR REUMATOIDE
Introduccin.
Los factores reumatoides son anticuerpos dirigidos contra los determinantes antignicos de la
regin Fc de las IgG. En personas sanas, estos anticuerpos pueden hallarse en baja
concentracin, sin embargo se encuentra aumentado en la mayora de los pacientes con artritis
reumatoide. La determinacin del factor reumatoide se lleva a cabo con partculas de latex
cubiertas de IgG.
Objetivo
Realizar la determinacin del Factor Reumatoide por aglutinacin en placa.
Material y equipo
Muestras de sueros
Placa de vidrio oscuro marcada
Pipeta Pasteur
Reactivo de latex-FR
Solucin amortiguadora de glicina-cloruro de sodio pH 8.2
Placa rotatoria
Desarrollo
Factor Reumatoide (FR). Por el mtodo de aglutinacin en ltex en placa, utiliza una
suspensin estabilizada de partculas de ltex sensibilizadas con IgG humana.
27
1. El suero se diluye 1:20 con amortiguador de glicina-cloruro de sodio colocando 0.1

mL de suero y 1.9 mL del amortiguador.
2. Se coloca una gota de la dilucin en la placa de vidrio oscura y se aade una gota del
reactivo ltex-FR.
3. Se mezcla y se agita suavemente en la placa rotatoria durante dos minutos.
4. Se busca la aglutinacin macroscpica.
5. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y
1/640, las cuales se preparan con 0.5 mL de la dilucin 1/20 en 0.5 mL del
amortiguador para una dilucin 1/40 y as consecutivamente.
Cuestionario
1. Qu es el factor reumatoide y explique el fundamento de la prueba?

2. Indique de que estn hechos los controles positivos y negativos para la prueba de FR
3. Explique cmo se calcula el ttulo para factor reumatoide y explique el significado
clnico de una prueba FR positiva
4. Adems de la artritis reumatoide, que otras enfermedades dan un resultado positivo de
este factor.
5. Un resultado negativo del factor reumatoide descarta el diagnstico de artritis
reumatoide?
28

PRCTICA No. 10
PROTEINA C REACTIVA
Introduccin
La Protena C reactiva forma parte de las protenas de fase aguda, un conjunto de protenas
del suero cuya concentracin aumenta de manera drstica durante el dao tisular, la infeccin
o el estrs. No es especfica de una enfermedad sino que es un indicador del proceso
inflamatorio.
Objetivo: Realizar la determinacin de la Protena C reactiva por aglutinacin en placa.
Material
Muestras de sueros
Placa de vidrio oscuro marcada
Pipeta Pasteur
Reactivo de ltex- Protena C reactiva
Solucin amortiguadora de glicina-cloruro de sodio pH 8.2
Placa rotatoria
Desarrollo
Protena C reactiva (PCR). Por el mtodo de aglutinacin en ltex en placa. Utiliza una
suspensin acuosa de partculas de ltex recubiertas de anticuerpos especficos anti- Protena
C reactiva.
1. El suero problema se diluye 1/20, con amortiguador de glicina- cloruro de sodio y se

coloca una gota de la dilucin en una placa de vidrio oscuro.
29
2. Se aade una gota del reactivo latex-PCR se mezcla bien y se agita suavemente en la
placa rotatoria por 3 min.
3. Se busca la aglutinacin macroscpica.
4. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero a partir de 1/80.
Cuestionario
1. Qu es la protena C reactiva y explique el fundamento de la prueba?
2. Indique de que estn hechos los controles positivos y negativos para la prueba de
protena C reactiva
3. Explique cmo se calcula el ttulo para PCR
4. Explique el significado clnico de una prueba PCR positiva
5. Cul es el valor diagnstico de la Protena C reactiva?
30

