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*Channing Laboratory and Pulmonary Division, Brigham and Womens Hospital and
Harvard Medical School, Boston, MA 02115; y Washington University School of
Medicine, St. Louis, MO 63110
Contribudo por Laurie H. Glimcher, Noviembre 17, 2004
TBX21 codifica el factor de transcripcin T-bet (T-box caja-T expresada en clulas T),
que influencia linfocitos T ingenuos y ha sido implicado en la patogenia del asma.
Especficamente, la inactivacin en ratones de T-bet desarrolla espontneamente una
hiperrespuesta de la via area y otros cambios consistentes con asma. Porque la
sensibilidad de la va area es moderada por el uso de corticoesteroides inhalados en
el asma, es concebible que la variacin gentica en la codificacin de TBX21 para
reemplazar la histidina 33 con glutamina se asocia con una mejora significante en el
PC20 (una medida de sensibilidad de la va area) de nios asmticos en ensayos
clnicos grandes abarcando 4 aos. Notamos que este incremento ocurre solo en los
nios aleatorizados para corticoesteroides inhalados y que mejora dramticamente la
mejora total en PC20 en una prueba final para sujetos que tomaban corticoesteroides
inhalados poseyendo un alelo variante estaba en el rango normal para no asmticos.
En modelos celulares, se muestra que la variante de TBX21 incrementa T-helper 1 y
disminuye la expresin de citosina T-helper 2 comparablemente con el tipo salvaje.
TBX21 puede ser una respuesta farmacogentica determinante importante para la
terapia del asma con corticoesteroides inhalables.
El gen TBX21 codifica para la transcripcin del factor T-bet (T-box expresada en
clulas T), que es responsable por la induccin de clulas T-helper (Th)1 y a represin
de clulas Th2 por linfocitos T ingenuos (9). T-bet ha sido implicado en la patognesis
del asma (10,11). Porque las clulas del ratn T-bet inactivadas son espontneamente
hipersensibels en la va area (10), un fenotipo que es modulado por coritcoesteroides,
nos dirigimos a los resultados sonbre asma de la relacin de TBX21 con PC20. Solo
una (heterocigoidad estimada >5%) no sinnimo TBX21 SNP ha sido descrito hasta la
fecha, rs2240017, que codifica para un reemplazo de histidina 33 con glutamina
(H33Q). Evaluamos los roles de este SNP en la respuesta teraputica con
corticoesteroides inhalados en nios incritos en el Programa de Manejo de Asma de la
Infancia (CAMP, Childhood Asthma Management Program). El diseo de estudio de
CAMP permiti investigar esta asociacin farmacogentica con estos nios
aleatorizados para corticoesteroides inhablados y entre el grupo de corticoesteroides,
y esos no aleatoirzados para corticoesteroides. Aqu se demuestra una interaccin
sgnificativa entre H33Q y corticoesteroides inhalados, uso que resulta en una mejora
de la sensibilidad de la va area a niveles no asmticos. Tambin otrogamos un
contexto para la funcin celular de H33Q y una razn para el uso de los trminos de
interacciopn en anlisis farmacogeticos.
Materiales y mtodos
Poblacin de estudio: El estudio CAMP es un estudio clnico multicntrico,
aleatorizado, doble-ciego, probando la seguridad y eficacia de budesonida inhalada
contra nedocromil, contra placebo sobre una media de 4.3 aos. El diseo de la
prueba y metodologa han sido publicadas (12, 13). CAMP inscribi a 1041 nios de 512 aos de edad con asma leve a moderado. Se recolect ADN de las familias
representando >700 probandas. En el criterio de inclusin se tomo en cuenta los
sntomas del asma y/o el uso de medicamentos >6 meses en los aos previos y una
va area sensible con PC20 >12.5 mg/ml.
La espirometra y prueba de metacolina fueron realizadas al menos 4 horass despus
del uso de un broncoldilatador de accin corta y 24 horas despus del ltimo uso de
un broncodlatador de accin larga. La espirometra fue realizada en un Collins SteadWells dry-seal Survey III. El espirmetro fue conectado a una computadora de
escritorio persona Dell y conoci o excedi los estndares de la Sociedad Americana
Torcica.
