Graciela Schneider Vitalis

CENTRO UNIVERSITRIO FRANCISCANO
PR-REITORIA DE PS-GRADUAO, PESQUISA E EXTENSO

REA DE CINCIAS TECNOLGICAS
Curso de Mestrado em Nanocincias
GRACIELA SCHNEIDER VITALIS
UTILIZAO DE NANOPARTCULAS DE CLOREXIDINA COMO

ALTERNATIVA DE MEDICAO INTRACANAL.
Santa Maria, RS
2012
GRACIELA SCHNEIDER VITALIS
UTILIZAO DE NANOPARTCULAS DE CLOREXIDINA COMO

ALTERNATIVA DE MEDICAO INTRACANAL.
Dissertao apresentado ao Curso de Mestrado

em Nanocincias do Centro Universitrio
Franciscano de Santa Maria como requisito
parcial para obteno do ttulo de Mestre em
Nanocincias.
Orientador(a): Prof(a). Dr(a). RENATA PLATCHECK RAFFIN
Santa Maria, RS
2012
Se vi mais longe foi por ter me apoiado em ombros gigantes
Isaac Newton
AGRADECIMENTOS
Agradeo aos meus pais pela oportunidade e valorizao do estudo, pela dedicao a
mim prestada, e apoio em cada deciso tomada.
Ao meu grande marido, Carlos F. Brilhante Wolle, pelo amor eterno, palavras de
incentivo, colaborao, dedicao e pacincia, muita pacincia. Sem o teu apoio seria
impossvel realizar qualquer sonho.
Ao meu filho rico, que me ensinou o que o verdadeiro amor, e a importncia que
tem um simples e sincero sorriso.
s pessoas que de uma forma ou outra, me deram suporte para estar ausente, me
substituindo em afazeres dirios, fazendo com que, mesmo a distancia, eu tivesse confiana e
serenidade para saber que meu filho estava bem. Em especial Jussara.
Ao meu irmo Alex e minha cunhada Mait, pelo companheirismo, dedicao e todo
apoio desprendido a minha famlia.
Ao meu sogro, cunhados, concunhadas e sobrinhos, pelos fins de semana de
descontrao e momentos de alegria. Em especial Luciana, por ter se mostrado forte e
segura nos momentos em que tudo parece ruir.
Aos meus amigos, que por hora, um pouco afastados devido s circunstncias, nunca
deixaram de estar ao meu lado. Em especial a Mariana Sudati Rodrigues, pela cumplicidade e
dedicao nossa amizade.
Aos meus colegas de mestrado, que foram muitos, pelo companheirismo, ajuda mtua
e horas descontradas no laboratrio, em especial Michelli, Ricardo, Delita, Fran e Ana.
Gabi Farias, pela amizade, oportunidade de convvio e muita ajuda no laboratrio.
Isabel Roggia e Gabi Moraes, pelo apoio e auxlio nas horas de maior sufoco,
sempre dispostas a nos ajudar.
A aluna Camilla Filippi, pela dedicao e auxlio no laboratrio de microbiologia.
Aos professores Roberto Christ e Sandra Cadore pela colaborao a este trabalho.
professora Patrcia Gomes pela dedicao e carinho com que trata a docncia.
Aos demais professores do Mestrado em Nanocincia, por todo conhecimento
ofertado, colaborando para o meu crescimento pessoal e profissional.
Ao Anderson Veras Maciel pela receptividade e disposio.
Karla, Gustavo, Madjer, Micheline e Fernanda Corra, pelo auxlio e colaborao.
PUCRS e UFPEL pela oportunidade de trabalhar com pessoas dedicadas e dispostas

a colaborar para o desenvolvimento deste trabalho, em especial ao Juliano Soares, Luciana
Zollmann, Professora Dra. Adriana Etges e Silvana Pereira de Souza.
s pessoas que nasceram com o dom de fazer da docncia a sua profisso, me fazendo
entender que pesquisa no se faz sozinho, e que o conhecimento uma troca de experincia:
Professora Solange Fagan, que foi a grande incentivadora desta louca aventura, pela
amizade e doao ao meio acadmico.
Professora Maria Martha Campos, pelo exemplo, incentivo, acolhimento e
colaborao.
E professora, e minha orientadora, Renata Raffin, pela coragem de ter aceitado o
desafio de me orientar, dedicando a mim muita pacincia, conhecimento, palavras de
incentivo e amizade. O que me possibilitou desvendar os mistrios de se fazer pesquisa,
servindo de exemplo e estmulo docncia.
Muito Obrigada!
RESUMO
A medicao intracanal tem por objetivo eliminar os microrganismos presentes no

interior do sistema de canais radiculares, possibilitando o reparo dos tecidos perirradiculares
danificados pela ao microbiana. Apesar dos inmeros medicamentos utilizados, ainda no
existe um frmaco ideal. Assim, este estudo visa desenvolver e caracterizar nanopartculas
contendo clorexidina, avaliar seu processo de degradao na associao com a pasta de
hidrxido de clcio e analisar sua eficcia atravs de testes in vitro e in vivo. Foram
desenvolvidas e caracterizadas nanopartculas lipdicas slidas contendo clorexidina nas
concentraes de 0,2 e 0,5 %, na forma de suspenso e gel, apresentando valores de tamanho
mdio de partcula de 88,5 nm e 84,6 nm, respectivamente. As amostras foram armazenadas
por 90 dias mantendo-se estveis em temperatura ambiente e geladeira, porm instveis em
estufa a 40C. O doseamento da clorexidina livre associada pasta de hidrxido de clcio
mostrou uma reduo de 33 % de frmaco aps 14 dias de anlise, j a clorexidina
nanoencapsulada sofreu degradao de apenas 10 % do seu total. O teste de difuso em gar
frente C. albicans e E. faecalis, pelo perodo de 72 h, mostrou halos de inibio de menor
tamanho, porm com aumento crescente. Apesar deste resultado aparentemente desfavorvel,
a concentrao inibitria mnima mostrou valores iguais para as nanopartculas em
comparao ao frmaco livre frente aos mesmos microrganismos. Para observar a penetrao
das nanopartculas no interior dos tbulos dentinrios foi utilizado como mtodo de anlise a
microscopia eletrnica de varredura associada energia dispersiva de raios X, atravs da
identificao de tomos de cloro. Esta tcnica permitiu observar a presena das nanopartculas
no interior dos tbulos e depositadas sobre a superfcie dentinria. No teste in vivo em ratos,
foi possvel observar, radiograficamente e histologicamente, a ao das nanopartculas
lipdicas de clorexidina, inclusive da associao pasta de hidrxido de clcio, melhorando as
propriedades microbianas da mistura. Os resultados sugerem que a clorexidina pode ser
associada a nanopartculas lipdicas slidas, mantendo a ao antimicrobiana da clorexidina,
possibilitando seu uso como medicao intracanal em Odontologia e auxiliando na
preservao do frmaco quando em associao com a pasta de hidrxido de clcio evitando
sua degradao pelo elevado valor de pH.
Palavras-chave: clorexidina, hidrxido de clcio, medicao intracanal, nanopartculas

lipdicas slidas.
ABSTRACT
Intracanal medication aims to eliminate micro-organisms present within the system of

canals, making the repair of tissues damaged by microbial action. Despite the numerous drugs
used, there is not an ideal drug. This study aimed to develop and characterize nanoparticles
containing chlorhexidine. Furthermore, it aimed to evaluate its degradation when associated to
calcium hydroxide, and to analyze their performance in vitro and in vivo. Solid lipid
nanoparticles containing chlorhexidine were developed and characterized in concentrations of
0.2 and 0.5 % chlorhexidine (suspension and gel), showing average particle size values of
88.5 nm and 84.6 nm, respectively. The samples were stored for 90 days and remained stable
at 5C and room temperature, but unstable at 40C. The free chlorhexidine concentration
reduced in 33% when associated to calcium hydroxide after 14 days of analysis. O the other
hand, nanoencapsulated chlorhexidine degraded only 10 % at the same conditions. The agar
diffusion test against C. albicans and E. faecalis, for 72 h, showed smaller zone of inhibition
but they increased size. Despite this seemed unfavorable, the MIC result showed equal values
for chlorhexidine in free form and in nanoparticles. To verify the penetration of nanoparticles
in the dentin tubules, SEM/EDS was used, through the identification of chlorine atoms,
allowing the observation of nanoparticles in the interior of dentin tubules and deposited on the
dentin surface. In the in vivo test using rats, it was able to observe, histologically and
radiographically, the effect of the lipid nanoparticles, including when associated to calcium
hydroxide, improving the antimicrobial properties of the association. These results suggest
that chlorhexidine can be associated to solid lipid nanoparticles, keeping its antimicrobial
effect, enabling its use as intracanal medication in dentistry, and assisting in the preservation
of the drug when in association with calcium hydroxide paste to avoid their degradation by
high pH value.
Keywords:
nanoparticles.
calcium
hydroxide,
chlorhexidine,
intracanal
medication,
solid
lipid
LISTA DE ABREVIATURAS
ACN Acetonitrila;
ANOVA Anlise de Varincia;
ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria;
ATCC American Type Culture Collection;
B&B Microscopia ptica Brown e Brenn
BHI Brain Heart Infusion;
BV Balo volumtrico;
CA Acetato de clorexidina;
CDA Diacetato de clorexidina;
CEUA Comisso de tica no Uso de Animais;
CIM- Concentrao inibitria mnima;
CL Clorexidina;
CLAE Cromatografia Lquida de Alta Eficincia;
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentao Animal;
DMSO Dimetil sulfxido;
DP Desvio Padro;
DPR Desvio Padro Relativo;
EDS Espectrometria dispersiva de raios-X;
EDTA cido Etilenodiaminotetractico;
ES Estufa;
GE Geladeira;
HCA Pasta de hidrxido de clcio;
IARC International Agency of Research on Cancer;
IPD ndice de polidisperso;
LPS Lipopolissacardeo;
MEV Microscopia Eletrnica de Varredura;
MET Microscopia Eletrnica de Transmisso;
MFA Microscopia de Fora Atmica;
MHA Agar Muller-Hinton;
MMT montmotilonita;
NBR - Nanopartculas Lipdicas Slidas sem o frmaco;
NC Nanocpsulas;
NCL Nanopartculas Lipdicas Slidas de Clorexidina;
PCL Poli (-caprolactona);
PLGA Poli (L-cido lctici-co-cido gliclico);
PUCRS Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul;
TA Temperatura ambiente;
UFC unidades formadoras de colnia;
UFPEL Universidade Federal de Pelotas;
UFRGS Universidade Federal do Rio grande do Sul;
UNIFRA Centro Universitrio Franciscano.
SUMRIO
LISTA DAS FIGURAS .......................................................................................................... 15

LISTAS DAS TABELAS ....................................................................................................... 18
1.
INTRODUO ............................................................................................................... 18
1.1. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 19

2. REFERENCIAL TERICO ............................................................................................ 20
2.1. A ESTRUTURA DENTRIA .......................................................................................... 20
2.2. O TRATAMENTO ENDODNTICO .............................................................................. 23
2.3. A CLOREXIDINA ............................................................................................................ 26
2.4. AS NANOPARTCULAS ................................................................................................. 32
3. METODOLOGIA............................................................................................................... 37
3.1. DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTCULAS CONTENDO CLOREXIDINA ..... 37
3.1.1. Teste de solubilidade ...................................................................................................... 37
3.1.2. Preparo das suspenses contendo nanocpsulas de clorexidina ..................................... 37
3.1.3. Preparo das suspenses contendo nanopartculas lipdicas slidas de clorexidina. ....... 38
3.1.4. Preparo dos gis contendo NCL. .................................................................................... 40
3.2. CARACTERIZAO DAS NANOPARTCULAS ........................................................ 41
3.2.1. Determinao do potencial zeta...................................................................................... 41
3.2.2. Determinao do ndice de polidisperso e dimetro das partculas .............................. 41
3.2.3. Determinao do pH ....................................................................................................... 41
3.2.4. Validao da metodologia para doseamento da clorexidina .......................................... 42
3.2.4.1. Mtodos Cromatogrficos ........................................................................................... 42
3.2.4.2. Preparo das amostras para o doseamento da clorexidina ............................................ 42
3.3. DETERMINAO DA ESTABILIDADE DAS SUSPENSES E GIS CONTENDO
NCL............. ............................................................................................................................. 43
3.4. ENSAIO MICROBIOLGICO ........................................................................................ 43
3.4.1. Preparo da suspenso microbiana ................................................................................... 43
3.4.2. Concentrao inibitria mnima ..................................................................................... 44
3.4.3 Teste de difuso em gar com cilindro de ao inoxidvel ............................................... 46
3.5. AVALIAO IN VITRO DA DEGRADAO DA CLOREXIDINA QUANDO
ASSOCIADA PASTA DE HIDRXIDO DE CLCIO ..................................................... 47
3.5.1. Diviso dos grupos ......................................................................................................... 47
3.5.2. Preparo das amostras ...................................................................................................... 48

3.5.3. Determinao do pH ....................................................................................................... 49
3.5.4. Doseamento da clorexidina ............................................................................................ 49
3.6. PROFUNDIDADE DE PENETRAO NOS TBULOS DENTINRIOS .................. 50
3.6.1. Obteno dos dentes humanos ........................................................................................ 50
3.6.2. Preparo das amostras ...................................................................................................... 50
3.7. ESTUDO IN VIVO ............................................................................................................ 52
3.7.1. Distribuio dos grupos e clculo do tamanho da amostra ............................................ 53
3.7.2. Induo das leses periapicais ....................................................................................... 54
3.7.3. Instrumentao e preenchimento do canal..................................................................... 54
3.7.4. Exame radiogrfico......................................................................................................... 54
3.7.5. Anlise histolgica ......................................................................................................... 55
3.7.6. Anlise Estatstica .......................................................................................................... 56
4. RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................... 57
4.1. PREPARO DAS NANOPARTCULAS CONTENDO CLOREXIDINA ........................ 57
4.1.1. Teste de solubilidade ...................................................................................................... 57
4.1.2. Preparo das nanocpsulas polimricas de clorexidina.................................................... 57
4.1.3. Preparo das NCL ............................................................................................................ 58
4.2. CARACTERIZAO DAS NCL ..................................................................................... 59
NCL.... ...................................................................................................................................... 64
4.3.1. Dimetro mdio das partculas e ndice de polidisperso............................................... 64
4.3.2. Anlise do pH e doseamento .......................................................................................... 68
4.4. AVALIAO IN VITRO DA DEGRADAO DA CLOREXIDINA ASSOCIADA
PASTA DE HIDRXIDO DE CLCIO ................................................................................. 71
4.4.1. Anlise do pH ................................................................................................................. 72
4.4.2. Doseamento .................................................................................................................... 73
4.5. ANLISE MICROBIOLGICA ...................................................................................... 75
4.5.1. Teste de difuso em gar ................................................................................................ 75
4.5.2. Concentrao inibitria mnima (CIM) .......................................................................... 77
4.6. PENETRAO DAS NANOPARTCULAS NOS TBULOS DENTINRIOS .......... 78
4.7. ESTUDO IN VIVO EM RATOS ....................................................................................... 84
4.7.1. Anlise radiogrfica ........................................................................................................ 84
4.7.2. Anlise histolgica ......................................................................................................... 87
5. CONCLUSO..................................................................................................................... 92
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................................. 94
ANEXOS ............................................................................................................................... 108
ANEXO 1 Validao da metodologia analtica para doseamento da clorexidina nas
suspenses e gis de nanopartculas. ................................................................................... 108
1. Especificidade..................................................................................................................... 108
2. Linearidade ......................................................................................................................... 109
3. Preciso e repetibilidade ..................................................................................................... 110
4. Exatido .............................................................................................................................. 111
ANEXO 2 Carta de aprovao pelo comit de tica para realizao do experimento em
ratos..... .................................................................................................................................. 113
ANEXO 3 Carta de aprovao do comit de tica para estudo utilizando dentes
humanos................................................................................................................................. 114
LISTA DAS FIGURAS
Figura
1:
Estrutura
dentria
sua
diviso
morfolgica.
http://dentistaemcuritiba.wordpress.com/2010/01/10/dentista-em-curitiba-tratamento-decanal/ ......................................................................................................................................... 20
Figura 2: Estrutura dentria, em destaque a presena dos tbulos dentinrios. ....................... 21
Figura 3: Estrutura dentria com presena de crie e contaminao do tecido pulpar. ............ 21
Figura 4: Micrografias mostrando a presena de E. faecalis no interior dos tbulos dentinrios
de dentes bovinos. Microscopia eletrnica de varredura (Hapassalo e Orstavik, 1987). ......... 22
Figura 5: Infeco dos tbulos dentinrios de dentes bovinos por E. faecalis. B&B stain
microscopia ptica (Hapassalo e Orstavik, 1987). ................................................................... 22
Figura 6: Esquema didtico demonstrando a sequncia de procedimento do tratamento
endodntico: preparo biomecnico, conometria e obturao. .................................................. 23
Figura 8: Estrutura qumica da clorexidina .............................................................................. 26
Figura 9: Representao esquemtica de (a) nanocpsulas e (b) nanoesferas; e B.
Representao esquemtica de nanopartculas lipdicas slidas (STROHER, ARMIJO e
RAFFIN, 2010). ........................................................................................................................ 33
Figura 10: Mtodo de obteno de nanopartculas lipdicas slidas contendo clorexidina por
altas taxas de cisalhamento. A) Fase oleosa; B) Fase aquosa; C) Ultra-Turrax ....................... 40
Figura 11: Fluxograma ilustrativo da microdiluio para determinao da CIM. ................... 45
Figura 12: Placas de 96 poos para microdiluio e definio das CIMs. ............................... 45
Figura 13: Desenho ilustrativo dos procedimentos realizados para o teste de difuso em gar
com cilindros de ao inoxidvel. .............................................................................................. 46
Figura 14: Esquema de distribuio das amostras na placa petri. ............................................ 47
Figura 15: Etapas realizadas para o preparo das amostras. A) e B) A associao dos gis
pasta de hidrxido de clcio foi feita na proporo 1:1, em peso; C) Mistura dos gis; D) Gis
armazenados em recipiente e ambiente apropriado. ................................................................. 48
Figura 16: Preparo das amostras para anlise em CLAE. A) Gis e pastas foram pesados em
um balo volumtrico de 10 mL; B) Os bales foram agitados no vortex por 5 minutos; C)
Gis levados para sonicar por 15 minutos; D) O contedo dos bales foi transferido para
tubos de ensaios e depois para centrfuga por 15 min. ............................................................. 49
Figura 17: Etapas realizadas para o processo de anlise das nanopartculas lipdicas no interior
do elemento dentrio. A) Padronizao das amostras; B) confeco de sulcos para o processo
de clivagem; C) Clivagem da estrutura dentria; D) Dessecador utilizado para o processo de

desidratao das amostras; E) Amostras fixadas em stub e metalizadas com ouro; F)
MEV/EDS utilizado para registro das micrografias e espectros. ............................................. 52
Figura 18: Fluxograma das etapas para o estudo in vivo. ......................................................... 56
Figura 19: Distribuio do tamanho mdio das partculas (nm) inicial das suspenses
contendo NCL 0,2 % (linha vermelha); 0,5 % (linha verde) e NBR (linha azul). ................... 60
Figura 20: Valores referentes a sobreposio dos grficos do potencial zeta (mV) (A) da
suspenso e gel de NCL 0,2 %; (B) da suspenso e gel NCL 0,5 %; (C) suspenso e gel NBR;
e (D) suspenso e gel do frmaco livre. As linhas vermelhas representam o potencial zeta
inicial, e as linhas verdes aps os 90 dias. ................................................................................ 62
Figura 21: Valores referentes a sobreposio dos grficos do tamanho mdio das partculas
(nm) (A) da suspenso e gel de NCL 0,2 %; (B) da suspenso e gel de NCL 0,5 %; (C)
suspenso e gel de NBR. As linhas vermelhas representam as suspenses e as linhas verdes os
gis. ........................................................................................................................................... 63
Figura 22: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio de partcula das suspenses de NCLs
(A) 0,2% e (B) 0,5% no tempo 0 (linhas vermelhas) e aps 90 dias de armazenamento em TA
(linhas verdes), GE (linhas azuis) e ES (linhas pretas)............................................................. 65
Figura 23: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio de partcula das suspenses NBRs no
tempo 0 (linha vermelha) e aps 90 dias de armazenamento em TA (linha verde), GE (linha
azul) e ES (linha preta). ............................................................................................................ 66
Figura 24: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio das partculas dos gis de NCLs (A)
0,2 % e (B) 0,5 % no tempo 0 (linhas vermelhas) e aps 90 dias de armazenamento em TA
(linhas azuis), GE (linhas verdes) e ES (linhas pretas) ............................................................ 67
Figura 25: Proliferao fngica nas amostras dos gis de NBRs armazenadas em GE e ES. .. 68
Figura 26: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio das partculas dos gis de NBRs no
tempo 0 (linha vermelha) e aps 90 dias de armazenamento em TA (linha verde). ................ 68
Figura 27: Sobreposio de cromatogramas correspondente ao gel de NCL 0,5 % (linha preta)
e NCL 0,5 % HCA aps 2 (linha vermelha) e 14 dias (linha rosa). ......................................... 74
Figura 28: Placas aps o perodo de 72 horas para anlise do dimetro com paqumetro
digital. ....................................................................................................................................... 76
Figura 29: Micrografia eletrnica da exposio dos tbulos dentinrios aps o processo de
remoo da smear layer nas amostras do grupo controle......................................................... 79
Figura 30: Microscopia eletrnica de varredura. A) Micrografia eletrnica da deposio das