PRCTICA No. 11
DETERMINACIN DE ANTIESTREPTOLISINAS
Introduccin
Las estreptolisinas son enzimas hemolticas producidas por la mayora de los estreptococos
del grupo A, destruyen la membrana de los eritrocitos ocasionando la hemlisis. Este
producto bacteriano es una de las muchas toxinas extracelulares y enzimas producidas por los
estreptococos.
En particular, la estreptolisina O recibe este nombre debido a que sensible al oxgeno,

solo posee actividad en estado reducido, razn por la cual se le incorpora un reductor (el
hidrosulfito de sodio) inmediatamente antes de usarla. En el laboratorio las ASO pueden
determinarse por una reaccin serolgica de neutralizacin, en la cual si el suero del paciente
contiene anticuerpos contra la enzima (antiestreptolisinas) neutralizarn su capacidad
hemoltica y ocurrir inhibicin de la hemlisis.
Objetivo
Determinar el ttulo de anticuerpos contra la estreptolisina O en el suero problema
Material
Muestras de suero
Suspensin de eritrocitos al 5%
Amortiguador para ASO (fosfatos pH 6.5)
Estreptolisina O
Bao serolgico
Centrfuga
Pipetas graduadas de 1 mL y 5 mL
15 tubos de ensaye de 10 X 75 mm
31
Desarrollo
1. Preparar a partir del suero problema las siguientes diluciones iniciales:
a) 1:10
con 0.2 mL del suero problema
+ 1.8 mL de solucin amortiguadora
b) 1:100 con 0.3 mL de la dilucin 1:10
c) 1:500 con 0.6 mL de la dilucin 1:100
2. Rotular los tubos de ensaye con nmeros del 1 al 12 y dos ms como control (+) y
control (-).
3. Preparar diluciones secundarias aadiendo primero el volumen de solucin
amortiguadora y posteriormente el volumen del suero diluido segn se indica en la
tabla 2.
Tabla 2. Diluciones para la prueba de antiestreptolisinas
Tubos N
10
11
mL amortiguador 0.1 0.4 --- 0.1 0.2 0.3 0.35 --- 0.1 0.2 0.3
1:10
1:100
1:500
Dilucin
12
(+) (-)
0.4 0.5 0.75
mL suero diluido 0.4 0.1 0.5 0.4 0.3 0.2 0.15 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 --Unidades Todd 12 50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500
---
4. Mezclar suavemente y aadir a cada tubo 0.25 mL de estreptolisina, EXCEPTO al

tubo control (-).
5. Mezclar por agitacin e incubar a 37C por 15 min.
6. Aadir a cada tubo 0.25 mL de una suspensin de eritrocitos al 5%., mezclar e incubar
a 37C por 30 min.
7. Centrifugar los tubos a 2500 rpm por 2 min.
8. Comprobar la presencia de hemlisis completa en el tubo control (+) y la ausencia de
hemlisis en el tubo control (-)
9. Determinar el ttulo de antiestreptolisinas (unidades Todd) como el de la mxima
dilucin que no presenta hemlisis.
Cuestionario
1. Qu son las antiestreptolisinas e indica el fundamento de la prueba?
2. Menciona dos motivos para montar el control negativo y dos motivos para montar el
control positivo
3. Por qu la enzima estreptolisina se tiene que activar en el momento de utilizarla?
32
4. A partir de qu dilucin, un suero positivo se considera sugestivo de infeccin por

Streptococcus?
5. Qu complicaciones pueden presentarse debido a una infeccin por Streptococcus
pyogenes?
33

