Taller de Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR)

Por:
Vanesa Bedoya Betancur
Daniela Calle Vlez
Andrea Pulgarin Palacio

Profesor
Andrs Augusto Arias

Escuela de Microbiologa
Universidad de Antioquia
Curso Biologa Molecular

2015

2. En el ao 1985, el investigador norteamericano, Kary Mullis (acreedor del Premio

Nobel en Qumica 1993 por este aporte), nacido en Lenoir, Carolina del Norte, Estados
Unidos; fue quien describi por primera vez la tcnica de PCR.
3. Oligonucletido sentido: la primera base del nucletido est en la posicin 285 y la
ltima base est en la posicin 304.
4. Oligonucletido Reverse (antisentido) 5 TCCTGTTTCACACCCACGTA 3
Si, el oligonucletido antisentido est escrito correctamente y concuerda
secuencia blanco que queremos amplificar.

con la

5. La primera base del oligonucletido reverse (antisentido) est en la posicin 464 y

la ltima base est en la posicin 483.
6. Porcentaje guanina -citosina = 50%.
Teniendo en cuenta que el oligonucletido sentido est formado por 20 nucletidos en
total (siendo el 100%) y que la cantidad de nucletidos guanina y citosina en esta es de
10, entonces:
10/20 = 0.5 * 100 = 50%
7. El oligonucletido antisentido, igual al oligonucletido sentido, tiene un porcentaje de
GC igual a 50%, ya que, contiene la misma cantidad de nucletidos (20) y la misma
cantidad de GC (10).
8. El tamao del amplicn esperado es de 199 pares de bases contando los
nucletidos de los primers.
9.

10. El tamao de los oligonucletidos sentido y reverse de la muestra para la PCR son
de 20 pares de bases cada uno.
11.
Forward (sentido) 5 GCTTCACCAGCCACTTTGTT 3
Reverse (antisentido) 5 TCCTGTTTCACACCCACGTA 3
Forward = 4Cx10G,C + 2C X 10 A,T= 60c
Reverse = 4CX 10 GC + 2C X 10 A,T= 60c
12. REACTIVOS
-

solucion buffer Taq/AmpliTaq, contiene:

tris 10 mM, pH 8,3
KCl 50 Mm
MgCl2 1,5-2,5 mM - los iones Mg forman un complejo soluble con los dNTP,
fundamental para su incorporacin; estimula la actividad polimerasa; aumenta la
Tf de la interaccion cebador / DNA molde.
dNTP libres: en igual concentracin para minimizar los errores de incorporacion, con un
pH de 7,0 +/- 0,5 (incorporarlo con NaOH 1M)
agua destilada -bidestilada, con baja concentracin de sales, para evitar las variaciones
entra ciclos.
DNA polimerasas termoestables, capaces de resistir a la inactivacion en temperaturas
elevadas, generalmente se usan 2 unidades por reaccion.
cebadores o primers: se usa a una concentracin de 1uM una mayor concentracin
puede provocar amplificacin de sceuencias no deseadas, secuencias cortas entre 1630 nucleotidos, se deben evitar secuencias repetidas invertidas, y secuencias repetidas

con otras primers. es conveniente que en el extremo 3 tenga gran proporcin de G-C
para aumentar la hibridacion.
DNA diana: concentracin entre 0.05 y 1ug
BSA (adyuvante): >0.8ug/ul, actua como protena captadora de iones que pueden
inhibir la taq polimerasa.
EQUIPO
termociclador: baos termostatizados capaces de subir y bajar rapidamente la
temperatura de forma automatizada y programada.

13. Disee protocolo- escriba criterios del porqu

PASOS PCR

Desnaturalizacin
inicial:

*Desnaturalizaci
n
*Alineamiento

TEMPERATURA(
C)
94 -96
La temperatura a la
cual se decide
llevar a cabo esta
etapa va a
depender de la
proporcin de
Guanina-Citocina
(G-C) que tenga la
hebra, as como
tambin del largo
de la misma.