NCL sobre a superfcie dentria. B) Micrografia eletrnica da presena de NCL no interior
dos tbulos dentinrios. ............................................................................................................ 80
Figura 31: A) Micrografia da estrutura dentria com a suspenso de NCL depositada (1) sobre
a luz do canal e (2) no interior dos tbulos dentinrios. B) Espectro do EDS mostrando
presena de cloro (1) na superfcie dentria e em menor quantidade de tomos cloro (2) no
interior dos tbulos dentinrios. ............................................................................................... 81
Figura 32: Micrografias de NCL obliterando a entrada dos tbulos dentinrios (A) em gel e
(B) em suspenso. ..................................................................................................................... 82
Figura 33: Micrografia dos tbulos dentinrios. A) em gel. B) em suspenso. ....................... 82
Figura 34: A) Micrografia de NCL na superfcie dentria e no interior dos tbulos dentinrios
e B) seus respectivos espectros em EDS. ................................................................................. 83
Figura 35: A) Micrografia da regio apical do canal radicular e mnima presena de
NCLsobre a superfcie dentinria, confirmada B) pelo espectro do EDS que identificou
pequena quantidade de cloro. ................................................................................................... 83
Figura 36: Imagens radiogrficas representativas das leses periapicais em ratos aps a
utilizao de medicao intracanal de acordo com cada grupo: (A) Controle; (B) Gel CL 0,5
%; (C) Gel NCL 0,5 %; (D) Gel NBR; (E) Gel CL 0,5 % HCA; (F) Gel NCL 0,5 % HCA; (G)
HCA. ......................................................................................................................................... 85
Figura 37: Grfico referente s reas de radiolucidez das leses periapicais a partir das
imagens radiogrficas aps o tratamento com diferentes medicaes intracanal. ................... 86
Figura 38: Imagens das lminas histolgicas representativas das leses periapicais em ratos
aps a utilizao de medicao intracanal de acordo com cada grupo: (A) Controle; (B) Gel
CL 0,5 %; (C) Gel NCL 0,5 %; (D) Gel NBR; (E) Gel CL 0,5 % HCA; (F) Gel NCL 0,5 %
HCA; (G) HCA......................................................................................................................... 88
Figura 39: Grfico referente aos escores do infiltrado inflamatrio a partir da anlise
histopatolgica .......................................................................................................................... 89
Figura 40: Sobreposio de cromatogramas: linha azul correspondente a nanopartcula
lipdica sem a presena de frmaco; linha preta correspondente ao hidrxido de clcio e linha
vermelha correspondente amostra padro de clorexidina....................................................... 108
Figura 41: Curva padro da clorexidina obtida por CLAE. ................................................... 110
Figura 42: Fluxograma do teste de exatido. .......................................................................... 111
LISTAS DAS TABELAS
Tabela 1: Componentes utilizados na fase orgnica para o preparo das suspenses contendo
nanocpsulas de clorexidina. .................................................................................................... 38
Tabela 2: Componentes da fase oleosa utilizados no preparo de suspenses contendo NCL. . 39
Tabela 3: Diviso dos grupos de acordo com a medicao testada para determinao da CIM.
.................................................................................................................................................. 44
Tabela 4: Diviso dos grupos de acordo com a formulao. .................................................... 47
Tabela 5: Distribuio dos grupos. ........................................................................................... 51
Tabela 6: Distribuio dos animais nos diferentes grupos experimentais. ............................... 53
Tabela 7: Composio das nanocpsulas polimricas alterada por este estudo. ...................... 58
Tabela 8: Valores referentes caracterizao fsico-qumica das suspenses contendo NCL
0,2 e 0,5 % e NBR, e do frmaco livre um dia aps sua obteno (+DP). ............................... 59
Tabela 9: Valores referentes caracterizao fsico-qumica dos gis contendo NCL 0,2 e 0,5
% e NBR, e frmaco livre um dia aps sua obteno (+DP). .................................................. 61
Tabela 10: Dimetro mdio das partculas e IPD das suspenses de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR
(+DP). ....................................................................................................................................... 65
Tabela 11: Dimetro mdio das partculas e IPD dos gis de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR (+DP).
.................................................................................................................................................. 67
Tabela 12: Mdia do pH e doseamento das suspenses de NCLs 0,2 e 0,5 %, NBR e CL
(+DP). ....................................................................................................................................... 69
Tabela 13: Mdia do pH e doseamento dos gis de NCLs 0,2 e 0,5 %, NBR e CL (+DP). ..... 70
Tabela 14: pH inicial e final de cada formulao. .................................................................... 72
Tabela 15: Concentrao inicial (%) de frmaco e aps o perodo de 14 dias nos diferentes
grupos, e sua reduo neste perodo. ........................................................................................ 74
Tabela 16: Mdia dos halos de inibio (mm) + DP da soluo de CL e das NCL. ................ 76
Tabela 17: CIM de acordo com a formulao e o tipo de microrganismo. .............................. 77
Tabela 18: Anlise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro. ................................ 81
18
1. INTRODUO
A estrutura dentria formada por esmalte, dentina e cemento. A dentina composta

por inmeros tbulos dentinrios que possuem dimetro variando de 2,5 m (prximo
polpa) a 1 m (na juno dentina-esmalte e cemento-dentina) totalizando aproximadamente
15.000 tbulos em 1 mm2 de dentina prximo juno cemento-dentina. Pela presena de
cries, fraturas ou desgastes da estrutura dentria, os microrganismos podem penetrar,
multiplicar-se e invadir numerosos tbulos expostos (COHEN e BURNS, 1998) e, devido ao
dimetro, podem alcanar uma profundidade de 200 m nas reas cervical e mdia da raiz, e
cerca de 60 m na regio apical (LOVE, 1996).
As bactrias que penetram nos tbulos dentinrios so a principal causa das
inflamaes pulpares e periapicais. Devido a isso, o objetivo do tratamento endodntico
elimin-las dos canais radiculares, para possibilitar a resoluo e o reparo dos tecidos
perirradiculares danificados pela ao bacteriana (COHEN e BURNS, 1998).
Para auxiliar no processo de desinfeco do canal principal e seus tbulos dentinrios
so utilizados agentes qumicos, como solues irrigadoras, e medicamentos intracanal
(LEONARDO, 2008).
O uso de medicaes intracanal tem sido defendido por alguns autores (HELING et al,
1992; EVANS et al, 2003; SIRN et al, 2004, VIANNA et al, 2004; SOARES et al, 2006;
LEONARDO, 2008) por reduzir o nmero de microrganismos que resistiram ao preparo
biomecnico, tornando o sistema de canais radiculares um meio imprprio para o seu
desenvolvimento e proliferao.
Dentre as alternativas de medicao intracanal, encontra-se a clorexidina, que vem
sendo amplamente pesquisada devido a inmeras qualidades que apresenta, como ao
antimicrobiana imediata e amplo espectro antimicrobiano sobre bactrias Gram-positivas,
Gram-negativas, anaerbicas facultativas e aerbias, alm de atuar tambm em leveduras e
fungos (HENNESSEY, 1973; SEN, SAFAVI, SPANGBERG, 1999).
Para potencializar os benefcios da clorexidina, podemos buscar auxlio na
nanotecnologia, atravs de sistemas de liberao controlada de frmacos, que apresentam
diversas vantagens sobre o sistema de administrao convencional. Dentre as vantagens,
destacam-se a maior eficcia teraputica, proporcionada pela liberao progressiva e
controlada do frmaco a partir da nanopartcula e, a diminuio significativa da toxicidade por
19
utilizar menor concentrao do frmaco e possuir maior tempo de ao. Alm disso, esse
sistema evita a instabilidade e decomposio do frmaco (bio-inativao prematura); alm de
possibilitar a penetrao mais profunda nos tecidos em decorrncia do seu reduzido tamanho
(NHUNG et al, 2007).
1.1. OBJETIVOS
Apesar dos inmeros medicamentos utilizados entre as sesses do tratamento

endodntico, ainda no existe um frmaco ideal. Desta forma, este estudo visa: (i)
desenvolver e caracterizar nanopartculas contendo clorexidina, bem como avaliar sua
estabilidade; (ii) avaliar in vitro o processo de degradao da clorexidina livre e na forma de
nanopartcula aps seu mistura com pasta de hidrxido de clcio; (iii) avaliar a ao
antimicrobiana in vitro em cepas de Enterococcus faecalis e Candida albicans, e suas
respectivas concentraes inibitrias mnimas; (iv) avaliar in vitro a penetrao das
nanopartculas no interior dos tbulos dentinrios de dentes humanos extrados e, por fim, (v)
avaliar sua ao como medicao intracanal in vivo em dentes de ratos com leso periapical, a
partir da anlise da resposta histolgica e radiogrfica, colaborando com o desenvolvimento
de medicamentos mais modernos, completos, eficientes e com menores efeitos indesejveis.
20
2. REFERENCIAL TERICO
2.1. A ESTRUTURA DENTRIA
A estrutura dentria (Figura 1) composta por uma poro coronria e uma poro
radicular. A poro mais interna apresenta uma cmara pulpar que preenchida por um feixe
vsculo-nervoso chamado de polpa. Na poro coronria, a dentina recoberta pelo esmalte, e
na poro radicular, a dentina recoberta pelo cemento.
Figura 1: Estrutura dentria e sua diviso morfolgica.

http://dentistaemcuritiba.wordpress.com/2010/01/10/dentista-em-curitiba-tratamento-de-canal/
A dentina apresenta vrios tbulos dentinrios em toda sua extenso, que so

preenchidos por prolongamentos de clulas especializadas, os odontoblastos (BHASKAR,
1989). O nmero de tbulos dentinrios aumenta consideravelmente da parte mdia at
prximo polpa (MARSHALL et al, 1997). Assim como seu dimetro, que pode chegar a
2,5 m prximo polpa, enquanto que na juno esmalte-dentina de 0,8 m.
Schilke e colaboradores (2000) estudaram o nmero e o dimetro dos tbulos
dentinrios em humanos e encontraram na camada de dentina mais profunda,
aproximadamente, 21.343 tbulos/mm2 com dimetro mdio de 2,90 m, e na poro mdia
21
da dentina cerca de 18.781 tbulos/mm2 com dimetro mdio de 2,65 m, confirmando que
quanto mais prximo a polpa, maior o dimetro e quantidade de tbulos dentinrios
presentes (MARSHALL et al, 1997) (Figura 2) .
Figura 2: Estrutura dentria, em destaque a presena dos tbulos dentinrios.

http://periodontiaonline.blogspot.com/2011/03/sensibilidade-dental-uma-luz-no-fim-do.html
Muitos destes tbulos dentinrios podem ficar expostos devido presena de cries
(Figura 3), fraturas ou desgastes da estrutura dentria. Quando expostos, microrganismos
podem penetrar para o seu interior colonizando toda esta regio (COHEN e BURNS, 1998).
Figura 3: Estrutura dentria com presena de crie e contaminao do tecido pulpar.

http://sites.amarillasinternet.com/sorridente/servicos.html
22
Como os tbulos apresentam dimetro muito maior que os microrganismos, estes
podem alcanar grandes profundidades de penetrao. Haapasalo e Orstavik (1987) foram os
primeiros pesquisadores a introduzir um modelo para infeco e desinfeco da dentina
radicular, in vitro, atravs de cilindros de dentina obtidos de razes de incisivos bovinos
contaminados por Enterococcus faecalis (E. faecalis) pelo perodo de 21 dias. Os autores
analisaram sua penetrao nos tbulos dentinrios atravs da microscopia eletrnica de
varredura (Figura 4) e ptica aps colorao especfica (Brown e Brenn) e, observaram, que
na infeco leve, a profundidade de penetrao foi de 300 400 m, na infeco moderada de
400 500 m, e em infeco severa chegou a 800 1000 m (Figura 5).
Figura 4: Micrografias mostrando a presena de E. faecalis no interior dos tbulos dentinrios de dentes
bovinos. Microscopia eletrnica de varredura (Hapassalo e Orstavik, 1987).
Figura 5: Infeco dos tbulos dentinrios de dentes bovinos por E. faecalis. B&B stain microscopia
ptica (Hapassalo e Orstavik, 1987).
Estes microrganismos que penetram nos tbulos dentinrios so a principal causa das
inflamaes e infeces pulpares e periapicais.
23
2.2. O TRATAMENTO ENDODNTICO
As alteraes sistmicas so consideradas um grande problema de sade no Brasil e

tambm no mundo. No entanto, algumas complicaes odontolgicas podem intervir na
condio da sade geral do paciente, principalmente se ele apresentar alteraes
cardiovasculares, diabetes mellitus, entre outros, devendo ser a preveno o melhor
tratamento. Portanto, mais do que necessrio, importante eliminar riscos de complicaes e
melhorar qualitativamente a vida do paciente (GROSSI et al, 1997).
Desta forma, o tratamento endodntico tem por objetivo eliminar os microrganismos
presentes no sistema de canais radiculares, remover o tecido pulpar desintegrado que pode
servir como substrato para o crescimento microbiano, preencher e vedar o espao endodntico
com material inerte, estvel e compatvel, impedindo a recolonizao bacteriana, evitando a
periodontite apical (PINHEIRO et al, 2009; RICUCCI et al, 2009, SINGLA et al, 2009)
(Figura 6).
Figura 6: Esquema didtico demonstrando a sequncia de procedimento do tratamento endodntico:

preparo biomecnico, conometria e obturao.
http://drarebecamoura.blogspot.com/2010/12/desmistificando-o-tratamento-de-canal.html
Para obteno de sucesso no tratamento, a desinfeco do sistema de canais

radiculares com a presena de processo infeccioso fundamental na terapia endodntica. A
anatomia do canal radicular complexa, contendo muitas ramificaes e irregularidades
morfolgicas, proporcionando um ambiente favorvel para a colonizao de microrganismos,
dificultando o processo de desinfeco (LEE et al, 2008; MILLER e BAUMGARTNER,
2010).
24
A morfologia complexa do sistema de canais radiculares determina reas inacessveis
do preparo biomecnico como canais laterais, acessrios, secundrios, intercondutos, deltas
apicais e tbulos dentinrios, contribuindo para a permanncia de microrganismos nessas
regies (LIN et al., 1991; SIQUEIRA; UZEDA; FONSECA, 1996).
Uma reduo significativa no nmero de microrganismos presentes no canal principal
se obtm pela da ao dos efeitos qumicos e mecnicos da irrigao e da instrumentao
(SJOGREN et al, 1990; HOLLAND, SOARES, SOARES, 1992; TROPE, DELANO,
ORSTAVIK, 1999).
O hipoclorito de sdio a soluo irrigante mais comum usada em endodontia desde
1900. Pode ser utilizado sozinho ou em combinao com uma soluo quelante, como o cido
etilenodiaminotetractico (EDTA), que reduz as bactrias e elimina a lama dentinria (smear
layer) aderida s paredes do canal radicular, promovendo um aumento da permeabilidade e
melhorando o selamento das obturaes (AKISUE et al, 2010; DEWSNUP et al, 2010).
Um estudo publicado por Schlafer e colaboradores (2010) assegura que no possvel
acessar os canais laterais e suas ramificaes apicais com a instrumentao mecnica. Por
isso, usam-se mtodos de desinfeco qumica que tm efeito bactericida, para complementar
o mtodo mecnico. Conforme Akisue e colaboradores (2010), a utilizao de hipoclorito de
sdio em um intervalo de concentraes de 0,5 % a 5,25 % um eficaz agente
antimicrobiano. Porm, em baixas concentraes, ineficaz contra microrganismos
especficos e, em altas concentraes, tem pouca biocompatibilidade, causando inflamao
periapical.
Com tal complexidade, alguns microrganismos permanecem viveis nestas regies de
difcil acesso (SJOGREN et al, 1990; HOLLAND, SOARES, SOARES, 1992; TROPE,
DELANO, ORSTAVIK, 1999), apresentando um rpido crescimento quando o canal
deixado vazio, sem uma medicao intracanal entre as sesses (SJOGREN et al, 1991;
TROPE, BERGENHOLTZ, 2002).
Por se tornar um auxiliar importante, a medicao intracanal deve possuir ao
antimicrobiana com potencial para eliminar microrganismos remanescentes ao preparo
qumico-mecnico; promover a reparao dos tecidos periapicais (SJOGREN et al, 1990;
HOLLAND, SOARES, SOARES, 1992; TROPE, DELANO, ORSTAVIK, 1999); funcionar
como uma barreira fsica, impedindo o suprimento de substrato, ocupando espao a fim de
limitar a multiplicao microbiana (CHONG, PITT FORD, 1992). Alm disso, deve reduzir a
25
inflamao periapical; apresentar capacidade de solubilizar matria orgnica, pois a
permanncia de resduos pode funcionar como reservatrio de microrganismos (LOPES,
SIQUEIRA, 2004);
ter a capacidade de
neutralizar produtos
txicos
como o
lipopolissacardeo (LPS) bacteriano, que uma endotoxina que exerce importante papel na
etiopatogenia das doenas da polpa e dos tecidos perirradiculares (TANOMARU et al, 2003).
Ainda, eliminar o exsudato persistente; no provocar agresso aos tecidos periapicais;
estimular o reparo por tecido mineralizado e, combater reabsoro dentinria (LOPES,
SIQUEIRA, 2004).
Dentre as substncias de escolha est o hidrxido de clcio, que foi introduzido
inicialmente como um agente de capeamento pulpar em 1930, e, desde ento, tem sido usado
na terapia endodntica como medicao intracanal (KRITHIKADATTA et al, 2007;
SIQUEIRA et al, 2007; TURK et al, 2009). O hidrxido de clcio tem recebido destaque
especial por apresentar certa atividade antimicrobiana, capacidade de neutralizar toxinas,
manter o selamento temporrio do canal e estimular a reparao dos tecidos localizados na
regio periapical (ESTRELA et al, 1999). Porm, o tempo necessrio para que o hidrxido de
clcio desempenhe suas propriedades de pelo menos duas semanas (NERWICH, FIDGOR,
MESSER, 1993; TAKAHASHI et al, 1996) e, ainda, deve ocorrer a manuteno de altas
concentraes de hidroxila para que mantenha o pH em nveis extremamente elevados
(ESTRELA et al, 1999; SJOGREN et al, 1991).
Alm disso, o hidrxido de clcio no consegue eliminar os microrganismos que se
encontram mais profundamente nos tbulos dentinrios ou no sistema de canais radiculares
devido a sua baixa solubilidade ou capacidade de difuso (ESTRELA et al, 1999; ERCAN et
al; 2007), ou seja, no age quando no h contato direto com o microrganismo e os stios mais
distantes acabam por no ter uma elevao significativa do pH (ESTRELA et al, 1995; 1999;
2001).
Para complementar a ao do hidrxido de clcio, o uso da clorexidina tem sido
sugerido por diversos autores (HELING et al, 1992; EVANS et al, 2003; SIRN et al, 2004,
SOARES et al, 2006; LEE et al, 2008).
Um estudo publicado em 2008 por Lee e colaboradores descreve que o hidrxido de
clcio um excelente agente antimicrobiano para canais radiculares infectados; porm,
menos eficaz frente a E. faecalis e C. albicans, microrganismos frequentemente isolados nos
casos de infeces persistentes de canais radiculares, havendo a necessidade de utilizar
medicao intracanal alternativa, como a clorexidina, que possui capacidade de adsoro
26
dentina, facilitando a erradicao da flora resistente terapia. Para que haja a mxima
atividade antimicrobiana, a superfcie da infeco dentinria deve ser exposta a uma soluo
concentrada de clorexidina por um perodo suficiente.
Siqueira e Sen (2004) referem que medicamentos como a clorexidina e o hidrxido de
clcio em associaes tm potencial para serem utilizados como medicamentos intracanal em
suspeita de infeco fngica e bacteriana. Para Turk e colaboradores (2008), a combinao
desses antimicrobianos melhora as suas atividades e o equilbrio de suas deficincias contra
infeces polimicrobianas.
2.3. A CLOREXIDINA
Em 1940, nos laboratrios de pesquisa da Imperial Chemical Industries Ltda.,

Macclesfield, Inglaterra, a clorexidina foi desenvolvida para ser utilizada como um agente
antiviral; porm, foi abandonada devido sua ineficincia. Anos mais tarde, foi redescoberta
devido sua eficcia antibacteriana (ZEHNDER et al, 2006) (Figura 7).
Figura 7: Estrutura qumica da clorexidina