PRCTICA No. 12
DETERMINACIN DE LA HORMONA GONADOTROPINA
CORIONICA HUMANA
Introduccin
Las pruebas de laboratorio para el diagnstico del embarazo se basan en la determinacin de
la gonadotropina corinica humana (hGC), hormona producida por la placenta y que puede
detectarse tanto en el suero como en la orina. La excrecin de hGC alcanza su mximo
durante la duodcima a decimocuarta semana de gestacin y a partir de entonces desciende de
nivel. Hasta los aos 60, las pruebas de embarazo eran bioensayos en los cuales la presencia
de la hGC en el suero o en la orina se demostraba por su efecto en animales.
Las primeras pruebas utilizaban ratones y conejos, las pruebas ulteriores ratas hembra
o ranas. Actualmente estas pruebas han sido sustituidas por pruebas inmunolgicas. Las
pruebas inmunolgicas dependen del anticuerpo anti-hGC. La presencia de hGC en el suero u
orina se demuestra por un sistema indicador.
Los ensayo de aglutinacin denominados de inhibicin de la aglutinacin consisten de
eritrocitos de conejo o partculas de ltex recubiertas con hGC. Cuando se realiza la prueba,
el suero u orina de la paciente se incuban con el anticuerpo. Si existe hGC en la muestra, el
anticuerpo es inactivado y los eritrocitos o partculas de ltex no aglutinan. Si la muestra no
contiene hGC, el anticuerpo permanece activo y se produce la aglutinacin.
Adems de la aglutinacin, existen
otras tcnicas inmunolgicas para la
determinacin de la hGC, tales como los inmunoensayos enzimticos
(ELISA) y el
radioinmunoanlisis (RIA), el cual requiere de equipo especial para su realizacin. Esta

tcnicas varan en su sensibilidad, esto es las pruebas inmunolgicas son, ms sensibles al
34
detectar concentraciones menores de hGC, por ejemplo las pruebas con eritrocitos tienden a
ser ms sensibles que la que emplean partculas de ltex.
Objetivo
Determinar la presencia de la hormona Gonadotropina Corinica Humana en una muestra de
orina.
Material
Muestra de Orina (10 mL)
Muestra de suero
Equipo de diagnstico de hGC
Desarrollo
El mtodo que se utilizar en esta prctica es un inmunoensayo de flujo lateral. (STICK
hGC). El mtodo utiliza una combinacin nica de conjugado anticuerpo monoclonal y
anticuerpos policlonales en fase slida. La sensibilidad del mtodo es de 10 mIU/mL. El
mtodo consiste en introducir la tira reactiva en la orina centrifugada hasta la marca,
esperando a que migre hasta la marca superior por medio de capilaridad. El conjugado
anticuerpo-colorante se une a la hGC formando un complejo anticuerpo-antgeno. Este
complejo se une al Anti-hGC que se encuentra fijo en la zona de prueba generando una banda
color rosa. En ausencia de la hormona no se forma este complejo. La mezcla de reaccin
contina migrando a lo largo de la tira hasta la zona control. El conjugado libre an, se une a
los anticuerpos fijos contra la fraccin FC de los anti-hGC dando lugar a una banda rosa,
demostrando que el reactivo est funcionando correctamente y que migro por toda la tira (ver
figura 7).
1. Atemperar la muestra y las tiras reactivas

2. Colocar 0.5 mL de orina o suero en un tubo pequeo
3. Introducir verticalmente la tira hGC en la muestra durante 10-15 segundos. No
sobrepasar la marca MAX.
4. Leer la tira en los 3 minutos siguientes para orina y en los 5 minutos siguientes
para suero.
Interpretacin
35
Prueba negativa: Si solo aparece una banda coloreada transversal en la zona control.
Prueba positiva: Adems de la banda en la zona control debe aparecer una segunda banda
en la zona prueba de la tira.
No vlido: Si no aparece la banda en la zona control
Zona control
Zona prueba
NEGATIVO
POSITIVO
Figura 7. Interpretacin de la tira reactiva
Cuestionario
1. Mencione otros mtodos serolgicos para determinar la hormona hGC
2. Investigue que tipo de sustancias presentes en la orina de la paciente pueden interferir
y dar un resultado falsamente positivo
3. Indique la diferencia en determinar la hormona, en una muestra de orina o en una
muestra de suero
4. Cul es la estructura de la hGC y hacia qu subunidad estn dirigidas las pruebas de
embarazo?
5. En qu casos diferentes a embarazo la hGC podr resultar positiva
36
BIBLIOGRAFA
1. Abbas, A., Lichtman, A. H. y Pober, J. S. 1999. Inmunologa celular y molecular. 3

