UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

Facultad de Ingeniera Pesquera y de Alimentos

Escuela Profesional de Ingeniera de Alimentos
DETECCION Y RECUENTO DE: Clostridium perfringens
Mtodo FDA BAM/CFSAN 8 th Edition 1995
(Modificacin de la revisin A/1998) January - 2003
I. RECUENTO

PRESUNTIVO
10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

Muestra: 50 g +
Agua
Butterfields:
450 ml
Licuar / 2 minutos

Verter ( +
20) ml
( -)
ATCS
Homogeneizar con 20
1mlmovimientos 1ml
y dejar
solidificar.

Luego cubrir toda

la superficie con 10 ml
de ATCS sin yema de
huevo.

Solidificado
el
medio colocar los petri
con la tapa hacia arriba
en la Jarra Gaspack y
extraer
el
aire
y
reemplazarlo
por
mezcla
gaseosa
Perfringens)
(Anaerocult).

Controles

Homogeniza
r
Las
diluciones
en arco de
30 cm /
25veces

Diluyente
A. Butt.
90 ml

10-1
1ml

10-2
1ml

10-3

10-4

10-5

10-6

1ml

1ml

1ml

1ml

PC

OGY

Incubacin: 36+1C /20-24h AGAR

TRIPTOSA SULFITO CICLOSERINA (ATSC)
Ambiental
Introducir las placas con la tapa hacia arriba (Sin invertir)
en una Jarra de anaerobiosis
Lectura: Colonias negras de 2-4 mm de dimetro rodeadas de un halo opaco

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

como resultado de la actividad de la lecitinasa (Recuento de probables Cl.

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Elegir las placas que presenten entre 20-200

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I I . C O N F I R M AC I N

BIOQUMICA

Elegir al azar 5 colonias negras e inocular por picadura en aguja recta a partir de las placas de Agar TSC en tubos tapa rosca con:
1. Medio movilidad nitrato suplementado : Reactivo para la reduccin de nitrato a nitrito color rojo si es positivo

Incubar:
a 36+ 1C/24 h.
No es necesario
anaerobiosis

Prueba de los Nitratos (+): Aadir 0,1 ml cido sulfanlico y 0,1 ml cido amino
naftileno sulfnico a cada tubo movilidad nitrato
Si el crecimiento se limita a la parte inferior del tubo y no aparece color o ste es dbil,
aspirar con una pipeta el contenido de la parte superior del tubo y aadir de nuevo los reactivos.

Un color color rosa o rojo se pone de manifiesto la presencia de nitrito.

Crecimiento slo a lo largo de la lnea de inoculacin, no difuso (indica que el organismo inmvil)

2. Caldo gelatina- lactosa: Fermentacin de la lactosa con produccin de gas y cido (viraje del indicador-amarillo) licuacin de la gelatina: enfriar a 5C por
una hora antes de efectuar la lectura, si es negativa, incubar otras 24 h

incubar :
36+ 1C /
24 h.

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Colocar los tubos de

caldo gelatina lactosa en
agua con hielo por 10
minutos, observar y
anotar la licuacin de la
gelatina

En el caso de que no se
observe la licuacin de este
medio incubarse los tubos
por otras 24 horas.
Y de ser de la prueba
que se observe la produccin de
nitritos y la no movilidad
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Calcular el recuento de C. perfringens confirmados a partir del recuento de probables, teniendo en cuenta el porcentaje de colonias confirmadas
(inmviles, productoras de nitritos y licuadoras de la gelatina) del nmero total de colonias ensayadas.
De cada alimento incriminado en un brote de intoxicacin y que contenga un nmero grande de clulas de Clostridium perfringens, conservar tres
cultivos confirmados en caldo gelatina lactosa para una caracterizacin ms exhaustiva.
Interpretacin
Bacteria que produce colonias negras en agar TSC, no mvil, reduce nitrato a nitrito, produce gas y cido a partir de lactosa y licua la gelatina en 48 h se
considera Clostridium perfringens .