Fonte: PUBCHEM, 2008.
A clorexidina representada pela frmula molecular de C22H30Cl2N10, com massa

molar de 505,4 g/mol (PUBCHEM, 2008).
A clorexidina composta estruturalmente por dois anis clorofenlicos nas
extremidades, ligados a um grupamento bisguanida de cada lado, conectados por uma cadeia
central de hexametileno (DENTON, 1991). Esta bibisguanida catinica uma base forte, mais
27
estvel na forma de sal, sendo praticamente insolvel em gua. Os sais originalmente
produzidos foram o acetato de clorexidina e cloridrato de clorexidina, mas devido a sua baixa
solubilidade em gua foram substitudos, com o passar do tempo, pelo sal atualmente usado, o
gluconato de clorexidina (ZAMANY et al, 2003; ZEHNDER, 2006).
As solues aquosas de clorexidina so mais estveis em valores de pH de 5 a 8.
Acima deste valor, ocorre precipitao da clorexidina, enquanto que em pH cido, h reduo
da sua atividade, devido perda da estabilidade da soluo. Em pH fisiolgico, exerce
excelente atividade antimicrobiana, proporcionada pela liberao das molculas de carga
positiva (PARSONS et al, 1980; RINGEL et al, 1982) .
O efeito antimicrobiano da clorexidina se d pela atrao e adsoro das molculas
catinicas da clorexidina superfcie celular dos microrganismos (que carregada
negativamente). Esta interao promove a alterao da permeabilidade da membrana celular,
resultando na perda dos componentes intracelulares e no desequilbrio osmtico da clula
(HENNESSEY, 1973; DELANY et al, 1982; GOMES et al, 2006). Em pH neutro,
rapidamente adsorvida superfcie celular dos microrganismos, fazendo com que a
concentrao de molculas livres de clorexidina na soluo seja baixa (DAVIES, 1973;
BONESVOLL et al, 1974).
Alm da atividade antimicrobiana de amplo espectro, a clorexidina apresenta a
caracterstica de substantividade, que a atividade resultante da adsoro e da subsequente
liberao da clorexidina, pela sua capacidade de ligao de forma reversvel s superfcies
dentais (especificamente na hidroxiapatita, presente no esmalte e dentina) e mucinas salivares,
sendo lentamente liberada para o ambiente medida que sua concentrao no meio decresce
permitindo, desse modo, um tempo de atuao prolongado, prevenindo a colonizao
bacteriana e o desenvolvimento do biofilme (BASRANI et al, 2002; GOMES et al, 2006;
SOARES et al, 2007).
A sua substantividade foi observada mantendo sua ao antimicrobiana pelo perodo
de 48 h (SCHAFER e BOSSMANN, 2005) e 72 horas (SIRN et al, 2004) aps ser removida
do canal radicular, o que no ocorre com os demais desinfetantes que rapidamente se dissipam
e no apresentam efeito antimicrobiano residual. Porm, quanto maior o contato com os
tecidos periapicais, dependendo da sua concentrao, maior sero os efeitos txicos sobre
estes tecidos.
28
Hoje em dia, o digluconato de clorexidina amplamente utilizado nas reas mdica,
odontolgica, veterinria e alimentar. Na odontologia, sua aplicao ocorre h alguns anos
como um potente agente anti-sptico utilizado principalmente como agente ativo de
enxaguatrios bucais, agindo no controle da placa bacteriana e no tratamento de infeces
periodontais.
Na endodontia, tem sido proposto na forma de lquido ou gel, em diferentes
concentraes, tanto como agente irrigante durante o preparo qumico-mecnico (PARSONS
et al, 1980; DELANY et al, 1982; JEANSONNE e WHITE, 1994; LEONARDO et al, 1999;
FERRAZ et al, 2001; ZAMANY et al, 2003; ERCAN et al, 2006), quanto como medicao
intracanal (HELING et al, 1992; SIQUEIRA e UZEDA, 1997; LINDKOG et al, 1998;
GOMES et al, 2003; SOARES et al, 2007; VIANNA et al, 2007).
Alguns estudos demonstraram que a atividade antimicrobiana da clorexidina lquida
igual ou superior ao gel quando o contato direto foi adotado como metodologia (FERRAZ et
al, 2001; GOMES et al, 2001; VIANNA et al, 2004). Por outro lado, a clorexidina em gel
facilita a instrumentao, melhorando a capacidade dos instrumentos em eliminar tecidos
orgnicos, compensando sua capacidade de dissolv-lo e diminuindo a formao de smear
layer (FERRAZ et al, 2001). A smear layer foi definida por Sen e colaboradores (1995) como
sendo uma camada amorfa, irregular e granular, composta por restos e raspas de dentina,
remanescentes de tecido pulpar e bactrias, que acabam se depositando e obturando a entrada
dos tbulos dentinrios prejudicando a ao dos agentes irrigantes e medicao intracanal.
A clorexidina apresenta amplo espectro de ao sobre linhagens Gram-positivas e
negativas (HENNESSEY, 1973), mas de fundamental importncia sua ao sobre a espcie
Gram-positiva E. faecalis (BASRANI et al, 2002) e ao fungo C. albicans (WALTIMO et al,
1999, PAQUETTE et al, 2007), devido relao destes microrganismos com o insucesso
endodntico, por persistirem ao protocolo qumico-mecnico convencional de desinfeco do
canal radicular.
Apesar de todas estas qualidades, o digluconato de clorexidina pode ser inativado por
compostos aninicos (PRADO et al, 2004) e no atua, significantemente, na neutralizao do
LPS bacteriano, mesmo em concentraes mais elevadas.
A concentrao de clorexidina (na forma de digluconato) normalmente utilizada varia
entre 0,12 e 2,0 %; porm, em concentraes iguais ou inferiores a 0,25 % menos agressiva
exibindo reaes inflamatrias mais brandas, no provocando necrose tecidual nem edema
29
persistente. Em concentraes iguais ou maiores a 0,5 % produz necrose tecidual e exacerba o
processo inflamatrio retardando o processo de reparao tecidual do periodonto apical
(PRADO et al, 2004; FARIA et al, 2007). Isso se deve a formao da para-cloroanilina, que
um subproduto gerado a partir da hidrlise da clorexidina em funo do tempo, do pH e do
aquecimento. uma amina aromtica que tem se mostrado txica para humanos provocando
hemlise, metahemoglobinemia e cianose (BASRANI et al, 2007). Alm disso, a paracloroanilina faz parte do Grupo 2B da IARC (International Agency of Research on Cancer)
formado por substncias que possuem possvel ao carcinognica em humanos (IARC,
1997b).
Um maior interesse pela utilizao da clorexidina como agente de desinfeco dos
canais radiculares surgiu para incrementar as propriedades antimicrobianas do hidrxido de
clcio, j que alguns microrganismos tm mostrado capacidade de sobrevivncia ao pH
elevado, principalmente o E. faecalis e C. albicans. A adio da clorexidina poderia
proporcionar maior atividade antimicrobiana e conferir maior substantividade formulao
(TANOMARU et al., 2002).
Evans e colaboradores (2003) compararam o efeito antimicrobiano da pasta de
hidrxido de clcio e da sua associao com clorexidina 2 % utilizando um modelo
experimental in vitro. Incisivos bovinos foram padronizados e contaminados com E. faecalis
por 1 semana. Aps este perodo, as raspas de dentina foram coletadas e semeadas em gar
BHI. A contagem das unidades formadoras de colnia foi feita aps a incubao e revelaram
que a associao do hidrxido de clcio com clorexidina foi significantemente mais eficaz na
eliminao de E. faecalis que o uso isolado de hidrxido de clcio.
Basrani e colaboradores (2003) utilizaram diferentes modelos experimentais para
avaliar o desempenho antimicrobiano da clorexidina (0,2 e 2 % lquida ou gel) e hidrxido de
clcio (isolado ou em associao clorexidina gel a 0,2 %) contra E. faecalis atravs do teste
de difuso em gar por 48 horas e pelo mtodo de desinfeco da dentina radicular humana in
vitro aps 7 dias da aplicao das medicaes. Tanto o teste de difuso em gar como o teste
de desinfeco da dentina radicular, mostrou uma superioridade da clorexidina gel 2 % e da
soluo de clorexidina 2 % sem diferena estatstica entre elas. O hidrxido de clcio
apresentou os piores resultados, confirmando que a clorexidina mais efetiva para eliminao
do E. faecalis in vitro.
Basrani, Ghanem e Tjaderhane (2004) avaliaram a associao entre o hidrxido de
clcio e a clorexidina com o objetivo de determinar se as propriedades fsico-qumicas da
30
formulao seriam adequadas para uma boa medicao intracanal. Os resultados mostraram
que a clorexidina no afetou o elevado pH do hidrxido de clcio, nem sua radiopacidade e
tempo de trabalho; porm, diminuiu a tenso superficial e aumentou a viscosidade do
hidrxido de clcio, confirmando que a associao das duas medicaes apresenta
propriedades fsico-qumicas satisfatrias.
Schafer e Bossmann (2005) analisaram a eficcia antimicrobiana da clorexidina e do
hidrxido de clcio contra E. faecalis in vitro. Para isso, 40 dentes humanos foram
padronizados, esterilizados e infectados com E. faecalis por 9 dias. Aps este perodo, foi
feita a diviso em 4 grupos para preenchimento do canal com as seguintes medicaes: pasta
de hidrxido de clcio, soluo de clorexidina 2 %, associao de hidrxido de clcio
soluo de clorexidina 2 % numa proporo 1:1, e gua destilada. Tais medicaes
permaneceram no interior do canal radicular por 3 dias, para posterior coleta das raspas de
dentina, que foram levadas para anlise microbiolgica. Como resultados, a clorexidina 2 %
foi significantemente mais eficaz que a pasta de hidrxido de clcio e a associao de ambos,
e no foi observado aumento na eficcia antimicrobiana do hidrxido de clcio associado
clorexidina 2 %.
Barbin e colaboradores (2008) analisaram quimicamente a presena de paracloroanilina, por meio da espectrometria de massas e cromatografia lquida, na soluo de
clorexidina 0,2 % isolada ou em associao com o hidrxido de clcio. As anlises foram
realizadas em seguida ao preparo das amostras e aps o perodo de 7 e 14 dias. Na soluo de
clorexidina foi encontrada a presena de para-cloroanilina aps os 14 dias. Quando em
associao com hidrxido de clcio, houve decomposio total da clorexidina em diferentes
compostos, porm, no foi demonstrada a presena de para-cloroanilina.
Para avaliar se a associao entre o hidrxido de clcio e a clorexidina 0,4 % afetava o
desenvolvimento do fentipo osteognico in vitro, da Silva e colaboradores (2008) analisaram
a morfologia e a atividade celular, a atividade da enzima fosfatase alcalina, teor de protena
total, imunolocalizao de sialoprotena no tecido sseo e a formao de ndulos
mineralizados. Os resultados mostraram que a associao entre a pasta de hidrxido de clcio
e clorexidina 0,4 % no afetou o desenvolvimento do fentipo osteognico.
Delgado e colaboradores (2010) avaliaram a eficcia do hidrxido de clcio e do gel
de clorexidina 2 % contra E. faecalis presentes nos tbulos dentinrios in vitro. Foram
utilizados 60 dentes humanos. Estes foram contaminados e, posteriormente, tratados com
hidrxido de clcio, gel de clorexidina 2 %, associao do hidrxido de clcio com o gel de
31
clorexidina 2 % e salina como grupo controle. As amostras de dentinas foram obtidas nas
profundidades de 0 100 e de 100 200 m. Estas foram levadas para contagem de unidade
formadora de colnias (UFC) e para anlise da viabilidade bacteriana atravs da microscopia
de fluorescncia. Como resultados, tanto a clorexidina como o hidrxido de clcio
apresentaram ao antimicrobiana contra o E. faecalis, porm, a clorexidina apresentou maior
atividade antimicrobiana quando comparada com o hidrxido de clcio, e a clorexidina
associada com o hidrxido de clcio teve uma ao semelhante a clorexidina isolada.
Vaghela e colaboradores (2011) avaliaram eficcia antimicrobiana no processo de
desinfeco de tbulos dentinrios utilizando como veculos para o hidrxido de clcio o
propilenoglicol e iodofrmio em leo de silicone em comparao ao gel de clorexidina a 2 %
conta E. faecalis e C. albicans. O estudo in vitro utilizou blocos de dentes humanos e as
raspas de dentina foram removidas numa profundidade de 200 m e 400 m. Como grupo
controle foi utilizado salina. O gel de clorexidina a 2 % apresentou uma efetividade
antibacteriana e antifngica superior aos demais grupos. O tipo de veculo alterou as
propriedades antimicrobianas do hidrxido de clcio: quando associado ao propilenoglicol, o
hidrxido de clcio teve maior ao antibacteriana contra o E. faecalis, e quando associado ao
iodofrmio com leo de silicone, o hidrxido de clcio apresentou uma maior ao
antifngica contra C. albicans.
Kayaoglu e colaboradores (2011) compararam a atividade antibacteriana da prpolis
com clorexidina a 2 % e o hidrxido de clcio em um estudo in vitro contra E. faecalis. As
raspas de dentina foram coletadas nos tempos de 1 e 7 dias aps o uso da medicao
intracanal e concluram que a clorexidina foi desinfetante mais potente nos dois tempos e que
a ao antibacteriana do prpolis foi semelhante ao hidrxido de clcio.
Com o objetivo de avaliar a influncia do gel de clorexidina a 2 % sobre a o pH, a
liberao de clcio e a capacidade de reduo de endotoxinas da pasta de hidrxido de clcio,
Signoretti e colaboradores (2011) realizaram um estudo, com durao de 30 dias, onde o
grupo I era formado por hidrxido de clcio em soluo salina, grupo II hidrxido de clcio
associado a clorexidina 2 % e grupo III formado por clorexidina 2 %. O grupo I e II
apresentaram um pH alcalino durante todo o estudo porm, o grupo I apresentou maior valor
de pH que o grupo II aps os 30 dias. Em relao liberao de clcio, o grupo II liberou
mais clcio que o grupo I aps 15 dias. E o grupo II e III apresentou uma maior reduo de
endotoxinas quando comparado ao grupo I. Foi observado que, in vitro, a adio da
clorexidina no interfere nas propriedades qumicas do hidrxido de clcio e que nenhuma das
32
pastas avaliadas pode reduzir completamente o teor de endotoxinas; porm, a adio de
clorexidina ao hidrxido de clcio, aumentou a reduo de endotoxinas em comparao ao
uso isolado.
2.4. AS NANOPARTCULAS
So sistemas de liberao controlada de frmacos e apresentam como principais

vantagens ao sistema de dosagem convencional, a maior eficincia teraputica pela liberao
progressiva e controlada do frmaco encapsulado, necessidade de menor concentrao do
mesmo e, por isso, diminuio significativa da toxicidade e, promoo de um maior tempo de
ao (NHUNG et al, 2007).
As nanopartculas lbeis podem-se apresentar na forma de lipossomas, nanoemulses,
nanopartculas polimricas (nanoesferas e nanocpsulas), e nanopartculas lipdicas slidas.
As nanopartculas polimricas so carreadores de frmacos, que apresentam tamanho
inferior a 1 m, e so compostas, principalmente, por polmeros biodegradveis. Podem ser
nanocpsulas ou nanoesferas que diferem entre si pela sua composio e organizao
estrutural (SCHAFFAZICK et al, 2003) como mostra a Figura 8A.
As nanoesferas no apresentam leo em sua composio e, por isso, no apresentam
um ncleo oleoso definido e, sim, um sistema monoltico em que o frmaco encontra-se
homogeneamente disperso ou solubilizado no interior da matriz polimrica (SCHAFFAZICK
et al, 2003). As nanocpsulas so sistemas nanovesiculares apresentando um ncleo oleoso
rodeado por uma matriz polimrica. A cavidade pode conter um composto ativo lquido ou
slido ou uma disperso molecular (FESSI et al, 1989). Este reservatrio pode ser lipoflico
ou hidroflico de acordo com a forma de obteno e material utilizado. Tambm podem conter
o composto ativo na sua superfcie ou difundido na matriz polimrica (KHOEE e
YAGHOOBIAN, 2009).
33
A
Figura 8: Representao esquemtica de (a) nanocpsulas e (b) nanoesferas; e B. Representao

1
2
esquemtica de nanopartculas lipdicas slidas (STROHER, ARMIJO e RAFFIN, 2010).
As nanopartculas lipdicas slidas foram desenvolvidas no incio da dcada de 1990

como um sistema de transporte alternativo ao sistema tradicional existente, como emulses,
lipossomas e nanopartculas polimricas (MULLER et al, 2000; MEHNERT e MADER,
2001; MULLER et al, 2002; ALHAJ et al, 2008).
Apresentam como principais vantagens sua estabilidade qumica, proteo do
composto ativo contra degradao, liberao controlada, excelente tolerncia, e produo em
larga escala favorvel (ALHAJ et al, 2008), alm de poder ser utilizados tanto com frmacos
hidrofbicos como hidroflicos (MULLER et al, 2000).
Muitos mtodos tm sido desenvolvidos para preparar as nanopartculas lipdicas
slidas, tais como alta presso de homogenizao (SIEKMANN, WESTESEN, 1994;
LANDER et al, 2000; LIPPACHER et al, 2002, LIPPACHER et al, 2004), solvente ou
emulsificao por evaporao (SIEKMANN, WESTESEN, 1994), ultra-som ou altas taxas de
cisalhamento e pelo mtodo de difuso do solvente (HU et al, 2005; 2006).
As nanopartculas lipdicas com partculas slidas na sua matriz (Figura 8B) so
derivadas a partir de emulses leo/gua mediante a simples substituio de lipdios lquidos
por lipdios slidos temperatura ambiente (MULLER et al, 2007).
Durante o processo de produo, os lipdios so fundidos e o frmaco dissolvido nesta
fase oleosa, que posteriormente, dispersa em uma soluo aquosa surfactante. A premulso obtida homogenizada a alta presso produzindo uma nanoemulso quente
leo/gua. Aps o resfriamento, gotas se cristalizam formando nanopartculas lipdicas com
partculas de matriz slida (MULLER et al, 2007).
Ao se preparar uma nanopartcula lipdica slida apenas com lipdios slidos, as
partculas da matriz tendem a formar um cristal perfeito deixando um espao limitado para
34
acomodar o frmaco, isto limita a capacidade de armazenamento, podendo levar expulso
do composto ativo da matriz lipdica durante o armazenamento (BUNJES, WESTESEN e
KOCH, 1996).
J a utilizao da mistura de lipdios slidos e lquidos faz com que ocorra a formao
de partculas de matriz com imperfeies, proporcionando mais espaos para acomodar o
composto ativo proporcionando um aumento na quantidade de composto no interior da matriz
durante o armazenamento. Poderia se afirmar que a perfeio do sistema sua imperfeio na
matriz cristalina (MULLER et al, 2007).
O uso da clorexidina em nanopartculas foi descrito primeiramente por Lboutounne e
colaboradores (2002) trabalho no qual foi realizada a encapsulao da clorexidina base em
nanocpsulas de poli--caprolactona e sua atividade bactericida residual avaliada, in vivo,
como agente antisptico comparando um detergente desinfetante de clorexidina ao que
apresentava nanocpsulas de clorexidina, obtendo como resultado uma ao bactericida
sustentada por mais de 8 horas do detergente que continha nanocpsulas de clorexidina.
Nhung e colaboradores (2007) compararam a ao do gel de nanocpsulas de
clorexidina (Nanochlorex) com 2-propanol 60 % (v/v) e gel base de etanol 62 % (v/v)
(Purrell) como agente antisptico sob a flora da pele de residentes e confirmou ao imediata
e sustentada do efeito bactericida do Nanochlorex constituindo-se como um meio promissor
de desinfeco e higienizao das mos em diversos procedimentos.
Meng e colaboradores (2009) tiveram como objetivo elaborar um composto formado
por acetato de clorexidina (CA) intercalado com cristais de montmorilonita (MMT). No
estudo de liberao, apresentou um efeito burst inicial nas primeiras 24 horas e continuou seu
processo de liberao at 72 horas. A atividade antibacteriana foi analisada pelo mtodo da
zona inibitria contra Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa e os resultados
indicaram forte atividade antibacteriana contra bactrias Gram positivas e Gram negativas.
Assim, concluram que o MMT poderia ser sugerido como um carreador de entrega
controlada de frmacos.
Huynh e colaboradores (2010) desenvolveram um sistema de liberao controlada de
diacetato de clorexidina (CDA) a base de poliuretano em dois formatos, em filmes ou em
sanduches de poliuretano, obtidos atravs da evaporao do solvente. A liberao de CDA foi
dependente da concentrao inicial de frmaco, da estrutura do sistema (filme ou sanduche) e
da natureza do meio de liberao (gua destilada ou soluo aquosa de NaCl a 0,9 %). A taxa
35
de liberao foi significantemente menor em soluo fisiolgica. Para CDA-filme, a liberao
se prolongou por at 11 dias e, em CDA-sanduche, por at 29 dias. O estudo antibacteriano
foi realizado com CDA-filme em Staphylococcus aureus e Staphylococccus epidermidis
permanecendo com atividade antibacteriana por 35 dias.
Musial e colaboradores (2010) observaram a liberao de clorexidina quando
associada metilcelulose e poli(cido acrlico) como carreadores polimricos, na forma de
gel. As taxas de liberao e concentrao de clorexidina foram comparadas com sua
respectiva viscosidade, pH e condutividade nas temperaturas de 22 C, 32 C (como
temperatura corporal de referncia) e 42 C . Em observao em MEV, com auxlio do EDS,
os tomos de cloro foram identificados e co-relacionados com a presena de clorexidina, desta
forma a distribuio da clorexidina na matriz polimrica se mostrou mais homogeneamente
dispersa na matriz de poli(cido acrlico). A taxa de liberao de clorexidina no sistema de
metilcelulose foi afetada pela temperatura, quanto maior o aumento da temperatura, maior a
taxa de liberao da clorexidina. Em poli(cido ctrico), a temperatura no influenciou
significantemente na liberao do frmaco. Ao final de 10 h, teve-se um aumento em torno de
35 % da taxa de liberao no sistema de metilcelulose enquanto que na poli(cido ctrico) o
aumento foi de apenas 0,5 %.
Na Odontologia, alguns estudos utilizando nanopartculas vm sendo realizados.
Bouillaguet e colaboradores (2006) testaram a citotoxicidade de trs diferentes cimentos
endodnticos: AH Plus, Epiphany e GuttaFlow (que apresenta nanopartculas de prata na sua
composio), em culturas celulares atravs do ensaio MTT, e os resultados mostraram que a
maioria dos materiais apresentavam riscos significativos. Aps o perodo de 72 h, o
GuttaFlow se apresentou significativamente menos txico que o AH Plus e Epiphany, porm
sua toxicidade aumentavam com o tempo e isso poderia estar atribudo liberao de
partculas de prata.
Com o objetivo de investigar a atividade antimicrobiana e a eficcia de impedimento
de formao do biofilme no processo de desinfeco de canais radiculares pelo uso de
nanopartculas associadas ao cimento de xido de zinco e eugenol, Kishen e colaboradores
(2008) numa primeira etapa, avaliaram as propriedades fsicas e antimicrobianas de trs
diferentes tipos de nanopartculas: nanopartculas de xido de zinco, nanopartculas de
quitosana e nanopartculas de xido de zinco com revestimento de mltiplas camadas de
quitosana. A ao antimicrobiana das nanopartculas de quitosana apresentou maior atividade,
porm, diminuda quando adicionado ao cimento de xido de zinco e eugenol. As
36
nanopartculas de xido de zinco, ao contrrio, apresentavam menor ao antimicrobiana, mas
em associao ao cimento de xido de zinco e eugenol, apresentaram maior atividade
antimicrobiana. A adio de nanopartculas de xido de zinco e de quitosana aumentou a
atividade antimicrobiana do cimento de xido de zinco e eugenol. Em uma segunda etapa, o
efeito das nanopartculas na aderncia de E. faecalis na parede da dentina foi avaliada e os
resultados mostraram que o tratamento com as nanopartculas reduziram, significantemente, a
adeso do E. faecalis na dentina e que a adio de nanopartculas de xido de zinco e
nanopartculas de quitosana inibiriam a recolonizao microbiana e formao de biofilme,
melhorando a capacidade antimicrobiana dos cimentos endodnticos.
Gomes Filho e colaboradores (2010) realizaram o primeiro estudo para avaliar o uso
de nanopartculas de prata como agente irrigante. O trabalho teve como objetivo analisar a
resposta tecidual, em ratos, frente a implantes de tubos de polietileno preenchidos com
esponja de fibrina embebidas em 1 mL de disperso de 47 ppm de nanopartculas de prata, 23
ppm de nanopartculas de prata, e hipoclorito de sdio a 2,5 %. A anlise foi feita em 7, 15,
30, 60 e 90 dias, sendo que, para cada perodo, 6 ratos foram sacrificados e os implantes e
tecidos adjacentes removidos, fixados e preparados para anlise em microscopia ptica. Os
resultados obtidos mostraram que ambos os materiais provocaram reaes moderadas em 7
dias. Aps os 15 dias, a resposta inflamatria das nanopartculas de prata a 23 ppm e o
hipoclorito de sdio a 2,5 % foram semelhantes ao grupo controle e, aos 30 dias, as
nanopartculas de prata a 47 ppm foram semelhantes ao controle. A partir disto, concluram
que a disperso de nanopartculas de prata foi biocompatvel, especialmente em concentraes
mais baixa.
Pagonis e colaboradores (2010) avaliaram, in vitro, a ao de nanopartculas de poli
(L-cido lctico-co-cido gliclico), PLGA, contendo azul de metileno sob ao de luz
vermelha de comprimento de onda correspondente a 665 nm frente a E. faecalis. Utilizaram
blocos de dentes humanos extrados contaminados com E. faecalis divididos em trs grupos: o
grupo I no recebeu tratamento com nanopartculas de azul de metileno nem aplicao de luz;
o grupo II foi tratada apenas com nanopartculas de azul de metileno e, o grupo III que
recebeu tratamento com nanopartculas de azul de metileno seguida de aplicao de luz. O
sinergismo da luz com as nanopartculas de azul de metileno promoveu uma reduo
significativa das unidades formadoras de colnia, sendo a utilizao de nanopartculas de
PLGA como meio de carreador de frmacos fotoativados um coadjuvante promissor no
tratamento antimicrobiano de canais radiculares.
37
3. METODOLOGIA
3.1. DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTCULAS CONTENDO CLOREXIDINA
Todo o processo de desenvolvimento, caracterizao e teste de estabilidade foram