Edicin. Interamericana- Mc Graw-Hill.
2. Janeway, C. A. and Travers P. 1996. Immunobiology the immune system in health and
disease. 2 Edicin. Current Biology-Garland..
3. Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. 2003. Inmunologa. 5a Edicin.
Mc Graw- Hill
4. Regueiro, J.R. y Lpez L. C. 1998. Inmunologa biologa y patologa del sistema
inmune. 2 Edicin. Editorial Mdica Panamericana
5. Roitt, I. 1998. Inmunologa fundamentos. 9 Edicin. Editorial Mdica Panamericana.
6. Roitt, I., Brostoff, J. and Male D. 2000. Inmunologa 5 edicin. Ediciones Harcourt.
Espaa
37

Manual de Inmunología 2013

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

Observacin de leucocitos (cuenta diferencial)

Determinacin de grupo sanguneo

Determinacin del ttulo de anticuerpos ABO del

Diagnstico serolgico de infecciones bacterianas

Diagnstico serolgico de sfilis

Determinacin de la hormona gonadotropina

BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

En la prctica el clculo de las diluciones se puede efectuar de dos maneras diferentes

donde 1/d= dilucin

Sin embargo, las diluciones directas tienen el inconveniente de que cuando es

Figura 1.Esquema e diluciones seriadas

BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

Inicialmente los investigadores se dedicaron a la deteccin de anticuerpos en el suero

An ms, proporcionan un medio para la deteccin y cuantificacin de antgenos no

Figura 2. Tubos del sistema vacutainer

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Figura 3. Tipos de leucocitos

una gota de aceite de

inmersin y observar al microscopio.

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Figura 4. Sistema ABO

1. Se obtiene aproximadamente 5 mL de sangre venosa y se colocan en un tubo con

1. Depositar 2 gotas de sangre en tres diferentes divisiones de un portaobjetos.

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correspondientes. Estos anticuerpos pertenecen a la clase IgM y son producidos en respuesta

Aplicadores de madera o palillos

1. El ttulo de anticuerpos en el suero problema se determina como el recproco de la

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La prueba cruzada mayor, denominada prueba de compatibilidad, se realiza mezclando

En ambas pruebas una suspensin de los eritrocitos respectivos se mezclan con el

=Prueba Menor en solucin salina

PM/A =Prueba Mayor en albmina

4. Se mezclan bien y se incuban a 37C por 30 minutos.

Figura 5. Compatibilidad entre grupos sanguneos

BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

La identificacin bacteriolgica completa del agente patgeno es un proceso que lleva

Figura 6. Aglutinacin en placa

1. Los volmenes de suero empleados corresponden respectivamente a diluciones 1/20,

de 5-7 das concomitantes a la

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El antgeno utilizado en el equipo es una modificacin del antgeno VDRL que

2. Tome la pipeta/agitador del extremo sellado. Al tiempo que oprime y mantiene

3. Sostenga en posicin vertical la pipeta/agitador directamente sobre un crculo de la

4. Utilizando el extremo plano de la pipeta/agitador, extienda la muestra para cubrir el

5. Agite el frasco de la suspensin del antgeno antes de utilizarlo. Sostngalo en

6. Agite por 8 min a 100 rpm en un rotador mecnico.

8. Lea macroscpicamente bajo una lmpara de luz intensa.

Dilucin del suero

El ttulo del suero problema ser: 1:8.

El diagnstico de la sfilis no debe ser hecho basado en un resultado positivo nico de

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1. El suero se diluye 1:20 con amortiguador de glicina-cloruro de sodio colocando 0.1

1. Qu es el factor reumatoide y explique el fundamento de la prueba?

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Objetivo: Realizar la determinacin de la Protena C reactiva por aglutinacin en placa.

1. El suero problema se diluye 1/20, con amortiguador de glicina- cloruro de sodio y se

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En particular, la estreptolisina O recibe este nombre debido a que sensible al oxgeno,

con 0.2 mL del suero problema

+ 1.8 mL de solucin amortiguadora

b) 1:100 con 0.3 mL de la dilucin 1:10