95
56

TIEMPO(SEG)

N VECES QUE
REPETIRA EL
PROCESO

3 minutos

1 ciclo

30 segundos a 1
minuto.

30 ciclos

1 minuto

30 ciclos

*polimerizacin
(extensin)

72

2 minutos

30 ciclos

Extensin final

72

4 minutos

1 ciclo

Temperatura final

infinito

14. Si se desea realizar una PCR con resultados de alta fidelidad se pueden utilizar las
polimerasas Vent o Pfu. Estas polimerasas son mejores que las Taq polimerasas
porque resisten ms tiempo las altas temperaturas (duran ms) y porque tienen un
rango de error de pares de bases mucho menor ya que tienen actividad exonucleasa
correctora de errores de lectura que es lo que les da esa superioridad y alta fidelidad
ante la Taq polimerasa. Tambin se puede usar la Taq polimerasa en conjunto con otra
polimerasa que tenga actividad exonucleasa correctora de lecturas como la Pwo
polimerasa para aumentar la fidelidad de la PCR, este mtodo es ms usado en PCR
largas que requieren alta fidelidad.
15. Segn el documento The polymerase Chain Reaction los primers deben tener de
17-30 nucletidos, ambos oligonucletidos (sentido y anti-sentido) deben tener el
mismo tamao, deben tener un % de G-C de un 50 - 60% y por ltimo en su extremo 3
debe contener G, C, GC, o CG. Por lo tanto, los oligonucletidos empleados ac, s
cumplen las recomendaciones, ya que, contienen 20 nucletidos cada uno, su
porcentaje de G-C es del 50% y aunque en sus extremos 3 no contienen G, C, GC, ni
CG esta no es una recomendacin muy estricta ya que tambin puede causar
hibridacin no especfica con secuencias ricas en G-C.

16.

Nombre del primer

Secuencia del
oligonucletido
en direccin 53

%GC

Tm

Sentido

CACTGGAAACAGC
AAACTGG

50

57.77

Antisentido

GCTGATGGTGTCT
TCGTAGTAG

50

55.19

amplicn esperado
en pb

217

17.
-Formamida (concentracin final de reaccin de 1.25-10%)
Aumenta la rigurosidad de la hibridacin del cebador, que se traduce en menos
hibridacin no especfica y la eficiencia de amplificacin mayor.
-Detergentes no inicos funcionan para suprimir la formacin de estructura secundaria
y ayudar a estabilizar la DNA polimerasa. Detergentes no inicos tales como Tritn X100, Tween 20, o NP-40 puede ser utilizado en concentraciones de reaccin de 0,1 a
1% con el fin de aumentar la produccin de amplificacin.
18.
c. La herramienta bsica de bsqueda alineacin Local (BLAST) encuentra regiones
locales de similitud entre secuencias. El programa compara secuencias de nucletidos
o protenas en bases de datos de secuencia y calcula la significacin estadstica de las
coincidencias. BLAST puede utilizarse para inferir relaciones funcionales y evolutivas
entre las secuencias, as como ayudar a identificar a los miembros de familias gnicas.

i. Primer sentido: dos transcriptos presentan el mayor puntaje,

homo sapiens neutrophil cytosolic factor 4, 40kDa (NCF4), transcript variant 1, mRNA,
max score 40.1
homo sapiens neutrophil cytosolic factor 4, 40kDa (NCF4), transcript variant 2, mRNA,
max score 40.1

j. primer antisentido: dos transcriptos presentan el mayor puntaje,

homo sapiens neutrophil cytosolic factor 4, 40kDa (NCF4), transcript variant 1, mRNA,
max score 40.1
homo sapiens neutrophil cytosolic factor 4, 40kDa (NCF4), transcript variant 2, mRNA,
max score 40.1
Se estara amplificando el gen NCF4, el mRNA del factor citosolico de neutrfilos 4.
k. Esta bsqueda nos sirvi para saber qu tan especfico o no es el primer que voy a
utilizar.