realizados no laboratrio de Nanotecnologia do Centro Universitrio Franciscano (UNIFRA).
3.1.1. Teste de solubilidade
Um teste piloto foi realizado visando avaliar a solubilidade da clorexidina na fase

orgnica da suspenso coloidal (sem a presena do polmero), bem como nos componentes da
referida fase oleosa, seguindo a metodologia descrita na Farmacopia Brasileira (4a edio).
Para isso, foram testados diferentes tensoativos, entre eles o monoestearato de sorbitano,
monoleato de sorbitano e lecitina; diferentes leos, triglicerdio de cidos cprico/caprlico,
cocoato de butilenoglicol, leo de oliva e leo de melaleuca; e, tambm, diferentes polmeros,
a poli--caprolactona e o Eudragit L100. A solubilidade da clorexidina em diferentes lipdios
tambm foi avaliada, dentre eles a manteiga de karit em diferentes concentraes (5, 7 e 10
%), lcool cetlico, cido esterico e monoestearato de glicerila.
3.1.2. Preparo das suspenses contendo nanocpsulas de clorexidina
Para o preparo das suspenses de nanocpsulas de clorexidina, tentou-se reproduzir o

mtodo de obteno descrito por Lboutounne e colaboradores (2002).
A partir da adaptao da metodologia de Lboutounne e colaboradores (2002), alguns
componentes da fase orgnica foram substitudos, como mostra a Tabela 1, enquanto que os
componentes da fase aquosa mantiveram-se os mesmos, gua (53 mL) e polissorbato 80
(0,0766 mg). As suspenses contendo nanocpsulas de clorexidina foram obtidas pelo mtodo
de deposio interfacial de polmeros pr-formados, descrito por Fessi e colaboradores
(1989).
38
Tabela 1: Componentes utilizados na fase orgnica para o preparo das suspenses contendo nanocpsulas
de clorexidina.
Componentes
Tensoativo
Quantidade
monoestearato de sorbitano
0,0766 g
monoleato de sorbitano
lecitina
Polmero
poli--caprolactona
0,1 g
Eudragit L100
27 mL
Acetona
triglicerdio de cido cprico/ caprlico
leo
0,31 g
cocoato de butilenoglicol
leo de oliva
leo de melaleuca
Clorexidina
0,2 %
0,02 g
1%
0,1 g
2%
0,2 g
Os componentes da fase orgnica e aquosa foram mensurados e colocados em

diferentes bqueres. Ambos foram vedados com parafilme para evitar a evaporao da
acetona e da gua e mantidos sob constante agitao magntica e em banho-maria a 40 C
pelo tempo de 30 minutos para a completa dissoluo de seus componentes.
A seguir, a fase orgnica foi vertida lentamente com auxlio de um funil na fase
aquosa. A mistura formada permaneceu sob as mesmas condies de temperatura e agitao
por mais 10 minutos e levada para o rota-evaporador, a 100 rpm, para eliminao do excesso
de gua e do solvente orgnico at obteno do volume final desejado de 10 mL de suspenso.
As concentraes de clorexidina avaliadas foram de 0,2, 1 e 2 % (m/v).
3.1.3. Preparo das suspenses contendo nanopartculas lipdicas slidas de clorexidina.
As suspenses contendo nanopartculas lipdicas slidas de clorexidina (NCL) foram

obtidas por um mtodo indito utilizando apenas alta taxa de cisalhamento.
A composio da fase aquosa manteve-se a mesma, gua (90 mL) e polissorbato 80 (3
g). Na fase oleosa alguns componentes foram testados com o objetivo de obter NCL com melhores
39
caractersticas fsico-qumicas. Os componentes utilizados na fase oleosa esto descritos na
Tabela 2.
Tabela 2: Componentes da fase oleosa utilizados no preparo de suspenses contendo NCL.
Componentes
Tensoativo
leo
Quantidade
monoleato de sorbitano
2g
manteiga de karit
5g
lcool cetlico
cido esterico
monoestearato de glicerila
Clorexidina
0,2 %
0,2 g
0,5 %
0,5 g
1%
1g
2%
2g
Os componentes da fase oleosa foram pesados e colocados em banho-maria a 40 C

at completa fuso da manteiga de karit. A fase aquosa foi pesada e colocada sob constante
agitao magntica, temperatura de 55 C, at que todos os componentes estivessem
solubilizados.
A fase aquosa foi vertida sobre a fase oleosa. A mistura foi levada ao Ultra-Turrax
pelo tempo de 20 minutos e com agitao de 24.000 rpm (Figura 09).
40
Figura 9: Mtodo de obteno de nanopartculas lipdicas slidas contendo clorexidina por altas
taxas de cisalhamento. A) Fase oleosa; B) Fase aquosa; C) Ultra-Turrax
O volume final da suspenso foi de 100 mL e diferentes concentraes de clorexidina

foram utilizadas (0,2; 0,5; 1,0 e 2,0 % m/v). Para efeito comparativo, foram preparadas
suspenses brancas (NBR), sem a adio de clorexidina, sendo estas preparadas atravs do
mesmo mtodo.
3.1.4. Preparo dos gis contendo NCL.
Os gis foram preparados a partir da adio de hidroxietilcelulose a 1,5 % (m/v) s

suspenses. A mistura foi levada mantida por 24 h a 5 C para completa hidratao da
hidroxietilcelulose e formao do gel.
Para obteno do gel contendo clorexidina livre (CL), fez-se primeiramente o gel,
adicionando a hidroxietilcelulose gua e, aps 24 h, o frmaco disperso em polissorbato 80
foi acrescentado ao gel.
41
3.2. CARACTERIZAO DAS NANOPARTCULAS
As suspenses e gis contendo NCL foram caracterizadas com relao determinao

do pH, dimetro mdio das partculas, ndice de polidisperso, potencial zeta, teor de frmaco
e taxa de associao.
3.2.1. Determinao do potencial zeta
O potencial zeta das suspenses e gis de NCL foi avaliado atravs de eletroforese em
Zetasizer nano-ZS modelo ZEN 3600, Malvern Instruments, aps diluio (500 vezes, v/v)
em soluo de NaCl 10 mM previamente filtrada atravs de membrana 0,45 m Chromafil
Xtra RC-45/25 (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Alemanha). Os resultados
foram obtidos atravs dos valores da mdia de trs amostras diferentes.
3.2.2. Determinao do ndice de polidisperso e dimetro das partculas
A determinao do dimetro mdio e do ndice de polidisperso das nanopartculas nas

suspenses e gis foi realizada atravs de espalhamento de luz dinmico (Zetasizer nano-ZS
modelo ZEN 3600, Malvern Instruments), aps sua diluio (500 vezes, v/v) em gua. Os
resultados foram determinados atravs dos valores da mdia de trs amostras diferentes.
3.2.3. Determinao do pH
O pH das suspenses e gis das NCL foi verificado em um potencimetro (Digimed)

previamente calibrado com soluo tampo pH 4,0 e 7,0 e as medidas realizadas diretamente
nas suspenses e gis. Os resultados foram expressos atravs da mdia de trs amostras
diferentes.
42
3.2.4. Validao da metodologia para doseamento da clorexidina
As anlises foram realizadas atravs de cromatografia lquida de alta eficincia

(CLAE), avaliando-se parmetros como linearidade, preciso, repetibilidade e exatido
(ANEXO 1). A determinao destes parmetros para doseamento da clorexidina foram
realizados de acordo com a Resoluo n 899 de 29 de maio de 2003 do Ministrio da Sade
(BRASIL, 2003).
3.2.4.1. Mtodos Cromatogrficos
As anlises foram realizadas por CLAE, atravs da modificao da fase mvel descrita
por Chiapetta e colaboradores (2008) para quantificao da clorexidina.
Utilizou-se um cromatgrafo lquido YL-Clarity, modelo L9100 CLAE System,
equipado com bomba modelo YL9110, detector de arranjo de diodo modelo YL9160, Coluna
cromatogrfica - Lichropher 100 RP 18 (250 mm, 4,0 mm, 5 m) Merck.
A fase mvel utilizada foi constituda de acetonitrila, tampo fosfato monobsico de
sdio 0,03 M e trietilamina em uma proporo de 80:20:0,1 (v/v), com pH aparente de 2,0
ajustado usando cido fosfrico.
As condies para injeo da amostra foram de volume de injeo de 20 L e fluxo de
1,0 mL/min, temperatura de forno de 40C, comprimento de onda de 260 nm, apresentando
um tempo de reteno de 3,3 minutos.
3.2.4.2. Preparo das amostras para o doseamento da clorexidina
Para a extrao da clorexidina das suspenses e gis, as amostras foram colocadas em

bales volumtricos de 10 mL e seu volume completado com fase mvel resultando numa
concentrao de 10 g/mL. Os bales contendo os gis foram agitados no vrtex por 5
minutos, mantidos em ultrassom por 15 minutos e, aps isso, o contedo dos bales foram
transferidos pra tubos de ensaios, os quais foram levados para ultracentrifugar por 15 minutos
a 3.500 rpm. As amostras de todos os bales foram filtradas com uma membrana de 0,45 m
43
Chromafil Xtra RC-45/25 (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Alemanha) e
analisadas em CLAE conforme descrito acima.

NCL
As suspenses e gis de NCL 0,2 e 0,5 %, juntamente com o NBR e CL foram

submetidos ao estudo de estabilidade. Foram armazenadas em temperatura ambiente (25 2
C), geladeira (4 2 C) e estufa (40 2 C) por 90 dias. Os parmetros analisados foram:
caractersticas organolpticas (aparncia, cor e odor), pH, teor e viscosidade. Foram
determinados ainda o dimetro mdio das nanopartculas, ndice de polidisperso e potencial
zeta. As leituras foram realizadas nos tempos 0 e 90 dias.
3.4. ENSAIO MICROBIOLGICO
Os ensaios microbiolgicos foram realizados no laboratrio de microbiologia da

UNIFRA. Para tal, foram utilizadas cepas dos microrganismos Candida albicans (ATCC
90028) e Enterococcus faecalis (ATCC 29212) obtidas da Americam Type Culture Collection
(ATCC).
3.4.1. Preparo da suspenso microbiana
As cepas de C.albicans foram semeadas em meio contendo gar Sabouraud Dextrose

incubadas em estufa microbiolgica a 37 C por 24 h. O E. faecalis foi semeado em meio gar
Brain Heart Infusion (BHI) a 37 C por 24 h (VALERA et al, 2009). Aps a incubao, as
suspenses com os microrganismos em soluo fisiolgica estril foram preparadas com uma
turvao de 0,5 na escala Mac Farland, equivalente a 1,5x108 UFC/mL.
44
3.4.2. Concentrao inibitria mnima
A Concentrao Inibitria Mnima (CIM) a menor concentrao de um agente

antimicrobiano capaz de impedir, in vitro, o crescimento visvel de determinado
microrganismo a partir de testes de sensibilidade por diluio em gar ou caldo (ANDREWS,
2001). A CIM deve ser nica para uma mesma substncia, considerando-se o mesmo
microrganismo, porm pode variar dependendo do microrganismo analisado.
A CIM foi determinada por meio da tcnica de microdiluio em caldo MuellerHinton (Difco) para E. faecalis e C. albicans e o ensaio foi realizado em placas de 96 poos
de microdiluio nos grupos descritos na Tabela 3.
Tabela 3: Diviso dos grupos de acordo com a medicao testada para determinao da CIM.
Grupos
Medicao
Suspenso de clorexidina 0,5%
Suspenso CL 0,5 %
Suspenso NCL 0,5 %
Suspenso de nanopartculas lipdicas de clorexidina 0,5%

Gel de clorexidina a 0,5%
Gel CL 0,5 %
Gel NCL 0,5 %
Gel de nanopartculas lipdicas de clorexidina a 0,5%

Gel de nanopartculas sem frmaco (branco)
Gel NBR
Gel CL 0,5 % HCA
Gel NCL 0,5 % HCA
Gel de clorexidina a 0,5% + pasta de hidrxido de clcio

Gel de nanopartculas lipdicas de clorexidina a 0,5% + pasta de
hidrxido de clcio
Pasta de hidrxido de clcio
HCA
O inculo foi preparado no mesmo meio a uma densidade ajustada para 0,5 da escala
McFarland (1,5 x 108 UFC/mL) e diluda numa proporo de 1:10. No poo nmero 1, havia
100 % da suspenso, pasta ou associao. Para o poo de nmero 2, foi adicionado 50 % da
quantidade presente do poo 1 reduzindo a concentrao do frmaco em 50 %, e assim
sucessivamente at antigir a concentrao de frmaco que permitiu o crescimento microbiano,
a concentrao de frmaco presente no poo anterior a este foi considerada a CIM, como pode
ser visto no fluxograma da Figura 10.
45
100 L da formulao
100 L de meio+
10 L de inculo
100 L
100 L
100 L
100 L de meio+
10 L de inculo
100 L de meio+
10 L de inculo
100 L de meio+
10 L de inculo
Poo n1
Poo n2
Poo n3
Poo nN
Concentrao = X
concentrao = X/2
concentrao = X/4
concentrao = X/?
Figura 10: Fluxograma ilustrativo da microdiluio para determinao da CIM.
Para cada formulao, a primeira concentrao partiu de 50 % da concentrao total

do frmaco presente na suspenso, gel ou associao. Para as suspenses e gis CL e NCL 0,5
%, o CIM foi avaliado a partir da concentrao de 2,5 mg/mL. Para a mistura NCL 0,5 %
HCA a concentrao partiu de 1,25 mg/mL.
As bandejas (Figura 11) foram incubadas a 37 C e as CIMs foram registradas aps 24
h de incubao para a forma livre de clorexidina e 72 h para as formulaes compostas por
nanopartculas. O teste foi feito em triplicata e o 2,3,5cloreto de trifeniltetrazlio foi usado
como indicador de crescimento bacteriano.
Figura 11: Placas de 96 poos para microdiluio e definio das CIMs.
46
3.4.3 Teste de difuso em gar com cilindro de ao inoxidvel
Para o teste de difuso em gar utilizando os cilindros de ao inoxidveis, foram

utilizadas 9 placas Petri. Para cada placa, foram aplicados 15 mL de gar Mueller-Hinton
(MHA) para formar uma camada base (Figura 12) e, depois de solidificado, acrescentados 5
mL de meio MHA para formar a camada de superfcie, contendo o inculo do microrganismo
numa proporo de 50 mL de meio MHA para 1 mL de suspenso de inculo, na temperatura
ideal de 45 C.
100 L da formulao
5 mL de meio MHA + inculo
15 mL de meio MHA
Figura 12: Desenho ilustrativo dos procedimentos realizados para o teste de difuso em gar com cilindros
de ao inoxidvel.
Foram colocados 6 cilindros (8,0 x 1,0 x 10 mm; dimetro interno = 6 mm) de ao

inoxidvel estreis por placa aps a solidificao do meio e adicionados 100 L de cada
formulao em cada cilindro, em triplicata (FARMACOPIA BRASILEIRA, 1988).
As placas foram incubadas a 37 C e os dimetros dos halos de inibio foram
medidos com auxlio de paqumetro digital, em milmetros, nos tempos de 24, 48 e 72 h e sua
potncia calculada.
Cada cepa microbiana foi avaliada contra as seguintes formulaes: P1= CL 0,2 %; P2
= CL 0,5 %; P3 = propilenoglicol; A1 = NCL 0,2 %; A2 = NCL 0,5 %; A3 = NBR,
distribudas na placa de Petri conforma Figura 13.
As amostras padro (P1 e P2) foram feitas a partir da diluio de clorexidina 99,9 %
(Sigma-Aldrich) em soluo de dimetil sulfxido (DMSO) (Nuclear) de forma a atingir a
concentrao desejada de clorexidina equivalente a concentrao presente nas NCLs.
47
P1
A3
P2
A2
P3
A1
Figura 13: Esquema de distribuio das amostras na placa petri.
3.5. AVALIAO IN VITRO DA DEGRADAO DA CLOREXIDINA QUANDO

ASSOCIADA PASTA DE HIDRXIDO DE CLCIO
A degradao da clorexidina livre e em nanopartculas associada ou no pasta de

hidrxido de clcio foi avaliada no laboratrio de Nanotecnologia da UNIFRA atravs da
quantificao de clorexidina por CLAE e anlise do pH.
3.5.1. Diviso dos grupos
Para avaliar a degradao da clorexidina, os grupos para anlise foram divididos de

acordo com a Tabela 4.
Tabela 4: Diviso dos grupos de acordo com a formulao.
Grupos
Gel CL 0,5 %
Gel NCL 0,5 %
Gel NBR
Gel CL 0,5 % HCA
Gel NCL 0,5 % HCA
Medicao
Gel de nanopartculas lipdicas de clorexidina a 0,5% + pasta de hidrxido
de clcio
HCA
48
3.5.2. Preparo das amostras
A associao dos gis pasta de hidrxido de clcio (Calen) foi feita na proporo 1:1
(m/m), sobre placa de vidro com auxlio de um esptula plstica e armazenado recipiente e
ambiente apropriado, visando evitar sua degradao precoce (Figura 14).
Figura 14: Etapas realizadas para o preparo das amostras. A) e B) A associao dos gis pasta de
hidrxido de clcio foi feita na proporo 1:1, em peso; C) Mistura dos gis; D) Gis armazenados em
recipiente e ambiente apropriado.
49
3.5.3. Determinao do pH
O pH foi verificado, em funo do tempo, em um pHmetro (Digimed) previamente

calibrado com soluo tampo pH 4,0 e 7,0 e as medidas realizadas a partir da diluio de
0,01 g da amostra em 10 mL de gua.
3.5.4. Doseamento da clorexidina
Para o doseamento da clorexidina incorporada ao gel e pasta de hidrxido de clcio,

as amostras foram pesadas de acordo com a concentrao, de forma a se obter uma
concentrao final para anlise de 20 g/mL.
Os gis e pastas foram pesados em um balo volumtrico de 10 mL e o volume
completado com a fase mvel (Figura 15). Os bales foram agitados no vortex por 5 minutos,
mantidos em banho de ultrassom por 15 minutos e, aps isso, o contedo dos bales foi
transferido para tubos de ensaios, os quais foram levados para centrifugar por 15 minutos a
3.500 rpm. O sobrenadante das amostras foi filtrado em membrana (0,45 m poro) e
analisadas em CLAE.
Figura 15: Preparo das amostras para anlise em CLAE. A) Gis e pastas foram pesados em um balo
volumtrico de 10 mL; B) Os bales foram agitados no vortex por 5 minutos; C) Gis levados para sonicar
por 15 minutos; D) O contedo dos bales foi transferido para tubos de ensaios e depois para centrfuga
por 15 min.
50
3.6. PROFUNDIDADE DE PENETRAO NOS TBULOS DENTINRIOS
3.6.1. Obteno dos dentes humanos
Para a avaliao da profundidade de penetrao das nanopartculas nos tbulos

dentinrios foram utilizados nove dentes humanos extrados cedidos pelo Banco de Dentes da
Faculdade de Odontologia da UNIFRA. Sua utilizao foi aprovada pelo Comit de tica em
Pesquisa em Seres Humanos da mesma instituio sob parecer de n0 335.2010.2.
Os elementos apresentavam pice radicular completo, raiz nica e reta e foram
armazenados em soluo fisiolgica a 0,9 %, a fim de permanecerem constantemente
hidratados.
3.6.2. Preparo das amostras
Os elementos foram seccionados transversalmente no limite amelocementrio com

auxlio de um disco diamantado duplo (K. G. Sorensen, So Paulo, SP - Brasil) e sua
superfcie externa impermeabilizada com uma camada de adesivo epxi Araldite
(BRASCOLA So Bernardo do Campo, SP).
O canal foi localizado com auxlio da lima tipo K-file n 10 (DENTSPLY Ind. Com.
Ltda. Petrpolis, RJ), a qual percorreu todo interior do canal at a sua visualizao no
forame apical para determinar o comprimento real da raiz. O comprimento real de trabalho foi
estabelecido 1 mm aqum do comprimento real da raiz.
O preparo biomecnico foi feito com limas K-file 1 srie (#15 - #40) (DENTSPLY
Ind. Com. Ltda. Petrpolis, RJ) e o soro fisiolgico 0,9 % foi utilizado como irrigante a
cada troca de instrumento.
Ao final do preparo, o canal foi irrigado com 10 mL de soluo de EDTA a 17 % para
remoo da smear layer. Os canais foram secos com cone de papel absorvente (TANARI Ind.
Ltda. Manacapuru, AM) de dimetro compatvel com o canal principal. Nos grupos nos
51
quais foi utilizada medicao, estas foram introduzidas no interior do canal com auxlio de
agulha e seringa at o completo extravasamento da medicao pela regio apical.
O excesso de material foi removido das duas extremidades e o acesso coronrio e
apical foram selados com cimento provisrio (COLTOSOL Vigodent Indstria e Comrcio
Bonsucesso / RJ - Brasil).
No grupo controle, o canal permaneceu vazio e suas extremidades seladas com
cimento provisrio. As amostras foram distribudas em trs grupos com trs elementos em
cada grupo, como mostra na Tabela 5.
Tabela 5: Distribuio dos grupos.
Grupos
Medicamento
Amostras (n)
Controle
Sem medicao
Suspenso de nanopartculas de clorexidina a 0,5%
Gel de nanopartculas de clorexidina a 0,5%
Suspenso NCL 0,5 %