A i s l a m i e n t o e I d e n t i fi c a c i n d e
C l o st r i d i u m p e r f r i n g e n s
I. Introduccin:
El gneroClostridium est formado por ms de cien especies con limitada relacin gentica y propiedades bioqumicas diversas. Comprende a bacilos grampositivos, anaerobios, esporulados. Son ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residuales as como tambin en la flora intestinal de
hombres y animales. En su mayora son saprofitos, pero los patgenos pueden causar graves enfermedades como gangrena gaseosa, botulismo, ttanos, infecciones de piel y partes blandas, colitis asociada a antibiticos e intoxicaciones alimentarias.
La capacidad para provocar enfermedad esta vinculada a la posibilidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas mediante la formacin de esporas, crecer rpidamente y producir toxinas histolticas, enterotoxinas y neurotoxinas.
Clostridium perfringens es la especie del gnero Clostridium ms frecuentemente aislada en materiales clnicos. Es un bacilo gram positivo grande (1m de ancho por 4 m de largo, en promedio) de bordes rectos y extremos romos. Desarrolla rpidamente en anaerobiosis, produciendo colonias grandes (1 a
3 m de dimetro) que muestran doble halo de hemlisis en las placas de agar sangre.
Sus caractersticas morfolgicas, la demostracin de presencia de esporas, el rpido desarrollo en anaerobiosis y algunas propiedades bioqumicas (lecitinasa) conforman un perfil que facilita su rpida deteccin en el laboratorio.
C. perfringens es agente etiolgico de muchas enfermedades y es la tercera causa de toxinfeccin alimentaria bacteriana despusSamone lla spp. y Saphylococcus aureus.
Existen dentro de la especie cinco tipos llamados A, B, C, D y E. C. perfringens A es el responsable de la mayora de los procesos infecciosos. Produce una enterotoxina (polipptido de 35.000 daltons de peso molecular) que se comporta como un superantgeno promoviendo la liberacin de mediadores de
inflamacin en forma masiva.
La enterotoxina es susceptible a pronasa pero no a tripsina ni quimiotripsina. En el intestino delgado, la enterotoxina se une a un receptor de membrana del ribete en cepillo e induce una alteracin de la permeabilidad calcio dependiente resultando en una prdida de iones y metabolitos. Esta prdida electroltica
altera la funcin metablica intracelular provocando dao morfolgico y eventual lisis.
La enfermedad se produce cuando el individuo ingiere alimento contaminado con un elevado nmero de organismos productores de enterotoxinas (100 millones).
Los alimentos que pueden estar contaminados son carnes vacuna, pollo, salsas cocinadas y no refrigeradas. Cuando los alimentos llegan al intestino delgado se produce la esporulacin y la liberacin de enterotoxinas.
No son comunes los brotes familiares pero si los producidos a travs de alimentos preparados comercialmente y destinados a restaurantes o instituciones.
Para confirmar la existencia de una enfermedad de este tipo es necesario recuperar el agente de la muestra clnica y del paciente. Se deben recuperar al menos 100.000 UFC de C. perfringens por gramo de alimento y 1.000.000 de microorganismos por gramo de heces en las primeras 24 horas. Es posible
detectar anticuerpos contra la enterotoxina pero ellos no tienen valor protector.
Objetivos:
- Determinar la presencia de C. perfringens sulfito reductores de muestras de alimentos.
- Familiarizarse con los mtodos de aislamientos de bacterias anaerbicas en alimentos.
- Tomar conciencia de los peligros que ocasionan la presencia de estos microorganismos en los alimentos.
III.
Materiales:
- Medios de Cultivo: Agar Wilson-Blair.
- Diluyente: Agua peptonada
- Muestras: Agua de acequia,
pescado fresco salado.
- Bao Mara
- Tubos de ensayo con tapa rosca
- Pipetas
- Frascos estriles
- Gradillas
- Mechero Bunsen
IV.
Procedimiento:
- Para muestra de agua:
a. Tomamos 5 tubos de ensayo a los cuales les agregaremos 5 mL de aguas servidas a cada uno.
b. Luego agregaremos el medio Wilson-Blair, previamente calentado (disuelto) en el bao Mara.
c. El agua servida debe haber sido tambin calentada, previamente, en el bao Mara a 80 C por 10 min.
d. Al medio le agregamos la solucin sulfato-ferrosa.
e. Luego incubamos los tubos en anaerobiosis a 37 C por 48 h.
f. Se observarn, de ser positivas, colonias negras en la profundidad.
g. Los resultados se dan en esporas deClostridium sulfito reductoras/100 mL.
Para muestra de alimentos:
a. La muestra de pescado es eviscerada, le sacamos la piel, las agallas y si hubiera, los intestinos.
b. Luego, ponemos todo eso en un frasco estril y le agregamos el diluyente (agua peptonada) la cantidad suficiente. Homogenizamos.
c. Luego realizamos las diluciones respetivas (10-1, 10-2, 10-3).
d. De las diluciones realizadas sembramos por mtodo de siembra en profundidad, una placa por cada dilucin.
e. Luego enviamos a incubar, en anaerobiosis, a 37 C por 48 h.
f. Al igual que en la anterior, la positividad de las colonias se ver por su caracterstico color negro.
VI.
Preguntas:
- Cules son las pruebas bioqumicas utilizadas para identificar C. perfringens?
a. Para la identificacin bioqumica de C. perfringens se realizan las sgte.
Pruebas bioqumicas:

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Fermentacin de azcares: glucosa, lactosa, ramnosa, manitol.

Hidrlisis de: almidn, gelatina, esculina, casena, DNA, lecitina.

Produccin de: hidrgeno sulfurado, indol, gas.

- Cmo se consigue un medio anaerobio para la incubacin de las bacterias de este tipo?

Como los anaerobios estrictos varan en su sensibilidad al oxgeno,existen diferentes mtodos para disminuir la cantidad de oxgeno en los cultivos; algunos sencillos y otros mucho ms complejos.

Botellas, tubos o matraces completamente llenos con el medio de cultivo

y los tapones apropiados, proporcionan condiciones anxicas
suficientemente buenas para el crecimiento de muchos anaerobios.

Tambin es posible aadir algn compuesto qumico que reacciona con

el oxgeno del aire y la reduce hasta H2O. Un buen ejemplo de esto es el tioglicolato, comnmente utilizado para ensayar el requerimiento de oxgeno de un microorganismo. Despus de que el tioglicolato reaccione con el
oxgeno del tubo, el oxgeno puede penetrar solamente en la parte superior, donde el medio contacta con el aire.

Para quitar todas las trazas de oxgeno para el cultivo de anaerobios

puede utilizarse una jarra de anaerobios. El aire de la jarra de sustituye por una mezcla de hidrgeno y anhdrido carbnico y, en presencia de un catalizador, se consumen las trazas de oxgeno que todava quedan, esto
proporciona condiciones totalmente anxicas para el crecimiento de anaerobios estrictos.
VII. Referencias:
- Apuntes sobre bacteriologa (2003) Clostridium perfringens y Clostridium botulinum. Obtenido el 15 de marzo de 2008 en
http://www.bvsops.org.uy/pdf/clostridium.pdf
- PINEDA, Yuraima, APONTE, Fanny y SANTANDER, Jorge. AISLAMIENTO DE Clostridium perfringens EN UN TERNERO DE VENEZUELA. RC, jun. 2004, vol.14, no.3, p.226-229. ISSN 0798-2259.
- MADIGAN, M., J. MARTINKO, P. PACK. 1998. Biologa de los Microorganismos de Brock. 8 edic. Edit. Prentice Hall. Madrid.

http://publicaciones.ops.org.ar/publicaciones/cursos_virtuales/Analisis%20Microbiologicos/Precentaciones/Sesion%204%20-%2010-909_archivos/frame.htm

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