La sensibilidad de la va area fue determinada por pruebas de metacolina con la
tcnica de nebulizador de Wright despus de que el mtodo de Cockcroft et al. (14)
modificada para la administracin de metacolina y por Juniper et al. (15). La
metacolina sensitiva fue expresadda en tperminos de PC20 con la siguiente ecuacin:
PC20= antilog[logeC1 + (logeC2 logeC1)(20 R1)/(R2 R1)], donde C1 es de la
segunda a la ltima concentracin probada, C2es la pultima concentracines probada,
R1 es el porcentaje que decrece en FEV, por diluir despus C2Visitas de seguimiento con espirometra ocurran cada 2 a 4 meses y cada 4 meses de
ah en adelante. Los estudios de metacolina fueron realizados durante el periodo runin, a los 8 meses, despus anualmente. Nuestro enfoque primario fue en el CAMP
donde nios aleatorizados al grupo de corticoesteroides, fueron evaluados en su 1- y
4-aos de seguimiento para el cambio en el prebroncodilatador FEV, y en su cuarto
ao (44 meses) de visitas para diferencias en el PC20 de la lnea base. Estos puntos
de tiempo fueron elegidos porque la visita de 1 ao representada en el tiempo que el
mximo efecto de eesteroides fueron notados en el principal ensayo clnico (13) y las
visitas a 4 aos representadas en la ltima visita con el seguimiento casi completo. El
CAMP ancillary estudio de gentica fue aprobado por cada centro de estudio review
board, y consentimiento informado fue obtenido de todos los participantes y sus
padres.
Genotipado. El genotipado fue realizado usando el SEQUENOM MassARRAY MALDITOF plataforma de espectrometra de masa (Sequenom, San Diego). Cebadores
(primers)
fueron
diseados
usando
un
programa
semiautomtico
(SPECTRODESIGNER, Sequenom). Hemos usado un mtodo de extensipon muy
corto (16), donde secuenciando los productos son extendidos solo por una base de
tres o de cuatro nucletidos (representando uno de los alelos), permitiendo claramente
una delineada masa de separacin de las dos variantes allicas en un determinado
locus.
Para evaluar posibles estratificaciones de poblacin, tambin se genotipo un panel
aleatorio de 49 SNP a travs del genoma (17) obtenidos a travs de la base de datos
del consorcio SNP. SNPs fueron elegidos para excluir al gen propio (promotor, UTR
genmico, exones e intrones) de genes conocidos y ser distrubuido abiertamente a
travs del genoma. El control de calidad del genotipado consisti de al menos 90% de
llamadas exitosas, regenotipado de =10% de genotipos, y documentacin del equilibrio
Hardy-Weinberg para cada SNP.
Anlisis funcional de H33Q. Para investigar posibles consecuencias funcionales del
polimorfismo H32Q T-bet, que es el homlogo del raton para el H33Q humano,
usamos un kit de mutagnesis dirijida a sitio QuickChange para generar una T-bet
cDNA codificando una protena para la que el residuo de histidina en la posicin 32 es
reemplazado con glutamina. Wild-type (wt) T-bet o la versin H32Q de la T-bet fueron
cotransfecados dentro de clulas EL-4 con un gen informador promotor IFN- y un gen
informador -gal. Actividad relativa de luciferasa fue ensayada, estandarizada con
actividad -gal, y mostrada como induccin plegada. Tambin se prob la habilidad de
la H32Q versin de T-bet para controlar la produccin de citosina en clulas T
primarias tomando ventaja de los ratones T-bet deficientes (9). El wt y versiones
polimrficas de T-bet cDNAs fueron clonadas en un vector retroviral bicistronic (RV) y
el wt (RV-T-bet) y H32Q T-bet (RV-H32Q) retrovirus GFP fueron transducidos entre 24
36 horas dentro de clulas Th CD4+ aisladas del ndulo linftico T-bet -/-. Las
clulas fueron estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28 y cultivado por 5 das ms bajo
condiciones no polarizantes. En el sexto da, las clulas fueron organizadas para
expresin de GFPy reestimuldas con anti-CD3; 24 hoaras despus, la expresin de wt
y H32Q T-bet fue medida por un anlisis Western blot y la produccin de citosina fue
evaluada por ELISA, de acuerdo al protocolo del fabricante (Pharmingen).