Gel NCL 0,5 %
O medicamento permaneceu no interior do canal por um perodo de 15 dias; aps isso,

fez-se a remoo do cimento provisrio e a raiz foi irrigada com soro fisiolgico a 0,9 % para
a remoo dos restos dos medicamentos.
Foram confeccionados sulcos longitudinais de orientao na face mesial e na face
distal das razes com disco diamantado duplo (K. G. SORENSEN, So Paulo, SP - Brasil) em
baixa rotao para posterior clivagem dos elementos. As amostras foram levadas para o
interior de um dessecador para o processo de desidratao da estrutura dentria, onde
permaneceu em vcuo por um perodo de 10 dias.
As amostras prontas foram fixadas em stub, metalizadas com ouro e analisadas em
microscopia eletrnica de varredura (MEV) com voltagem de 10 kV no centro de microscopia
da UFRGS (Jeol Scanning Microscope JSM-5800, Japan) para anlise da penetrao das
nanopartculas de clorexidina no interior dos tbulos dentinrios.
Na Figura 16, podemos observar toda a sequncia da metodologia de forma resumida.
52
A
Figura 16: Etapas realizadas para o processo de anlise das nanopartculas lipdicas no interior do
elemento dentrio. A) Padronizao das amostras; B) confeco de sulcos para o processo de clivagem; C)
Clivagem da estrutura dentria; D) Dessecador utilizado para o processo de desidratao das amostras;
E) Amostras fixadas em stub e metalizadas com ouro; F) MEV/EDS utilizado para registro das
micrografias e espectros.
Foi utilizado como mtodo auxiliar ao MEV, a espectrometria de energia dispersiva de

raios-X (EDS), tcnica na qual a amostra bombardeada por eltrons e a energia dos tomos
presentes detectada e a concentrao do tomo expresso em um espectro. O tomo de
interesse foi o cloro por estar presente na composio qumica da clorexidina, assim como
Musial e colaboradores (2010) que utilizaram o EDS para localizar tomos de cloro e, assim,
identificar a presena de clorexidina em nanocpsulas de metilcelulose e poli(cido acrlico).
3.7. ESTUDO IN VIVO
Para realizao do estudo in vivo, foram utilizados ratos machos Wistar,

imunocompetentes, pesando 300 350 g (N = 8 por grupo; N total = 56) provenientes do
Biotrio da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL; Pelotas, RS). Os animais foram
mantidos no Vivrio da PUCRS, em estantes ventiladas, equipadas com filtros de entrada e
53
sada de ar, com temperatura controlada (22 1 oC) e ciclo claro-escuro de 12 h. Os animais
receberam rao peletizada e gua filtrada ad libitum.
Os procedimentos experimentais seguiram as recomendaes para o cuidado com
animais de laboratrio e normas ticas para a experimentao em animais conscientes, do
Guia de Uso e Cuidado com Animais Laboratoriais do National Institutes of Health (NIH) dos
Estados Unidos da Amrica, que so adotadas pelo Conselho Brasileiro de Experimentao
Animal (COBEA). Foram respeitados os preceitos apresentados na Lei No 11.794, de 9 de
outubro de 2008 e os protocolos experimentais foram submetidos apreciao do Comit de
tica para o Uso de Animais (CEUA) da PUCRS sob numero 10/0021.
Para a realizao dos procedimentos odontolgicos, os animais foram anestesiados
pela administrao intraperitoneal da associao de xilazina (10 mg/kg) e quetamina (100
mg/kg). Foi realizada a administrao do frmaco analgsico Paracetamol 80 mg/kg, 2 vezes
ao dia, via oral durante todo o experimento. No perodo de tempo adequado, a eutansia foi
realizada por anestesia profunda com isofluorano. Depois da eutansia, as amostras
pertinentes ao estudo foram coletadas e o lixo biolgico foi destinado ao setor de descarte da
PUCRS.
3.7.1. Distribuio dos grupos e clculo do tamanho da amostra
Os grupos foram distribudos de acordo com a medicao utilizada, como descrito na

Tabela 6.
Tabela 6: Distribuio dos animais nos diferentes grupos experimentais.
Grupos
Medicao
Amostras (n)
Propilenoglicol
Gel CL 0,5 % HCA
Gel NCL 0,5 %
Gel de nanopartculas lipdicas de clorexidina a 0,5% +
Controle
Gel CL 0,5 %
Gel NCL 0,5 %
Gel NBR
HCA
pasta de hidrxido de clcio
HCA
54
3.7.2. Induo das leses periapicais
Com o objetivo de induzir leses periapicais, os animais foram anestesiados atravs da

mistura de xilazina e quetamina, como descrito acima. Aps a confirmao da anestesia,
foram realizadas aberturas coronrias nos primeiros molares inferiores, com brocas
diamantadas esfricas de alta rotao (1/2 mm de dimetro), sob irrigao constante. Aps a
remoo da polpa coronria, a cavidade pulpar ficou exposta ao meio bucal por um perodo de
21 dias, para a induo de leso periapical (IWAMA et al, 2003).
3.7.3. Instrumentao e preenchimento do canal
Decorridos 21 dias da induo das leses periapicais, os animais foram novamente

anestesiados. O preparo do canal radicular foi realizado pela tcnica escalonada, utilizando-se
limas K-file de nmero 08, 10, 15, 20 e 25, sucessivamente, em um comprimento de trabalho
de 4 mm, determinado de acordo com o tamanho mdio das razes de molares inferiores de
rato. Hipoclorito de sdio a 1 %, em um volume de 200 L, foi utilizado como soluo
irrigante. A secagem do canal foi feita com cones de papel (TANARI Ind. Ltda
Manacapuru, AM) de calibre 25, esterilizados e o preenchimento com a medicao intracanal
foi realizado com auxlio de seringa e agulha de insulina, conforme a descrio anterior, at o
comprimento de trabalho. Aps a colocao da medicao intracanal, as cavidades foram
seladas com amlgama de prata e, os ratos permaneceram pelo perodo de 30 dias com a
medicao intracanal (adaptado de WAGNER et al, 2011) para posterior eutansia e
realizao das anlises descritas a seguir.
3.7.4. Exame radiogrfico
Aps a eutansia, as mandbulas foram removidas cirurgicamente, dissecadas, fixadas

em soluo tamponada de formalina 10 % e levadas para a avaliao radiogrfica das
alteraes periapicais. Utilizou-se um aparelho de Raio X (DABI-ATLANTE, Ribeirao Preto,
55
SP, Brazil) com sensor digital (KODAK Dental System, modelo RVG 6100 Digital
Radiography System) e armazenadas com resoluo de 1 Megabit, e salvo em formato JPEG.
As radiografias foram realizadas de forma padronizada seguindo os seguintes
parmetros: a regio do primeiro molar inferior deveria formar angulo perpendicular ao raioX, a potencia utilizada foi de 70 kvp, com distncia foco/filme de 30cm e tempo de exposio
constante de 0,2 s.
A rea da leso radiolcida periapical foi medida com o auxilio do programa Adobe
Photoshop CS4, verso 11.0 (WOLLE et al, 2012).
3.7.5. Anlise histolgica
A anlise histolgica foi realizada no Laboratrio de Patologia da UFPEL.

As mandbulas permaneceram armazenadas em soluo tamponada de formalina 10 %
at seu processo de descalcificao em soluo de EDTA a 5 % (pH 7,4), durante 30 dias,
sendo a soluo renovada a cada dois dias, para corte das peas.
Para anlise histopatolgica, blocos de parafina contendo as mandbulas foram
seccionados seriadamente, com espessura mdia de 6 m no plano vestbulo-lingual. Todas as
seces foram coradas com hematoxilina e eosina, observadas em microscpio ptico com
aumento de 100 e 400 vezes.
A intensidade do infiltrado inflamatrio foi classificada, conforme descrito por
Armada-Dias e colaboradores (2006), com os seguintes escores: ausente (0), discreto (1),
moderado (2) ou severo (3).
A Figura 17 representa um fluxograma das atividades para realizao etapa in vivo.
56
Figura 17: Fluxograma das etapas para o estudo in vivo.
3.7.6. Anlise Estatstica
A anlise estatstica dos resultados foi realizada por meio de anlise de varincia
(ANOVA) de uma via, seguida pelo teste de Fisher (=0,05) + DP.
57
4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1. PREPARO DAS NANOPARTCULAS CONTENDO CLOREXIDINA
4.1.1. Teste de solubilidade
A partir do teste de solubilidade, foi possvel observar que a clorexidina no era

solvel em triglicerdio de cidos cprico/caprlico. De todos os diferentes leos testados,
como descrito no item 3.3.1., o cocoato de butilenoglicol foi o leo que melhor solubilizou a
clorexidina, sendo ento, o leo de escolha para o preparo das nanocpsulas de clorexidina.
Para avaliar a solubilidade da clorexidina em diferentes lipdios (descritos no item
3.3.1) que poderiam compor a fase oleosa para obteno das nanopartculas lipdicas slidas,
observou-se que a manteiga de karit melhor solubilizou a clorexidina e, dentre as
concentraes avaliadas, a de 5 % apresentou melhor desempenho, j que nas concentraes
de 7 % e 10 % era visvel um excesso de leo no sobrenadante.
4.1.2. Preparo das nanocpsulas polimricas de clorexidina
Neste estudo, tentou-se reproduzir o mtodo de obteno de nanocpsulas contendo

clorexidina descrita por Lboutounne e coloraboradores (2002), sendo testadas as
concentraes de clorexidina 1 % e 0,25 %. Alguns componentes da formulao original de
Lboutounne e colaboradores (2002) foram substitudos devido indisponibilidade dos
mesmos e as concentraes de clorexidina base variaram de 0,2 at 2 %.
Sem obter sucesso, as propores foram alteradas, como mostra a Tabela 7.
58
Tabela 7: Composio das nanocpsulas polimricas alterada por este estudo.
Fase orgnica
Quantidade
Fase aquosa
Quantidade
PCL
100 mg
gua
53 mL
Monoestarato de sorbitano
76,6 mg
Polissorbato 80
76,6 mg
Acetona
27 mL
Cocoato de butilenoglicol
310 mg
Clorexidina
2%
200 mg
1%
100 mg
0,5 %
50 mg
0,2 %
20 mg
Volume final = 10 mL
Assim que as formulaes eram rotaevaporadas, observava-se a precipitao do

frmaco nas paredes do balo em todas as concentraes, alm de tamanho de partculas
elevado (700 nm) e no contnuo, chegando escala de micrmetros, valores bem diferentes
dos encontrados por Lboutounne e colaboradores (2002) que foram em torno de 230 nm.
O tensoativo foi substitudo por monoleato de sorbitano e lecitina. Mesmo assim, o
frmaco continuou se depositando e o tamanho das partculas no foi compatvel com o
desejado.
Como este estudo no conseguiu reproduzir o mtodo de obteno de nanocpsulas
contendo clorexidina, alternativas de nanocarreadores como nanoesferas e nanopartculas
lipdicas slidas foram testados.
Para obteno de nanoesferas contendo clorexidina, o leo foi eliminado e, desta
forma, conseguiu-se um tamanho mdio de partculas em torno de 300 nm, mas ainda
permanecia depositada no fundo do balo uma pelcula, parecendo ser o polmero,
impossibilitando sua utilizao no estudo.
4.1.3. Preparo das NCL
Para definir a concentrao ideal de frmaco, as NCL foram obtidas com 0,2; 0,5, 1 e
2 % de clorexidina. Nas concentraes de 1 e 2 %, houve grande deposio do frmaco e o
tamanho das partculas no era uniforme. Optou-se pela concentrao de 0,5 % para a
realizao dos testes microbiolgicos, in vitro nos dentes humanos, e in vivo em ratos.
59
4.2. CARACTERIZAO DAS NCL
As caractersticas fsico-qumicas das suspenses e gis das NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR
foram avaliadas atravs da determinao da distribuio do dimetro mdio das partculas,
ndice de polidisperso, potencial zeta, pH e teor do ativo.
As suspenses e gis contendo NBRs serviram como controle do experimento. A
caracterizao fsico-qumica das mesmas de suma importncia, pois atravs delas pode-se
avaliar se houve alteraes no comportamento destes sistemas com a incorporao do
frmaco. Da mesma maneira, procedeu-se ao estudo da formulao de CL livre (no
encapsulada).
Na Tabela 8, encontra-se descrita a caracterizao fsico-qumica das suspenses de
NCLs nas concentraes de 0,2 e 0,5 %; NBR; e na forma livre. Podemos observar que as
NCLs 0,2 e 0,5 %, no apresentaram diferena estatstica entre si. J a formulao com o
frmaco livre apresentou diferena estatstica na maioria dos parmetros analisados quando
comparado com os demais grupos.
Tabela 8: Valores referentes caracterizao fsico-qumica das suspenses contendo NCL 0,2 e 0,5 % e
NBR, e do frmaco livre um dia aps sua obteno (+DP).
Doseamento
Potencial
(%)
zeta (mV)
a
Dimetro
pH
(nm)
88,5 2,8a
8,4 0,0a
95,0 3,1
NCL 0,5 %
94,2 2,7a
-13,5 2,3b
0,245 0,010a
84,6 1,3a
8,7 0,0a,c
--
-16,9 0,2c
0,229 0,014a
124,3 2,0b
7,2 0,4b
109,6 2,5a
-0,02 0,52d
0,548 0,081b
323,5 44,6c
9,1 0,0c
CL livre
0,249 0,003
NCL 0,2 %
NBR
-5,2 0,4
IPD
a-b-c-d: as mdias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferena significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
O doseamento no apresentou diferena estatstica entre as NCLs 0,2 e 0,5 % em

relao ao livre, no havendo degradao do frmaco durante o processo de produo das
nanopartculas, mesmo empregando alta taxa de cisalhamento por um tempo prolongado. O
potencial zeta foi o parmetro no qual todos os grupos apresentaram-se estatisticamente
60
diferentes, sendo o potencial zeta reduzido quanto maior a concentrao de clorexidina na
formulao, mostrando a forte influncia da carga do frmaco na formulao final.
As formulaes nanoparticuladas no apresentaram diferena significativa em relao
ao ndice de polidisperso, demonstrando que a adio de frmaco na formulao no alterou
a monodispersibilidade das formulaes, sendo todos na faixa de 0,2 e adequados para
aplicao farmacutica (SCHAFFAZICK et al, 2003). O IPD apresentou diferena estatstica
das nanopartculas em relao ao frmaco livre, verificando-se a importncia do lipdeo
estruturante (manteiga de karit) nas formulaes.
Na Figura 18, podemos observar o grfico que expe o dimetro mdio das partculas.
Os valores foram bastante semelhante entre as NCLs 0,2 e 0,5 %, 88,5 + 2,8 nm e 84,6 + 1,3
nm, respectivamente. Houve uma pequena diferena, porm estatisticamente significante, no
tamanho das nanopartculas, nas duas concentraes, em relao s NBR, pois estas
apresentaram valores de 124,3 + 2,0 nm. O frmaco livre apresentou os maiores valores de
tamanho de partculas, por volta de 323,5 nm com um valor bastante elevado de DP (44,6),
indicando uma mdia de tamanho de partcula no uniforme.
Figura 18: Distribuio do tamanho mdio das partculas (nm) inicial das suspenses contendo NCL 0,2
% (linha vermelha); 0,5 % (linha verde) e NBR (linha azul).
Os valores de pH das NCLs 0,2 e 0,5 % no apresentaram diferena entre si e foram

superiores a 8,4. J a NBR apresentou o menor valor de pH, 7,2, e o frmaco livre o maior
valor, 9,1. Este resultado corrobora com os dados j descritos acima demonstrando uma forte
influncia do frmaco na formulao de nanopartculas.
Aps a incorporao das suspenses de nanopartculas ao gel de hidroxietilcelulose,
uma nova coleta de dados foi realizada e expressa na Tabela 9. Assim como ocorreu com as
61
suspenses, o gel com o frmaco livre apresentou diferena estatstica com os demais grupos
na maioria dos parmetros analisados.
Tabela 9: Valores referentes caracterizao fsico-qumica dos gis contendo NCL 0,2 e 0,5 % e NBR, e
frmaco livre um dia aps sua obteno (+DP).
Doseamento
Potencial
(%)
zeta (mV)
NCL 0,2 %
93,6+0,3
-3,21+0,32
NCL 0,5 %
95,4+0,1a
NBR
CL livre
IPD
Dimetro
pH
(nm)
a
91,7+0,4a
8,1+0,1a
0,97+1,11b
0,260+0,004a
92,7+0,8a
8,5+0,1b
--
-15,13+0,35c
0,230+0,012a
120,5+0,8a
6,1+0,1c
108,3+0,7a
-0,07+0,46d
0,554+0,066b
374,6+26,9b
9,0+0,1d
0,254+0,003
a-b-c-d: as mdias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferena significativa entre si
O doseamento do gel livre apresentou o maior valor, porm no foi estatisticamente

diferente dos valores encontrados para os gis nas concentraes 0,2 e 0,5 %, que tambm no
apresentaram diferena estatstica entre si e refletiram a concentrao da suspenso usada
como base para seu preparo, demonstrando que seu processo de produo no causou
degradao do frmaco.
O potencial zeta foi o parmetro em que, novamente, todos os grupos apresentaram-se
estatisticamente diferentes, podendo ser influenciado pelo
dispersante, pelo pH,
condutividade, concentrao dos componentes presentes na formulao, inclusive o princpio

ativo e pela fora inica do meio (TEIXEIRA, 2010). Provavelmente, a ao do frmaco
esteja interferindo nestes valores j que os valores das suspenses nas duas concentraes
encontraram prxima aos valores do frmaco livre como foi descrito na Tabela 9 e nos
grficos representados pela Figura 19.
62
Figura 19: Valores referentes a sobreposio dos grficos do potencial zeta (mV) (A) da suspenso e gel de
NCL 0,2 %; (B) da suspenso e gel NCL 0,5 %; (C) suspenso e gel NBR; e (D) suspenso e gel do
frmaco livre. As linhas vermelhas representam o potencial zeta inicial, e as linhas verdes aps os 90 dias.
As nanocpsulas de clorexidina descritas no trabalho de Nhung e colaboradores (2007)

apresentaram valores de potencial zeta de +34 + 9 mV. Este valor positivo pode estar
relacionado, segundo o autor, pela clorexidina adsorvida na interface ao redor da parte externa
do polmero ou incorporada na parte externa do polmero, pois as formulaes sem o frmaco
apresentaram valores negativos, tpicos de formulaes nas quais esto presentes PCL,
fosfolipdios e tensoativos no inicos como o polissorbato 80 e monoestarato de sorbitano
(SCHAFFAZICK et al, 2003). As formulaes de NCL no tinham a presena da PCL e, ao
analisarmos os valores do potencial zeta da NBR, observamos que apresentaram valores
negativos, provavelmente pela presena dos demais compostos citados acima. Baseado no
pequeno aumento de potencial zeta visto no presente trabalho e na discusso de Nhung e
colaboradores (2007), podemos inferir que as NCL devem possuir uma menor concentrao
de frmaco em sua superfcie que as nanocpsulas desenvolvidas anteriormente.
Da mesma maneira vista para as suspenses, o gel com frmaco livre apresentou o
maior valor de IPD, acima de 0,5, demonstrando uma no uniformidade das partculas. Os
grupos das NCL apresentaram valores semelhantes e prximos do ideal, em torno de 0,2. Ao
compararmos os valores do IPD dos gis com as suspenses, verificamos que seus valores
apresentaram pouca variao, no sendo de grande relevncia e indicando uma
63
homogeneidade na distribuio do tamanho das partculas, prevendo uma boa estabilidade das
suspenses e gis.
O dimetro mdio das partculas das formulaes dos gis no apresentou diferena
estatstica entre os grupos das NCL, apesar do branco apresentar uma mdia de tamanho de
120,5 + 0,8 nm, um pouco superior s NCL 0,2 e 0,5 % que foram, respectivamente, 91,7 +
0,4 nm e 92,7 + 0,8 nm. J a formulao com o frmaco livre apresentou valor bastante
superior, 374,6 + 26,9 nm. Se comparados estes valores mdios de dimetro das partculas dos
gis com os das suspenses, podemos verificar que, em todos os grupos, a adio ao gel de
hidroxietilcelulose no interferiu de forma significativa nestes valores, podendo ser observado
nos grficos representados pela Figura 20.
Figura 20: Valores referentes a sobreposio dos grficos do tamanho mdio das partculas (nm) (A) da
suspenso e gel de NCL 0,2 %; (B) da suspenso e gel de NCL 0,5 %; (C) suspenso e gel de NBR. As
linhas vermelhas representam as suspenses e as linhas verdes os gis.
Os valores mdios de dimetro de partcula das nanocpsulas de clorexidina descritos

por Nhung e colaboradores (2007) foram de 285 + 13 nm, valores superiores aos encontrados
neste estudo para NCL; porm, compatveis com os valores encontrados para este tipo de
nanopartcula utilizada. No caso das nanocpsulas, sua utilizao era para a via tpica e este
dimetro de partcula considerado adequado. Por outro lado, no presente trabalho, a via de
administrao intracanal, sendo interessante obtermos o menor tamanho de partcula
possvel a fim de elas alcancem toda a extenso dos canalculos dentinrios.
64
Houve uma diferena significativa nos valores de pH entre todos os grupos dos gis. O
menor valor de pH foi encontrado no gel de NBR, e o maior valor nos gis de CL livre,
respectivamente de 6,1 e 9,0. Os valores do pH das suspenses No foram afetados por sua
adio no gel.

NCL
A anlise da estabilidade um processo importante para identificar fatores

relacionados formulao, fabricao, condies de armazenamento ou ambientais, que
podem, de alguma forma, influenciar na estabilidade do produto (BRASIL, 2004), a fim de
assegurar a qualidade das formulaes.
Os estudos realizados para a determinao da estabilidade das suspenses e aps
incorporao no gel, levaram em considerao a determinao do dimetro das partculas, pH,
ndice de polidisperso, potencial zeta e teor do ativo.
As formulaes contendo NBR foram avaliadas como controle do experimento e a
caracterizao fsico-qumica das mesmas foi de suma importncia para avaliar se houve
alteraes no comportamento destes sistemas aps a incorporao do frmaco
nanoestruturado. Assim como, a comparao foi realizada com o frmaco livre. Para este
estudo, uma nica suspenso de cada tipo foi preparada e dividida nas diferentes condies de
armazenamento para que no houvesse diferena inicial entre os parmetros.
4.3.1. Dimetro mdio das partculas e ndice de polidisperso
Como j foi resultado anteriormente, a anlise do tamanho de partcula e do ndice de

polidisperso em funo do tempo so parmetros importantes que devem ser observados
tanto na caracterizao fsico-qumica, como tambm, nos testes de estabilidade, pois
alteraes em seus valores podem indicar sedimentao do sistema (GUTERRES et al, 1995),
o que interferiria diretamente no processo de estabilidade das suspenses e gis.
65
A Tabela 10 expressa os valores do dimetro mdio das partculas e IPD das
suspenses de NCL 0,2 e 0,5 %, e NBR, respectivamente, no tempo de 0 dias e aps o
armazenamento em TA, GE e ES pelo perodo de 90 dias.
Tabela 10: Dimetro mdio das partculas e IPD das suspenses de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR (+DP).
Tempo (dias)
NCL 0,2 %
NCL 0,5 %
NBR
88,5+2,8a-d
84,6+1,3a
124,3+2,0b-d-e
GE
97,2+8,9a-b-d
85,5+2,8a
124,8+1,0b-d-e
TA
87,7+1,9a-d
81,2+3,6a
121,9+1,4d-e
ES
196,6+21,3c
197,8+25,7c
129,3+5,2e
0,249+0,003a-d-e
0,245+0,010a-d-e
0,229+0,014d-e-f
GE
0,324+0,057b
0,293+0,031a-b-d
0,219+0,010e-f
TA
0,315+0,086a-b
0,262+0,030a-d-e
0,223+0,007e-f
ES
0,056+0,012c
0,059+0,024c
0,168+0,011f
0
Tamanho (nm)
90
0
IPD
90
a-b-c-d-e-f: as mdias com as letras diferentes para o mesmo parmetro apresentaram diferena significativa
entre si (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Analisando os valores expressos na Tabela anterior, podemos observar que os grupos

das nanopartculas lipdicas, apresentaram-se estveis, com alteraes no significantes do
tamanho mdio das partculas e IPD, quando armazenadas em TA ou GE.
Ao serem submetidas a uma temperatura de 40 C (estufa) pelo perodo de 90 dias, as
suspenses de NCLs 0,2 e 0,5 % apresentaram grandes alteraes, com aumento do tamanho
mdio de partcula e reduo do IPD. Isso pode ser claramente visto na Figura 21A e B,
respectivamente, onde os grficos sobrepostos das amostras armazenadas em TA, GE e ES
nos mostram a comparao do tamanho das partculas e IPD.
Figura 21: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio de partcula das suspenses de NCLs (A) 0,2% e
(B) 0,5% no tempo 0 (linhas vermelhas) e aps 90 dias de armazenamento em TA (linhas verdes), GE
(linhas azuis) e ES (linhas pretas).
66
Os grficos das amostras armazenadas na ES das suspenses de NCLs 0,2 e 0,5 % so

completamente diferente dos demais, evidenciando o processo de agregao das partculas e
decomposio dos demais componentes devido a manuteno por um longo perodo em
temperaturas elevadas.
A manteiga de karit, cujo ponto de fuso entre 34 e 42 C pode estar fundindo
durante o armazenamento a 40 C e sua recristalizao no forma mais as nanopartculas de
tamanho originais, dando tambm margem maior degradao do frmaco. Este fenmeno de
coalescncia deve ocorrer apenas quando h uma fuso parcial da manteiga, pois nas outras
temperaturas de armazenamento o sistema mostrou-se estvel e adequado.
Nas suspenses NBRs, os valores mantiveram-se estveis independentes da
temperatura de armazenamento como visto anteriormente na Tabela 10 e na Figura 22,
exposta a seguir. A nica diferena significativa ocorreu com o IPD das amostras
armazenadas em ES, assim como ocorreu com as NCLs 0,2 e 0,5 %, havendo diminuio do
valor, apesar de menor proporo.
Figura 22: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio de partcula das suspenses NBRs no tempo 0
(linha vermelha) e aps 90 dias de armazenamento em TA (linha verde), GE (linha azul) e ES (linha
preta).
As suspenses de frmaco livre apresentaram alteraes no tamanho mdio das

partculas independentemente da condio de armazenamento, inclusive, as amostras
armazenadas em ES estavam visivelmente alteradas, com mudana na colorao e odor,
ficando inviveis para anlise.
Podemos observar na Tabela 11 os valores do dimetro mdio das partculas e IPD
dos gis de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR, respectivamente, no tempo de 0 dias e aps o
armazenamento em TA, GE e ES pelo perodo de 90 dias.
67
Tabela 11: Dimetro mdio das partculas e IPD dos gis de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR (+DP).
Tempo (dias)
NCL 0,2 %
NCL 0,5 %
NBR
91,7+0,4a-b-c
92,7+0,8a-b-c
124,3+2,0a-b-c-d
GE
90,2+1,0a-c
82,9+2,1c
Fungou
TA
82,7+0,5a-c
101,2+6,0a-b-c
146,6+0,9d
ES
141,7+3,6b-d
183,9+1,9a-b-c
Fungou
0
Tamanho (nm)
90
0
IPD
90
0,254+0,003
a-b
0,260+0,004
a-b
0,229+0,014a-b
GE
0,323+0,075b-c
0,219+0,012a
Fungou
TA
0,227+0,017a
0,199+0,009a
0,398+0,014c-d
ES
0,358+0,052c-d
0,441+0,020d
Fungou
a-b-c-d: as mdias com as letras diferentes para o mesmo parmetro apresentaram diferena significativa entre si
As formulaes de NCLs 0,2 e 0,5 % na forma de gel apresentaram alteraes

significantes do tamanho mdio das partculas e do IPD quando as amostras foram
armazenadas a uma temperatura de 40 C pelo perodo de 90 dias, como se pode ver na
Tabela 11. A Figura 23A e B, respectivamente, mostram a sobreposio dos grficos do
tamanho das partculas e IPD das amostras armazenadas em TA, GE e ES.
Figura 23: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio das partculas dos gis de NCLs (A) 0,2 % e (B)
0,5 % no tempo 0 (linhas vermelhas) e aps 90 dias de armazenamento em TA (linhas azuis), GE (linhas
verdes) e ES (linhas pretas) .
Nos gis de NBRs, como mostrou a Tabela 11, foi possvel observar um aumento
significativo no tamanho das partculas e tambm no IPD das amostras armazenadas em TA.
J nas amostras armazenadas em GE e ES, houve a proliferao de fungos, como se observa
na Figura 24. Isso ocorreu por no ter sido feita a adio de conservante s formulaes
devido ao bactericida da clorexidina, mantendo-se o branco tambm sem adio de
conservantes, j que este poderia comprometer a comparao dos parmetros fsico-qumicos
68
entre as formulaes. Desta forma, foi invivel a anlise destas amostras, por isso, a Figura 25
expressa apenas a comparao dos grficos da TA com o inicial.
Figura 24: Proliferao fngica nas amostras dos gis de NBRs armazenadas em GE e ES.
Figura 25: Sobreposio dos grficos do tamanho mdio das partculas dos gis de NBRs no tempo 0
(linha vermelha) e aps 90 dias de armazenamento em TA (linha verde).
O gel de CL livre apresentou reduo do dimetro de partcula aps o perodo de 90

dias. Quando armazenada em TA, houve reduo significativa do valor de IPD, j quando
armazenada em GE, houve um aumento do valor.
4.3.2. Anlise do pH e doseamento
A anlise do pH em funo do tempo de armazenamento pode nos fornecer

informaes importantes sobre a estabilidade das formulaes, incluindo aquelas que contem
nanopartculas lipdicas, j que a alterao de seus valores pode estar relacionado diretamente
com a degradao de componentes presentes na formulao.
A Tabela 12 expe os valores do pH e da quantidade de frmaco presentes nas
suspenses em estudo aps o armazenamento por 90 dias em TA, GE e ES.
69
Tabela 12: Mdia do pH e doseamento das suspenses de NCLs 0,2 e 0,5 %, NBR e CL (+DP).
Tempo
NCL 0,2 %
NCL 0,5 %
NBR
CL
8,4+0,0a
8,7+0,0a
7,2+0,4a
9,1+0,0a
GE
7,6+0,1c
7,3+0,5b
6,7+0,2c
7,6+0,1b
TA
6,7+0,0b
7,0+0,3b
6,1+0,1b
7,3+0,1b
ES
5,7+0,6d
5,9+0,4c
5,2+0,2d
5,7+0,1c
95,0+3,1a
94,2+2,7a
-------
109,6+2,5a
GE
89,7+3,3a
86,4+8,0a
-------
95,7+3,5a
TA
84,5+1,2a
87,1+0,9a
-------
93,6+0,0a
ES
62,4+7,0b
71,1+5,9b
-------
75,4+3,2b
(dias)
0
pH
90
0
Doseamento (%)
90
a-b-c-d: as mdias com as letras diferentes para o mesmo parmetro apresentaram diferena significativa entre si
Ao analisarmos os valores do pH inicial e aps o perodo de 90 dias de

armazenamento das NCLs 0,2 e 0,5 %, podemos observar que houve uma reduo do valor do
pH inicial semelhante nas duas concentraes, nas diferentes formas de armazenamento, no
havendo diferena significante entre os dois grupos. Porm, ao compararmos a forma de
armazenamento entre si, observamos que em ambas as suspenses, houve uma maior variao
de pH nas amostras armazenadas em ES, passando de 8,4 para 5,7 nas suspenses de NCLs
0,2 %, e 8,7 para 5,9 nas suspenses de NCLs 0,5 %. Esta alterao de pH se deve,
principalmente degradao do frmaco e desestabilizao dos sistemas pela temperatura.
Esta alterao de pH tambm ocorreu nas suspenses de NBR, demonstrando no ser um
efeito apenas da degradao do frmaco mas tambm fortemente da desestabilizao do
sistema.
Porm, a maior variao do pH inicial e aps os 90 dias encontra-se nas amostras das
suspenses de frmaco livre armazenadas em ES, onde o pH partiu de 9,1 para 5,7. E
novamente, os valores menos equidistantes foram encontrados nas amostras armazenadas em
GE, onde os valores passaram para 7,6. Essa variao de pH vem acompanhada pela
degradao da formulao, incluindo a clorexidina, composto ativo que tambm sofre reduo
nos seus valores de doseamento, pois assim como o pH, as amostras armazenadas na ES
apresentaram a maior variao da porcentagem de quantificao, passando de 95 % para 62,4
% nas suspenses de NCLs 0,2 %; 94,2 % para 71,1 % nas NCLs 0,5 % e 109,6 % para 75,4
70
% nas suspenses de CL livre. As suspenses de CL livre apresentaram uma maior
degradao do composto ativo nas trs formas de armazenamento quando comparadas com as
suspenses de nanopartculas. Assim como as suspenses foram avaliadas, os gis tiveram
seus valores de pH e doseamento expressos na Tabela 13.
Tabela 13: Mdia do pH e doseamento dos gis de NCLs 0,2 e 0,5 %, NBR e CL (+DP).
Tempo
NCL 0,2 %
NCL 0,5 %
NBR
CL
8,1+0,1a
8,5+0,1a
6,1+0,1a
9,0+0,1a
GE
7,7+0,2a
7,8+0,5a-b
Fungou
8,5+0,0a-b
TA
7,0+0,3b
7,6+0,2b
3,4+0,3b
8,1+0,2b
ES
4,4+0,2c
5,5+0,0c
Fungou
Secou
93,6+0,3a
95,4+0,1a
-------
-------
GE
86,3+10,2a
95,5+3,8a
-------
-------
TA
60,7+1,1b
82,5+1,3a
-------
-------
-------
-------
-------
(dias)
0
pH
90
0
Doseamento (%)
90
ES
85,46+0,0
a-b: as mdias com as letras diferentes para o mesmo parmetro apresentaram diferena significativa entre si
Os gis de NCLs 0,2 e 0,5 % apresentaram menores variaes de pH quando

armazenados em TA e GE e, ao serem comparados com as suspenses nas mesmas formas de
armazenamento, mantiveram a maior variao nas amostras armazenadas em ES, passando de
8,1 para 4,4 e 8,5 para 5,5, respectivamente.
Nos gis de NBRs, apenas foi possvel fazer anlise das amostras armazenadas em
TA, na qual o valor inicial de pH passou de 6,1 para 3,4. Nas amostras armazenadas em GE e
ES, houve proliferao de fungos, sendo invivel a anlise. Talvez, em TA tambm tenha
ocorrido contaminao microbiolgica, mesmo que ainda imperceptvel, podendo ser a causa
de tamanha alterao no pH.
Devido a isso, o doseamento do teor do frmaco foi realizado apenas nas amostras de
NCL 0,2 % armazenadas em ES, apresentando uma variao inferior que as amostras
armazenadas em TA e GE, corroborando com os dados de pH, dimetro de ndice de
polidisperso.
Aps o perodo de 90 dias, podemos concluir que as suspenses e os gis de NCLs 0,2
e 0,5 % mantiveram-se estveis quando armazenados em TA ou em GE. J as formulaes
71
armazenadas em ES apresentaram diferena significativa no tamanho das partculas e/ou do
ndice de polidisperso, pH e teor de frmaco, sendo recomendada a manuteno destes
produtos em temperatura mxima de 25 C.
O frmaco livre, tanto na forma de suspenso ou gel, apresentou valores imprecisos,
contraditrios, e ao ser armazenado em ES, sofreu total alterao, sendo invivel sua anlise,
demonstrando que esta forma farmacutica no adequada para veiculao da clorexidina.
4.4. AVALIAO IN VITRO DA DEGRADAO DA CLOREXIDINA ASSOCIADA

PASTA DE HIDRXIDO DE CLCIO
No momento que se tem a ideia de associar frmacos com o intuito de um

complementar o outro, de fundamental importncia que eles no interfiram na ao
individual de cada um. Alm disso, toda vez que uma mistura de substncias para uso clnico
elaborada, a anlise deste produto resultante deveria ser realizada com o intuito de controlar
seus efeitos benficos ou deletrios.
Como j foi descrito na literatura (ZERELLA et al, 2005; BARBIN, et al, 2008), a
associao da clorexidina e pasta de hidrxido de clcio tem grandes benefcios, porm pode
ocorrer a precipitao da clorexidina devido ao elevado pH do hidrxido de clcio. Com isso,
alm de prejudicar a ao individual de cada um dos frmacos, pode ocorrer a formao de
subprodutos, que podem vir a ser txicos. Yeung e colaboradores (2007) chegam a afirmar
que os subprodutos da clorexidina formados da sua degradao em elevado pH seriam os
responsveis pelo efeito antimicrobiano persistente, devido a uma ao pr-oxidante destes
subprodutos.
Como forma de observao desta alterao qumica gerada pela mistura da CL com a
pasta de HCA, Barbin e colaboradores (2008) utilizaram a espectrometria de massa e CLAE.
Em nosso estudo, este acompanhamento foi realizado atravs da anlise da variao do pH,
que tambm foi utilizado como mtodo complementar no estudo de estabilidade das
formulaes elaboradas neste trabalho, e CLAE.
O HCA, o gel de CL livre e o gel de NCL foi analisado de forma isolada e em
associao pelo perodo de 14 dias, tempo clnico utilizado entre as sesses de tratamento
endodntico quando utilizado como medicao a pasta de HCA.
72
4.4.1. Anlise do pH
Para uma efetiva ao antimicrobiana do HCA e de seus demais benefcios,

necessrio que ele mantenha elevados nveis de pH. Esse efeito antimicrobiano do HCA est
ligado diretamente elevao do pH resultante da dissociao, em meio aquoso, dos ons
hidroxila e ons clcio (ESTRELA, et al, 1995; FAVA e SAUNDERS, 1999). Desta forma, a
adio de CL pasta de HCA no deve alterar essa propriedade, assim como, a adio da
pasta CL no deveria causar nenhum tipo de alterao da CL.
Observando os valores do pH (Tabela 14), no tempo inicial e aps o perodo de 14
dias de cada formulao, podemos verificar que a pasta de HCA apresentou um pH acima de
12 durante todo o perodo de anlise. O gel de CL livre apresentou valor mdio bastante
inferior pasta, em torno de 6,7. O gel de NCL apresentou um valor pH um pouco superior ao
gel livre, acima de 7.
Ao se analisar os valores do pH da CL 0,5 % HCA, podemos observar que no houve
alterao significativa do pH da pasta, pois o pH manteve-se elevado, acima de 12 para a
associao com gel livre e acima de 11,9 para associao com gel de nanopartculas.
Tabela 14: pH inicial e final de cada formulao.
Grupos
Valores de pH
Inicial
Aps 14 dias
Gel CL 0,5 %
6,78 + 0,09
7,14 + 0,07
Gel CL 0,5 % HCA
12,19 + 0,03
12,13 + 0,05
Gel NCL 0,5 %
7,15 + 0,04
7,20 + 0,05
Gel NCL 0,5 % HCA
11,25 + 0,04
11,90 + 0,07
HCA
12,15 + 0,06
12,58 + 0,06
A adio do gel de CL livre pasta do HCA no alterou o pH do HCA, bem como foi
relatado por Basrani, Ghanen e Tjaderhane (2004) que comprovaram o mesmo efeito no seu
estudo.
Signoretti e colaboradores (2011) tambm encontraram valores de pH da associao
da pasta de HCA com a CL em torno de 12, indo de encontro com nossos resultados, o que
nos faz concluir que a adio do gel de CL, aparentemente, no interferiu nas propriedades
73
fsico-qumicas da pasta de HCA, j que o pH um parmetro de grande importncia durante
a anlise da estabilidade desta substncia.
Em relao ao gel contendo NCL, ainda no h descrio na literatura. Porm,
partindo do mesmo princpio do qual no houve a alterao do pH da pasta aps sua
associao, possvel concluir que a composio das NCL tambm no interferiu nas
propriedades do HCA.
Ao analisarmos os valores do pH da CL livre e em nanopartculas, podemos observar
que houve um aumento bastante significante aps a associao deste gis com a pasta de
HCA. Este aumento do pH, como j foi relatado, poderia provocar algum tipo de alterao na
CL, por isso, segue a anlise do teor do ativo.
4.4.2. Doseamento
Na Tabela 15, podemos observar o teor de frmaco, expresso em porcentagem, inicial

e aps o perodo de 14 dias de cada formulao. A diferena da concentrao inicial e final foi
realizada como forma de estabelecer a porcentagem de reduo de frmaco neste perodo.
A quantidade de reduo de frmaco no gel de CL livre foi de 2,2 % e do gel de NCL,
0,3 %, diferena esta no significante, podendo ter sido ocasionada at mesmo durante o
processo de manipulao e preparo das formulaes para o doseamento em CLAE.
J no gel de CL 0,5 % HCA esta diferena foi bastante considervel, apresentando
uma reduo de 33,1 % da quantidade de frmaco inicial aps o perodo de 14 dias, enquanto
que, no gel de NCL 0,5 % HCA, esta reduo foi de apenas 10,3 %, ou seja, o frmaco livre
degradou trs vezes mais que o frmaco em nanopartcula quando em associao com a pasta
de HCA.
74
Tabela 15: Concentrao inicial (%) de frmaco e aps o perodo de 14 dias nos diferentes grupos, e sua
reduo neste perodo.
Grupos
Concentrao em %
Inicial
Aps 14 dias
Reduo
Gel CL 0,5 %
81,7 %
79,5 %
2,2 %
Gel CL 0,5 % HCA
78,8 %
45,7 %
33,1 %
Gel NCL 0,5 %
94,2 %
93,9 %
0,3 %
Gel NCL 0,5 % HCA
94,8 %
84,5 %
10,3 %
Ao observarmos a sobreposio dos cromatogramas (Figura 26) referentes ao gel de