Efecto celular de corticoesteroides en expresin de T-bet. Clulas humanas tCD4
fueron aisladas desde sangre perifrica usando microperlas (Miltenyi Biotec) de CD4
humano. Estimulamos estas clulas CD4 con una placa unida anti-CD3 y anti-CD28
baj no polarizacin, y condiciones polarizantes de Th1 en presencia o ausencia de 10-7
M dexametasona. Relativos niveles de transcripcin gentica para T-bet humana
fueron medidos en tiempo real por RT-PCR. Como contro, medimos transcripciones
codificadas de IRF-4, un gen conocido regulado por esteroides. Por la rareza del alelo
menor de H33Q, clulas CD4 no humanas con variante 33Q estuvieron disponibles
para la examinacin.
Metodologa estadstica. El porcentaje de cambio en FEV1 fue definido como (FEV1
al final de un periodo FEV1 aleatorizado) / (FEV1 aleatorizado x 100). Valores de
PC20 fueron transformados a log antes del anlisis. Cambio en PC20 fue definido
como PC20 a 4 aos PC20 al inicio del ensayo. Valores medios geomtricos fueron
calclados usando la media exponenciada de la transformacin a log del PC20 en un
tiempo determinado.
Modelos de reegresipon linear fueron usados para evaluar la asociacin entre el
estado genotpico de H33Q y el resultado de inters. Anlisis univariantes y
mutivariablesajustados por edad, sexo y base FEV1 (como porcentade de prediccin)
fueron realizados. Se incorpor la altura dentro de los modelos multivariables
involucrando resultados FEV1. Para probar la interaccin entre tratamiento esteroideo
y H33Q estados genotipicos, incluimos terimnos de interaccin en los modelos.
Pruebas t de estudiantes fueron usadas para evaluar la comparatibilidad entre los
grupos de el nedocromil y placeboantes de su combinacin como un solo grupo no
esteroideo. Dado el pqueo nmero de individuos con el genotipo de inters, nuestro
anlisis primario fue repetido usando la prueba no paramtrica exacta Mann-Whitney
U. Adicionalmente, para considerar la naturaleza de individuos que exceden el lmite
mximo para dosis de metacolina, se usaron mtodos de sobrevivencia no
paramtricos incoroporados dentro de las curvas Kaplan-Meier y pruebas log-rank
para evaluar las diferencias en el PC20 durante el tiempo. Este procedimiento ha sido
demostrado de ser adecaudo para el anlisis de sensibildad de va area en estudios
basados en poblacin (18).
Anlisis de estratificacin de SNPs procedi en dos pasos. Primero, por cada SNP
individual, una prueba allica estadstica 2 fue obtenida en moda estndar usando
tablas de contigencia 2x2 que asignaron los totales de wt y variantes allicas para las
cualidades ms altas y mas bajas de FEV1 y log PC20 respuesta para cada cuatro
clulas. Un resumen total de pruebas estadsticas 2 fue obtenido sumando las
pruebas estadsticas individuales 2 y ajustando los grados de libertad al nmero de
pruebas. Todos los anlisis fueron realizados en SAS V.8 (SAS Institute, Cary, NC).
Resultados
Caractersticas de poblacin y respuesta a corticoesteroides. De todos los nios
CAMP, 701 fueron genotipados exitosamente en H33Q y tuvieron datos para
resultados de inters; =30% fueron aleatorizados al grupo de corticoesteroides. Edad
base, gnero, distribucin tnica, FEV1, y PC20 fueron similares entre los grupos de
esteroides y no esteroides. Con el tiempo, la utilizacin de corticoesteroides fueron
asociados con mejoras significativas en FEV1 y PC20. No hubo diferencias
significativas entre nios aleatorizados con nedocromil o placebo (P=0.62 y 0.39 por 1
ao FEV1 y 4 aos PC20 cambio, respectivamente). Por lo tanto, estos nios fueron
combinados en un grupo no esteroideo ms grande.
Se confinaron anlisis a los nios cuyos padres se identificaron como caucsicos, por
preocupaciones sobre posile estratificacin de poblacin y las muestras pequeas de