NCL e NCL 0,5 % HCA em diferentes dias de anlise, podemos ver que, mesmo aps 14
dias, no se observa nenhum produto de degradao.
Figura 26: Sobreposio de cromatogramas correspondente ao gel de NCL 0,5 % (linha preta) e NCL 0,5
% HCA aps 2 (linha vermelha) e 14 dias (linha rosa).
A proteo do frmaco pelos sistemas de nanocarreadores vem sendo pesquisada por

diversos autores e considerada uma das grandes vantagens sobre os sistemas de entrega de
frmacos convencional (NHUNG et al, 2007). A proteo do frmaco pode se dar frente a
altas temperaturas, alterao do pH, agentes qumicos, ou qualquer outro fator que possa
provocar a degradao prematura do frmaco.
Diferentes frmacos foram encapsulados com o objetivo de promover sua proteo. O
diazepan um exemplo de frmaco que, quando administrado por via oral, sofre hidrlise
cida e metabolismo heptico. Foi encapsulado em nanopartculas lipdicas slidas
(ABDELBARY et al, 2009) com o intuito de reduzir sua degradao. Outro frmaco que
tambm pode ser citado a vimpocetina (LUO et al, 2006), utilizada no tratamento de
distrbios circulatrios cerebrovasculares, que apresenta baixa absoro oral, sendo
75
rapidamente metabolizada e eliminada do organismo; quando encapsulado em nanopartculas
lipdicas slidas, o frmaco apresenta-se protegido da ao qumica dos cidos presentes no
sistema digestivo.
Neste estudo, podemos comprovar a proteo da clorexidina, quando apresentada em
nanopartculas, aps a associao com a pasta de hidrxido de clcio e a degradao da
clorexidina na forma livre aps a mesma associao. Porm, ao contrrio de Barbin e
colaboradores (2008), no foi comprovada a degradao total do frmaco logo aps a mistura,
e sim uma reduo acelerada, mas gradual, com o passar do tempo da clorexidina.
4.5. ANLISE MICROBIOLGICA
4.5.1. Teste de difuso em gar
Para o teste de difuso em gar, optou-se pelo uso de cilindros de ao inoxidvel, j

que os discos de papel poderiam reter as nanopartculas, dificultando sua difuso.
Os testes foram realizados em triplicata para cada microrganismo, com um ensaio de
trs pontos para uma maior validao, no qual foram utilizadas duas diferentes concentraes
para o padro: soluo de CL 0,2 e 0,5 % e amostra: suspenso de NCL 0,2 e 0,5 %. Como
grupos controle foram utilizados o propilenoglicol e NBR.
Como as nanopartculas liberam lentamente o frmaco, espera-se uma ao inicial
mais lenta e, por isso, os halos de inibio foram medidos por um maior perodo de tempo,
iniciando em 24, 48 e, por ltimo, 72 h (Figura 27).
76
Figura 27: Placas aps o perodo de 72 horas para anlise do dimetro com paqumetro digital.
Na Tabela 16, encontram-se as mdias dos halos de inibio de acordo com o

microrganismo, tempo e concentrao.
Tabela 16: Mdia dos halos de inibio (mm) + DP da soluo de CL e das NCL.
Candida albicans
Concentraes
Enterococcus faecalis
24 h
48 h
72 h
24 h
48 h
72 h
P1
20,4+0,8a
21,5+0,9a
22,6+1,9a-b
19,8+0,7a-b
19,5+0,4a-b
20,6+1,4a-b
P2
22,3+0,1a-b
22,6+0,9a-b
25,2+0,8b
21,2+0,9a
21,7+0,8a
18,9+0,3b
P3
A1
13,5+0,6c
14,85+0,9c
15,5+0,8d
9,5+0,3c
10,5+0,6c
15,3+0,6d
A2
14,4+0,8c
15,3+1,7c
15,8+1,3d
10,7+0,8c
11,6+0,1c
17,0+0,6b-d
A3
P1: CL 0,2 %; P2: CL 0,5 %; P3: propilenoglicol; A1: NCL 0,2 %; A2: NCL 0,5 %; A3: NBR.
a-b-c-d: as mdias com as letras diferentes para o mesmo microrganismo apresentaram diferena significativa
entre si (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Observando os valores dos halos de inibio da CL livre, podemos verificar que no

houve diferena significativa em relao concentrao utilizada e o tempo de ao. Porm,
os padres apresentaram valores de halos de inibio maiores que os das NCL, nas duas
concentraes. Os halos de inibio foram maiores para C. albicans do que E. faecalis.
As suspenses de nanopartculas tambm no apresentaram diferena significativa no
tamanho do halo de inibio entre as concentraes testadas, sendo os valores menores que a
forma livre, mas crescente com o passar do tempo, enquanto que na forma livre toda sua ao
77
ocorre praticamente nas primeiras 24 horas. Este resultado que vem de encontro com o que
descrito na literatura (SCHAFFAZICK, 2003; NHUNG et al, 2007; ALHAJ et al, 2008) como
sendo uma vantagem dos sistemas carreadores de frmaco a lenta liberao do frmaco,
fazendo com que haja uma manuteno de concentrao de frmaco com o passar do tempo.
Apesar das medidas dos halos de inibio das nanopartculas terem sido de menor
expresso, o estudo foi importante para comprovar que a nanoencapsulao da clorexidina
no afeta sua atividade antimicrobiana. As nanopartculas mostraram um aumento gradual do
halo de inibio de acordo com o tempo de exposio, confirmando a liberao lenta do
frmaco.
4.5.2. Concentrao inibitria mnima (CIM)
As CIMs foram descritas na Tabela 17 de acordo com o tipo de formulao e o tipo de

microrganismo testado.
Tabela 17: CIM de acordo com a formulao e o tipo de microrganismo.
Grupos
CIM
Candida albicans
Enterococcus faecalis
Suspenso CL 0,5 %
1,46 g/mL
1,46 g/mL
Suspenso NCL 0,5 %
1,46 g/mL
1,46 g/mL
Gel NCL 0,5 %
1,46 g/mL
1,46 g/mL
Gel CL 0,5 % HCA
5,8 g/mL
5,8 g/mL
Gel NCL 0,5 % HCA
1,46 g/mL
2,9 g/mL
HCA
46,8 g/mL
5,8 g/mL
Na literatura, podemos encontrar diversos autores que relatam a CIM da clorexidina

(RUSSEL et al, 1993; ESTRELA et al, 2003; AMORIM et al, 2004; LOFTI et al, 2011) e do
hidrxido de clcio (ESTRELA et al, 2003; PALLOTTA et al, 2007), porm, devido grande
diferena nas metodologias, os valores no so exatamente os mesmos.
Em nosso estudo, o maior valor de CIM foi do grupo HCA, que, contra o E. faecalis
foi de 5,8 g/mL, e para C. albicans 46,8 g/mL. Estes dados confirmam a afirmao feita
por alguns autores (EVANS et al, 2003; SOARES et al, 2006; LEE et al, 2008) que o HCA
78
menos efetivo contra E. faecalis e, principalmente, contra C. albicans, j que a CIM
encontrada foi quase 10 vezes maior do que do mesmo medicamento contra o E. faecalis e 32
vezes maior que o valor apresentado pela clorexidina.
A CIM da CL livre, em nanopartculas ou nanopartculas em gel apresentou o mesmo
valor de 1,46 g/mL, tanto para E. faecalis, quanto para C. albicans. Russel e colaboradores,
em 1993, relataram valores da CIM da clorexidina contra o E. faecalis, variando de 1 g/mL a
2,5 g/mL. J Amorim e colaboradores (2004) relataram valor de 3,33 g/mL contra E.
faecalis e 4 g/mL contra C. albicans, valores superiores aos encontrados pelo nosso estudo.
No momento em que a HCA foi adicionada a CL, podemos observar um aumento
significante do valor da CIM, passando de 1,46 g/mL para 5,8 g/mL, tanto para E. faecalis,
quanto para C. albicans, representando um aumento de duas vezes na concentrao de
clorexidina necessria para apresentar a mesma ao antimicrobiana. No grupo do E. faecalis,
este valor de 5,8 g/mL seria o equivalente ao valor do HCA, fazendo com que a ao da
clorexidina, tenha sido praticamente anulada, j que os valores da CIM foram os mesmos.
Este resultado est relacionado com o que foi descrito por Barbin e colaboradores (2008) e
tambm comprovado por este estudo, com resultados descritos no item 4.4, no qual foi feita a
anlise da degradao da clorexidina na associao com o HCA, ficando evidente a
degradao da clorexidina, fato este que causaria a diminuio da sua ao antimicrobiana.
Porm, ao adicionarmos as NCLs com a HCA, podemos observar que a CIM contra o
E. faecalis passou de 1,46 g/mL para 2,9 g/mL e, contra C. albicans, o valor permaneceu o
mesmo. Provavelmente, isso se deva proteo do frmaco pelas nanopartculas lipdicas,
evitando a degradao da clorexidina causada pelo elevado pH do HCA, mantendo seu efeito
antimicrobiano.
4.6. PENETRAO DAS NANOPARTCULAS NOS TBULOS DENTINRIOS
A presena e a profundidade de penetrao das NCL no interior dos tbulos

dentinrios teve como mtodo de anlise o uso de imagens por microscopia eletrnica de
varredura (MEV) e o espectro fornecido pela energia dispersiva de raios-X (EDS).
Para anlise de MEV, necessrio um processo de desidratao da amostra para
realizao das imagens. A tcnica usual composta pela imerso dos elementos dentrios em
79
concentraes crescentes de etanol ou acetona (PAGONIS et al, 2010). Porm as
nanopartculas lipdicas so decompostas na presena de solventes. Como alternativa, a
desidratao das amostras foi realizada com auxlio de um dessecador, vcuo, pelo perodo
de 10 dias.
Como j foi relatado por Sen e colaboradores (1995), a smear layer acaba se
depositando e obliterando a entrada dos tbulos dentinrios prejudicando a ao dos agentes
irrigantes e da medicao intracanal. Para a remoo desta lama dentinria, seguiu-se parte
das recomendaes feitas por Perez e colaboradores (1993), que seria um banho ultrassnico
em EDTA 17 % por 10 minutos, seguido de hipoclorito de sdio a 5,25 % por mais 10
minutos. A etapa do hipoclorito de sdio a 5,25% no foi realizada, porque utilizamos como
mtodo de anlise o EDS, e como o objetivo era identificar tomos de cloro presentes na
clorexidina, o cloro do hipoclorito de sdio poderia interferir no resultado, pois no seria
possvel identificar se o cloro seria originrio da clorexidina ou do hipoclorito.
Mesmo com o protocolo alterado, a remoo da smear layer foi efetiva e os tbulos
dentinrios do grupo controle, no qual no foi utilizado medicamento, ficaram expostos, como
mostra a Figura 28, favorecendo a livre penetrao das NCL.
Figura 28: Micrografia eletrnica da exposio dos tbulos dentinrios aps o processo de remoo da
smear layer nas amostras do grupo controle.
Foi possvel observar nas imagens obtidas pelo MEV a presena das nanopartculas
lipdicas na superfcie da estrutura dentria e dentro dos tbulos dentinrios, como se pode
observar na Figura 29, assim como Pagonis e colaboradores (2010), que tambm relataram a
80
presena de nanopartculas de azul de metileno no interior dos tbulos dentinrios atravs do
mesmo mtodo de anlise.
Figura 29: Microscopia eletrnica de varredura. A) Micrografia eletrnica da deposio das NCL sobre a
superfcie dentria. B) Micrografia eletrnica da presena de NCL no interior dos tbulos dentinrios.
Musial e colaboradores (2010) utilizaram como mtodo de identificao da clorexidina

e a forma como esta estava distribuda na matriz polimrica de nanocpsulas, a porcentagem
atmica de cloro identificado pelos espectros do sistema EDS associado ao MEV. Da mesma
forma, o EDS foi utilizado em nosso estudo para identificar a presena de tomos de cloro e,
desta forma, localizar as provveis NCL.
Com isso, podemos observar na Figura 30 a provvel presena de NCL sobre a
superfcie dentria e mais profundamente no interior dos tbulos dentinrios, atravs da
confirmao pela anlise quantitativa dos tomos de cloro realizado pelo EDS (Tabela 18).
81
1
2
2
Figura 30: A) Micrografia da estrutura dentria com a suspenso de NCL depositada (1) sobre a luz do
canal e (2) no interior dos tbulos dentinrios. B) Espectro do EDS mostrando presena de cloro (1) na
superfcie dentria e em menor quantidade de tomos cloro (2) no interior dos tbulos dentinrios.
Tabela 18: Anlise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro.
% dos tomos
C-K
O-K
Ponto 1 (pt1)
59.33
11.29
Ponto 2 (pt2)
48.88
14.35
Mg-K
0.37
Si-K
0.42
P-K
Cl-K
Ca-K
Zn-L
Au-M
4.47
3.48
9.14
7.87
4.42
11.51
0.68
19.86
0.96
2.96
A Figura 31 ilustra a presena de NCL obliterando a entrada dos tbulos dentinrios,

sendo observado tanto na formulao gel, quanto na suspenso. Desta forma, podemos inferir
que a forma de apresentao no interferiu no processo de deposio das nanopartculas.
82
A
Figura 31: Micrografias de NCL obliterando a entrada dos tbulos dentinrios (A) em gel e (B) em
suspenso.
As NCLs em gel tendem a se depositar mais na superfcie da estrutura, provavelmente

pela maior tenso superficial e viscosidade do gel, enquanto que na forma de suspenso, as
nanopartculas apresentam uma maior profundidade de penetrao para o interior dos tbulos,
como podemos observar na Figura 32.
A
Figura 32: Micrografia dos tbulos dentinrios. A) em gel. B) em suspenso.
Utilizando o EDS, podemos evidenciar pelo espectro a presena de tomos de cloro na

superfcie dentinria em uma quantidade superior h observada no interior dos tbulos
dentinrios. Isto pode estar relacionado menor quantidade de NCL no interior dos tbulos
dentinrios e, consequentemente, menor deteco de tomos de cloro pelo EDS, como pode
ser observado na Figura 33 e Tabela 19.
83
B
Figura 33: A) Micrografia de NCL na superfcie dentria e no interior dos tbulos dentinrios e B) seus
respectivos espectros em EDS.
% de tomos
C-K
O-K
Ponto 1 (pt1)
75.86
6.80
Ponto 2 (pt2)
18.58
Mg-K
P-K
0.74
24.82
Cl-K
Ca-K
Zn-L
Au-M
2.98
1.70
7.32
5.35
0.98
48.59
1.14
5.16
Nas regies onde h presena de pequena quantidade de NCL, o sinal no espectro

relativo ao cloro tambm diminudo. Isso acontece na regio apical do canal radicular, como
possvel observar na Figura 34 e Tabela 20.
A
Figura 34: A) Micrografia da regio apical do canal radicular e mnima presena de NCLsobre a
superfcie dentinria, confirmada B) pelo espectro do EDS que identificou pequena quantidade de cloro.
84
% tomos
C-K
O-K
Na-K
P-K
Cl-K
Ca-K
Zn-L
Au-M
Base(18)_pt1
68.34
10.13
0.10
3.28
0.23
16.48
0.06
1.38
Com base nos resultados encontrados neste estudo, a metodologia utilizando MEV,
mostrou-se adequada para a observao e identificao das NCLs na forma de suspenso e em
gel, assim como Pagonis e colaboradores (2010) tambm utilizaram a MEV para identificar
nanopartculas, porm de azul de metileno, no interior de tbulos dentinrios. O uso do EDS
foi proposto como forma de completar esta avaliao identificando tomos para a qualificao
das imagens, assim como Musial e colaboradores (2010) tambm o fizeram.
Na literatura, podemos observar outros mtodos obteno de informaes relativas
forma e ao tamanho das nanopartculas, como a microscopia eletrnica de transmisso (MET)
(HALL et al., 2007), ou ainda a microscopia de fora atmica (MFA) (SCHFFAZICK et al.,
2003).
4.7. ESTUDO IN VIVO EM RATOS
4.7.1. Anlise radiogrfica
A anlise radiogrfica forneceu imagens nas quais podemos observar uma rea
radiolcida na regio periapical da raiz mesial do primeiro molar inferior sugestiva de
periodontite apical. A Figura 35 apresenta as imagens radiogrficas representativas das leses
periapicais aps a utilizao das medicaes intracanal. A Figura 36A ilustra o grupo
controle, no qual foi utilizado o propilenoglicol. A rea radiolcida mostra-se visivelmente
maior que os demais grupos, demonstrando a maior rea afetada. J nas imagens da Figura
36B, C e F podemos observar leses de menor tamanho, sugestivas de reparo na regio apical
aps o uso da medicao intracanal do gel CL 0,5 %, gel NCL 0,5 % e sua associao com
HCA, respectivamente.
85
A
Figura 35: Imagens radiogrficas representativas das leses periapicais em ratos aps a utilizao de
medicao intracanal de acordo com cada grupo: (A) Controle; (B) Gel CL 0,5 %; (C) Gel NCL 0,5 %;
(D) Gel NBR; (E) Gel CL 0,5 % HCA; (F) Gel NCL 0,5 % HCA; (G) HCA.
Aps a mensurao do tamanho das reas das leses, os valores da mdia foram
expostos no grfico da Figura 36.
86
Pixels / pol
150000
100000
a-c
c-d-f
50000
d-e-f
b-d-e b-d-e
C
A
H
H
+
0,
5
C
L
0,
5
C
A
A
C
+
on
tr
ol
e
C
L
0,
5
N
%
C
L
0,
5
%
B
R
a-b-c-d-e-f: os grupos com as letras diferentes apresentaram diferena significativa entre si (p<0,05) de acordo
com o teste de Fisher.
Figura 36: Grfico referente s reas de radiolucidez das leses periapicais a partir das imagens
radiogrficas aps o tratamento com diferentes medicaes intracanal.
O grupo controle, com leses de maior tamanho, apresentou diferena estatstica com
a maioria dos grupos, exceto com o grupo das nanopartculas sem o frmaco. Este resultado j
era esperado e reflete o teste in vitro, no qual foram medidos os halos de inibio, as NBR,
assim como o propilenoglicol, no apresentaram ao antimicrobiana contra o E. faecalis e C.
albicans.
Os grupos do gel CL 0,5 %, gel NCL 0,5 % e NCL 0,5 % HCA promoveram maior
reparo da regio periapical, no apresentando diferena estatstica entre si, fornecendo
imagens radiogrficas com leses de menor tamanho.
Quando comparado o grupo do gel CL 0,5 % HCA e o grupo do gel NCL 0,5 % HCA
verificamos que no houve diferena significativa entre o tamanho das leses. Mesmo assim,
possvel observar atravs do grfico que a mdia do tamanho das leses do gel de NCL 0,5
% HCA so menores e tendem a apresentar um resultado mais favorvel, sendo confirmado
pela anlise histolgica, na qual foi possvel observar diferena estatstica. Talvez, o valor de
DP elevado do grupo CL 0,5 % HCA, tenha influenciado de forma negativa no resultado.
Quando comparados os grupos do gel CL 0,5 % e CL 0,5 % HCA podemos observar,
na Figura 38, uma diferena nas mdias do tamanho das leses, mesmo que no significativa,
porm, demonstra uma tendncia da CL associada ao HCA apresentar leses de maior
tamanho, o que tambm observado na literatura com o trabalho de Evans e colaboradores
87
(2003) afirmando que a eficincia antimicrobiana da CL associada ao HCA seria menor que a
CL. A presena da leso maior indicaria uma diminuio da ao antimicrobiana da CL
quando em associao com o HCA devido a uma provvel degradao durante a mistura
causado pelos elevados valores do pH do HCA estudos in vitro nos itens 4.4 e 4.5, e em
trabalhos j realizados por outros autores sobre este processo de degradao, como Zerella e
colaboradores (2005) e Barbin e colaboradores (2008).
J o grupo do gel NCL 0,5 % HCA apresentou valores mdios de tamanho de leso
similares ao grupo do gel NCL; porm, com valores de coeficiente de variao (CV) de 13 %,
enquanto o grupo de NCL apresentou um valor de CV de 28 %. Alm disso, foi possvel
observar a manuteno da ao antimicrobiana da clorexidina independente da sua associao
com HCA apesar dos seus elevados valores de pH. Isso nos faz acreditar que a presena do
invlucro lipdico protegeu a clorexidina deste processo de degradao, novamente
confirmando o que foi visto no estudo in vitro que avaliou a degradao da clorexidina aps
esta associao com seus resultados descritos no item 4.4. e 4.5.
Tambm foi possvel observar que o gel CL 0,5 % HCA no apresentou diferena
estatstica com o HCA. Porm quando o HCA comparado com o gel de NCL 0,5 % HCA
podemos observar diferena estatstica, o que de grande relevncia clnica, podendo estar
relacionado com a uniformidade dos resultados.
4.7.2. Anlise histolgica
A partir da anlise das imagens expressas pelas lminas histolgicas (Figura 37), a
intensidade do infiltrado inflamatrio recebeu escores conforme classificao descrita por
Armada-Dias e colaboradores (2006): ausente (0), discreto (1), moderado (2) ou severo (3).
88
A
Figura 37: Imagens das lminas histolgicas representativas das leses periapicais em ratos aps a
utilizao de medicao intracanal de acordo com cada grupo: (A) Controle; (B) Gel CL 0,5 %; (C) Gel
NCL 0,5 %; (D) Gel NBR; (E) Gel CL 0,5 % HCA; (F) Gel NCL 0,5 % HCA; (G) HCA.
89
Aps a soma dos escores, a anlise estatstica e o resultado da comparao entre os
grupos e suas mdias foram expressos na Figura 38 na forma de grfico.
Escore inflamatrio
4
3
a-d-g
d-e-g
g
e-g
b-c-e-f c-e-f-g
C
A
H
H
+
0,
5
C
L
0,
5
C
A
A
C
+
on
tr
ol
e
C
L
0,
5
N
%
C
L
0,
5
%
B
R
a-b-c-d-e-f-g: os grupos com as letras diferentes apresentaram diferena significativa entre si (p<0,05) de acordo
com o teste de Fisher.
Figura 38: Grfico referente aos escores do infiltrado inflamatrio a partir da anlise histopatolgica
da reao ao tratamento com diferentes medicaes intracanal.
Analisando as lminas histolgicas, podemos observar que os maiores valores de

escores estavam presentes no grupo controle, com presena de infiltrado inflamatrio intenso
e formao de abscesso perirradicular, apresentando diferena significativa com a maioria dos
grupos. Apesar de no haver diferena significativa com o grupo do gel NBR e HCA, no se
observa nestes grupos a formao de abscesso perirradicular, apenas um considervel
infiltrado inflamatrio. Wagner e colaboradores (2011) tambm relataram a presena de
reabsoro ssea periapical com a formao de abscesso aps a anlise das lminas
histolgicas no mesmo grupo controle, confirmando a presena do intenso infiltrado
inflamatrio.
O grupo do gel NCL 0,5 % HCA, seguido do gel de CL e NCL, apresentaram os mais
baixos valores de escores e, no apresentaram diferena estatstica entre si. possvel
observar uma reduo no infiltrado inflamatrio e a presena de reas de neovascularizao,
significando reparo da regio, apesar de no haver neoformao ssea.
90
Observando mais especificamente o grupo CL e NCL, no houve diferena
significativa entre eles tanto na anlise histolgica, como na radiogrfica, no refletindo os
resultados obtidos no teste microbiolgico com os cilindros de ao, no qual foi relatada a
diferena entre os halos de inibio com os menores valores apresentados pelo grupo NCL
num perodo de anlise de 72 h. Provavelmente, este perodo de 72 h ainda no suficiente
para a completa liberao da clorexidina, pois como j descrito, os sistema carreadores
apresentam a caracterstica de liberao lenta e controlada, configurando um tempo
inadequado para a avaliao da ao das nanopartculas.
Quando comparado o grupo gel CL 0,5 % HCA e o grupo gel NCL 0,5 % HCA,
observada uma diferena significativa na presena de infiltrado inflamatrio, refletindo um
maior valor de escores para o grupo na qual a CL no estava em nanopartculas. Isto pode ter
ocorrido devido ao processo de degradao sofrido pela CL frente aos elevados valores de pH
do HCA, confirmando clinicamente o que foi descrito por este trabalho nos estudos in vitro
nos itens 4.4 e 4.5, e em trabalhos j realizados por outros autores sobre este processo de
degradao, como Zerella e colaboradores (2005) e Barbin e colaboradores (2008). Isto nos
leva a crer que no grupo NCL 0,5 % HCA, a CL presente conseguiu atingir todo seu potencial
antimicrobiano j que estava protegida pela nanopartcula lipdica, apresentando assim,
melhores resultados de reparo na regio periapical.
O grupo do gel NBR no apresentou diferena estatstica com o grupo controle, CL
0,5 % HCA e HCA. Este resultado no corrobora os dados do teste microbiolgico utilizando
os cilindros de ao para anlise dos halos de inibio, pois neste teste este grupo no
apresentou nenhuma ao contra E. faecalis e C. albicans. Talvez a reduo da leso seja pelo
processo de instrumentao e irrigao defendido por alguns autores como suficiente para o
reparo da regio apical, alm disso, a composio das NCL poderia reduzir a reao
inflamatria no tecido periapical, permitindo algum tipo de reparo. Esta reduo pode ser
causada pela manteiga de karit que possui emolientes e antioxidantes que podem reduzir o
processo inflamatrio.
O grupo do HCA no apresentou diferena estatstica com o grupo controle, j Wagner
e colaboradores (2011) observaram esta diferena em seu estudo, talvez a presena de maiores
valores de DP neste estudo tenha contribudo para tal resultado, j que os valores da mdia
dos escores apresentam diferena.
Analisando as imagens fornecidas pelo grfico da Figura 39, observamos uma
semelhana grande com o grfico da Figura 37 da anlise radiogrfica. Ao analisarmos a
91
significncia estatstica, podemos verificar que tambm h concordncia na maioria das
comparaes dos resultados entre os grupos. Apenas houve diferena da anlise histolgica e
radiogrfica entre o grupo das nanopartculas lipdicas de clorexidina comparado com o grupo
da clorexidina associada pasta de hidrxido de clcio, onde radiograficamente houve
diferena significante e histologicamente no houve diferena.
Esta semelhana nos induz a acreditar que as imagens radiogrficas representam
claramente o que est acontecendo histologicamente, pois o processo de reparo tecidual pode
ser observado com a neoformao ssea e reparo da regio periapical atravs da diminuio
do tamanho da leso na imagem radiogrfica.
92
5. CONCLUSO
A partir dos objetivos e resultados deste estudo, podemos concluir que:
Foi possvel desenvolver e caracterizar nanopartculas lipdicas slidas contendo

clorexidina de forma satisfatria nas concentraes de 0,2 e 0,5 %.
A adio do gel suspenso de nanopartculas lipdicas slidas contendo clorexidina

no interferiu nas caractersticas e ao antimicrobiana da formulao.
Foi possvel observar a estabilidade das formulaes de nanopartculas lipdicas

contendo clorexidina quando armazenadas em temperatura ambiente e em geladeira.
As amostras armazenadas em estufa sofreram processo de degradao tanto na forma
de suspenso quanto em gel.
A clorexidina livre apresentou-se instvel aps o perodo do teste de estabilidade em

todas as temperaturas avaliadas.
O teste in vitro com o gel de clorexidina 0,5 % associado pasta de hidrxido de

clcio e o gel de nanopartculas lipdicas contendo clorexidina 0,5 % associada pasta
de hidrxido de clcio confirmou o processo de degradao da clorexidina decorrente
do elevado pH da pasta. J a clorexidina nanoencapsulada foi protegida pela camada
de lipdios, amenizando este processo de degradao.
A avaliao por microscopia eletrnica de varredura associada difrao de raio X

confirmou a presena de tomos de cloro na superfcie da estrutura dentinria e,
tambm, no interior dos tbulos dentinrios, sendo um indcio forte da presena de
nanopartculas lipdicas contendo clorexidina sobre na luz do canal, agindo de forma
efetiva como medicao intracanal, j que h penetrao destas para o interior dos
tbulos dentinrios.
Os testes microbiolgicos de difuso em gar revelaram halos de inibio das

nanopartculas lipdicas contendo clorexidina menores que da clorexidina livre, porm,
pode-se comprovar que a ao antimicrobiana da clorexidina no foi afetada pelo
casulo lipdico, pois os valores de concentrao inibitria mnima das nanopartculas e
da forma livre para C. albicans e E. faecalis foram os mesmos. Foi possvel evidenciar
a liberao lenta e gradual da clorexidina presente nas nanopartculas lipdicas
93
contendo clorexidina, aumentando os halos de inibio com o passar do tempo
devendo, por este motivo, ter um tempo de anlise maior.
A avaliao in vivo, em ratos, mostrou radiograficamente e histologicamente o

excelente desempenho do grupo formado pelas nanopartculas lipdicas contendo
clorexidina 0,5 % associadas pasta de hidrxido de clcio, que no apresentou
diferena estatstica em relao ao grupo da clorexidina livre, porm, revelou um
desempenho significativamente superior quando comparado com o grupo da
clorexidina 0,5 % associado pasta de hidrxido de clcio. Assim, podemos observar
que a ao da clorexidina prejudicada pelo elevado pH da pasta de hidrxido de
clcio e quando protegida na forma de nanopartcula, mantm seu desempenho
antimicrobiano, somando a mistura todos os benefcios fornecidos pela pasta de
hidrxido de clcio.
94
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
ABDELBARY, G.; FAHMY, R. H. Dazepam-Loaded Solid Nanoparticles: Design and

Characterization. AAPS PharmSciTech, v. 10, n. 1, march, 2009.
AKISUE, E.; TOMITA, V.S.; GAVINI, G.; FIGUEIREDO, J.A.P. Effect of the combination
of sodium hypochlorite and chlorhexidine on dentinal permeability and scanning electron
microscopy precipitate observation. Journal of Endodontics, v. 36, n. 5, p. 847-850, 2010.
ALHAJ, N. A.; ABDULLAH, R.; IBRAHIM, S.; BUSTAMAM, A. Tamoxifen drug loading
solid lipid nanoparticles prepared by hot high pressure homogenization techniques. American
Journal of Pharmacology & Toxicology, v. 3, n. 3, p. 219-224, 2008.
AMORIM, C.V.G.; AUN, C.E.; MAYER, M.P.A. Susceptibility of some oral

microorganisms to chlorhexidine and paramonochlorophenol. Brazilian Oral Reserch, v.18,
n.3, p.242-246, 2004.
ANDREWS, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal

Antimicrobiology Chemother, v. 48, Suppl.S1,p. 5-16, 2001.
ARMADA-DIAS, L.; BREDA, J.; PROVENZANO, J.C.; BREITENBACH, M.; ROAS, I.

N.; GAHYVA, S.M.M.; SIQUEIRA JUNIOR, J.F. Development of periradicular lesions in
normal and diabetic rats. Journal of Applied Oral Science, v. 14, n. 5, p. 371-375, Oct 2006.
BARBIN, L.E.; GUEDES, D.F.C.; SOUSA-NETO, M.D.; PCORA, J.D. Determination of

para-chloroaniline and reactive oxygen species in chlorhexidine and chlorhexidine associated
with calcium hydroxide. Journal of Endodontics, v. 34, p. 1508-1514, 2008.
BASRANI, B. R.; SANTOS, J. M.; TJADERHANE, L.; GRAD, H.; GORDUYSUS, O.;
HUANG, J.; LAWRENCE, H. P.; FRIEDMAN, S. Substantive antimicrobial activity in
chlorhexidine-treated human root dentin. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology,
Oral Radiology and Endodontics, v. 94, p. 240-245, 2002.
BASRANI, B. R.; TJADERHANE, L.; SANTOS, J. M.; PASCON, E.; GRAD, H.;
LAWRENCE, H. P.; FRIEDMAN, S. Efficacy of chlorhexidine and calcium hydroxidecontaining medicaments against Enterococcus faecalis in vitro. Oral Surgery, Oral
Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontics, v. 96, p. 618-624, 2003.
95
BASRANI, B.R.; GHANEM, A.; TJADERHANE, L. Physical and chemical properties of
chlorhexidine and calcium hydroxide-containing medications. Journal of Endodontics, v.
30, p. 413-7. 2004.
BASRANI, B. R.; MANEK, S.; SODHI, R.N.S.; FILLERY, E.; MANZUR, A. et al.
Interaction between Sodium Hypochlorite and Chlorhexidine Gluconate. Journal of
Endodontics, v. 33, n. 8, p. 966-969, August 2007.
BHASKAR, S.N. Histologia e Embriologia Oral de Orban. So Paulo: Artes Mdicas;1989.

BARBIN, L.E.; GUEDES, D.F.C.; SOUSA-NETO, M.D.; PCORA, J.D. Determination of
para-chloroaniline and reactive oxygen species in chlorhexidine and chlorhexidine associated
with calcium hydroxide. Journal of Endodontics, v. 34, n.12, p. 1508-14, 2008.
BONESVOLL, P.; LOKKEN, P.; ROLLA, G.; PAUS, P.N. Retention of chlorhexidine in the
human oral cavity after mouth rinses. Archives of Oral Biology, v. 19, p. 209-212, 1974.
BOUILLAGUET, S.; WATAHA, J.C.; TAY, F.R.; BRACKETT, M.G.; LOCKWOOD, P.E.
Initial in vitro biological response to contemporary endodontic sealers. Journal of
Endodontics, v.32, n.10, p.989-92, 2006.
BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Guia para

validacao de mtodos analticos e bioanalticos. Braslia, DF, 2003.
BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Guia para a

realizacao de estudos de estabilidade. Braslia, DF, 2005.
BUNJES, H.; WESTESEN, K.; KOCH, M. H. J. Crystallization tendency and polymorphic

transitions in triglyceride nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics, n. 129, p.
159-173, 1996.
CHIAPETTA, S. C.; OLIVEIRA, , C. B. de; OLIVIER, B. C.; MERCANTE, L. A. M.;

NETTO, A. D. P. Determinacao simultana de cloreto de benzalcnio, digluconato de
clorexidina e triclosan por CLAE-UV-DAD. 31 Reuniao Annual da Sociedade Brasileira
de Qumica, p. 1740. http://sec.sbq.org.br/cdrom/31ra/resumos/T1740-2.pdf. Acessado em
abril de 2011.
CHONG, B. S.; PITT FORD, T. R. The role of intracanal medication in root canal treatment.
International Endodontic Journal, v. 25, p. 97-106, 1992.
96
COHEN, S.; BURNS, R. C. Caminhos da polpa. Ed. Guanabara Koogan S.A., Rio de
Janeiro, 70 edio,1998.
DA SILVA, R. A. B.; LEONARDO, M. R.; DA SILVA, L. A. B.; FACCIOLI, L. H.;

MEDEIROS, A. I. de. Effect of a calcium hydroxide based paste associated to chlorhexidine
on RAW 264.7 macrophage cell line culture. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral
Pathology, Oral Radiology and Endodontics, v. 106, p. e44-e51, 2008.
DAVIES, A. The mode of action of chlorhexidine. Journal of Periodontal Research, v. 8,

suppl.12, p. 68-75, 1973.
DELANY, G. M.; PATTERSON, S. S.; MILLER, C. H.; NEWTON, C.W. The effect of
chlorhexidine gluconate irrigation on the root canal flora of freshly extracted necrotic teeth.
Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, v. 53, n. 5, p. 518-523, May 1982.
DELGADO, R.J.R.; PINHEIRO, C.R.; BRAMANTE, C.M.; BERNARDINELI, N.

Antimicrobial effects of calcium hydroxide and chlorhexidine on Enterococcus faecalis.
Journal of Endodontics, v.36, n.8, p.1389-93, 2010.
DENTON, G. W. Chlorhexidine. Philadelphia: Block SS; p. 276-277, 1991.
DEWSNUP, N.; PILEGGI, R.; HADDIX, J.; NAIR, U.; WALKER, C.; VARELLA, C.H.
Comparison of bacterial reduction in straight and curved canals using erbium, chromium:
yttrium-scandium-gallium-garnet laser treatment versus a traditional irrigation technique with
sodium hypochlorite. Journal of Endodontics, v.36, n.4, p.725-728, 2010.
ERCAN, E.; DALLI, M.; DULGERGIL, . T. In vitro assessment of the effectiveness of

chlorhexidine gel and calcium hydroxide paste with chlorhexidine against Enterococcus
faecalis e Candida albicans. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral
Radiology and Endodontics, v. 102, p. e27-e3, 2006.
ERCAN, E., DALLI, M., DULGERGIL, C. T.; YAMAN, F. Effect of intracanal medication
with calcium hydroxide and 1% chlorhexidine in endodontic retreatment cases with periapical
lesion: an in vivo study. Journal of the Formosan Medical Association, v. 106, p. 21724,
2007.
ESTRELA, C.; SYDNEY, G. B.; BAMMANN, L. L.; FELIPE JNIOR, O. Mechanism of

action of calcium and hydroxyl ions of calcium hydroxide on tissue and bacteria. Brazilian
Dental Journal, v. 6, n. 2, p. 85-90, 1995.
97
ESTRELA, C.; PIMENTA, F. C.; ITO, I. Y.; BAMMANN, L. L. Antimicrobial evaluation of
calcium hydroxide in infected dentinal tubules. Journal of Endodontics, v. 25, n. 6, p. 416-8,
June 1999.
ESTRELA, C.; BAMMANN, L. L.; PIMENTA, F. C.; PCORA, J. D. Control of

microorganisms in vitro by calcium hydroxide pastes. International Endodontic Journal, v.
34, p. 341-345, 2001.
ESTRELA, C.; ESTRELA, C.R.deA.; PCORA, J.D. A study of the time necessary for
calcium hydroxide to eliminate microorganisms in infected canals. J Appl Oral Sci, v.11,
n.2, p.133-137.
EVANS, M. D.; BAUNGARTNER, J . C.; KHEMALEE-LAKUL, S.; XIA, T. Efficacy of

calcium hydroxide: chlorhexidine paste as an intracanal medication in bovine dentin. Journal
of Endodontics, v. 29, n. 5, p. 338-9, 2003.
FARIA, G.; CELES, M. R. N.; ROSSI, A. De; SILVA, L. A. B.; SILVA, J. S.; ROSSI, M. A.
Evaluation of Chlorhexidine Toxicity Injected in the Paw of Mice and Added to Cultured
L929 Fibroblasts. Journal of Endodontics, v.23, n.6, p.715-722, June 2007.
FARMACOPIA BRASILEIRA. 4 ed., v.1. So Paulo: Editor Ateneu, 1988.
FAVA, L.R.G.; SAUNDERS, W.P. Calcium hydroxide pastes: classification and clinical
indications. International Endodontic Journal, v.32, p.257-282, 1999.
FERRAZ, C. C.; GOMES, B. P.; ZAIA, A. A.; TEIXEIRA, F. B.; SOUZA-FILHO, F. J. In

vitro assessment of the antimicrobial action and the mechanical ability of chlorhexidine gel as
an endodontic irrigant. Journal of Endodontics, v.27, n.7, p.452-455, 2001.
FESSI, H.; PUISIEUX, F.; DEVISSAGUET, J-PH.; AMMOURY, N.; BENITA, S.

International Journal of Pharmaceutics, p.55, r1, 1989.
GOMES, B. P. F. A.; FERRAZ, C. C. R.; VIANNA, M. E.; BERBER, V. B.; TEIXEIRA, F.

B.; SOUZA-FILHO, F. J. In vitro antimicrobial activity of several cancentrations of sodium
hypochorite and chlorhexidine gluconate in the elimination of Enterococcus faecalis.
International Endodontic Journal, v.34, p.424-428, 2001
98
GOMES, B. P. F. A.; SAUZA, S. F. C.; FERRAZ, C. C. R.; TEIXEIRA, F. B.; ZAIA, A.
A.;VALDRIGHI, L.; SOUZA-FILHO, F.J. Effectiveness of 2% chlorhexidine gel and
calcium hydroxide against enterococcus faecalis in bovine root dentine In vitro.
International Endodontic Journal, v.36, p.267-275,2003.
GOMES, B. P. F. A.; VIANNA, M. E.; SENA, N. T.; ZAIA, A. A.; FERRAZ, C. C. R.;
SOUZA-FILHO, F. J. In vitro evaluation of the antimicrobial activity of calcium hydroxide
combined with chlorhexidine gel used as intracanal medicament. Oral Surgery, Oral
Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontics, v.102, n.4, Oct 2006.
GOMES-FILHO, J.E.; SILVA, F.O.; WATANABE, S.; CINTRA, L.T.A.; TENDORO, K.V.;
DALTO, L.G.; PACANARO, S.V.; LODI, C.S.; MELO, F.F.F. de. Tissue reaction to silver
nanoparticles dispersion as an alternative irrigating solution. Journal of Endodontics, v.36,
n.10, p.1698-1702, 2010.
GROSSI, S. G.; SKREPCINSKI, F. B.; DE CARO, T.; ROBERTSON, D. C.; HO, A. W.;
DUNFORD, R. G., et al. Treatment of periodontal disease in diabetics reduces glycated
hemoglobin. Journal of Periodontology, v. 68, n. 8, p.713-19, aug. 1997.
GUTERRES, S.S.; FESSI, H.; BARRATT, G.; DEVISSAGUET, J-PH.; PUISIEUX, F. Poly
(DL-lactide) nanocapsules containing diclofenac: I. Formulation and stability study.
International Journal of Pharmaceutics. V.113, p.57-63, 1995.
HALL, S.S.; MITRAGOTRI, S.; DAUGHERTY, P.S. Identification of peptide ligands

facilitating nanoparticle attachment to erythrocytes. Biotechnology Progress., v.23, n.3,
p.749-754, 2007.
HAAPASALO, M.; ORSTAVIK, D. In vitro infection and disinfection of dentinal tubules.

Journal of Dentistic Research, v.66, n.8, p. 1375-1379, August, 1987.
HELING, M.; STEINBERG, D.; KENIG, S.; GAVRILOVICH, I.; SELA, M. N.;
FRIEDMAN, M. Efficacy of a sustained-release device containing chlorhexidine and Ca
(OH)2 in preventing secondary infection of dentinal tubules. International Endodontic
Journal, v.25, p.20-24, 1992.
HENNESSEY, T. D. Some antibacterial properties os chlorhexidine. Journal of Periodontal

Research, v.8, n.s12, p.61-67, Dec 1973.
HOLLAND, R; SOARES, I. J.; SOARES, I. M. Influence of irrigation and intracanal dressing
on the healing processo f dogs teeth with apical periodontitis. Endodontics & Dental
Traumatology, v.8, p.223-229, 1992.
99
HU, F. Q.; JIANG, S. P.; DU, Y. Z.; YUAN, H. YE, Y. Q.; ZENG, S. Preparation and
characteristics of monostearin nanostructured lipid carriers. International Journal of
Pharmaceutics, n.314, p.83-89, 2006.
HUYNH, T.T.N.; PADOIS, K.; SONVICO, F.; ROSSI, A.; ZANI, F.; PIROT, F.; DOURY,
J.; FALSON, F. Characterization of a polyurethane-bad controlled release system for local
delivery of chlorhexidine diacetate. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics, n.74, p.255-264, 2010.
IARC. The evaluation of carcinogenic risks to humans. IARC Monographs, v.57, p.43,
1997b. Disponvel em http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol57/volume57.pdf.
Acessado em agosto de 2010.
IWAMA, A.; NISHIGAKI, N.; NAKAMURA, K.; IMAIZUMI, I.; SHIBATA, N.;
YAMASAKI, M.; NAKAMURA, H.; KAMEYAMA, Y.; KAPILA, Y. The effect of high
sugar intake on the development of periradicular lesions in rats with type 2 diabetes. Journal
of Dental Research, v.82, n.4, p.322-325, Apr 2003.
JEANSONNE, M. J.; WHITE, R. R. A comparison of 2% chlorhexidine gluconate and 5,25%

sodium hipochlorite as antimicrobial endodontic irrigants. Journal of Endodontics, v. 20, p.
276-8, 1994.
KAYAOGLU, G.; OMURLU, H.; AKCA, G.; GUREL, M.; GENAY, O.; SORKUN, K.;
SALIH, B. Antibacterial activity of propolis versus conventional endodontic disinfectants
against Enterococcus faecalis in infected dentinal tubules. Journal of Endodontics, v.37,
p.376-381, 2011.
KHOEE, S., YAGHOOBIAN, M. An investigation into the role of surfactants in controlling

particle size of polymeric nanocapsules containing penicillin-G in double emulsion.
European Journal of Medicinal Chemistry, v. 44, n. 6, p.2392-99, 2009.
KISHEN, A.; SHI, Z.; SHRESTHA, A.; NEOH, K.G. An investigation on the antibacterial
and antibiofilm efficacy of cationic nanoparticulates for root canal disinfection. Journal of
Endodontics, v.34, n.12, p.1515-20, 2008.
KRITHIKADATTA, J.; INDIRA, R.; DOROTHYKALYANI, A. L. Disinfection of dentinal

tubules with 2% chlorhexidine, 2% metronidazole, bioactive glass when compared with
calcium hydroxide as intracanal medicaments. Journal of Endodontics, v.33, p.1473-1476,
2007.
100
LANDER, R.; MANGER, W.; SCOULOUDIS, M.; KU, A.; DAVIS, O.; LEE, A. Gaulin
homogenization: A mechanistic study. Biotechnology Progress, n.16, p.80-85, 2000.
LBOUTOUNNE, H., CHAULET, J. F., PLOTON, C., FALSON, F., PIROT, F. Sustained
exvivo skin antiseptic activity of chlorhexidine in poly(epsilon-caprolactone) nanocpsula
encapsulated form and as a digluconate. Journal of Controlled Release, v.82, p.319334,
2002.
LEE, Y; HAN,S.H.; HONG, S.; LEE, J.; JI, H.; KUM, K. Antimicrobial efficacy of a
polymeric chlorhexidine release device using in vitro model of Enterococcus faecalis dentinal
tubule infection. Journal of Endodontics, v.34, n.7, p.855-858, 2008.
LEONARDO, M. R.; TANOMARU FILHO, M.; SILVA, L. A. B.; NELSON FILHO, P.;
BONIFCIO, K. C.; ITO, I. Y. In vivo antimicrobial activity of 2%chlorhexidine used as root
canal irrigating solution. Journal of Endodontics, v.3, p.167-171, 1999.
LEONARDO, M. R. Endodontia: tratamento de canais radiculares. Princpios tcnicos e

biolgicos. So Paulo: Artes Mdicas, 2008.
LIN, L. M.; PASCON, E.A.; SKRIBNER, J.; GANGLER, P.; LANGELAND, K. Clinical,
radiographic, and histologic study of endodontic treatment failures. Oral Surgery, Oral
Medicine, and Oral Pathology, v. 71, n.5, p.603-11, 1991.
LIPPACHER, A.; MULLER, R. H.; MADER, K. Semisolid SLN dispersions for topical
application: Influence of formulation and production parameters on viscoelstic properties.
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. n.53, p.155-160, 2002.
LIPPACHER, A.; MULLER, R. H.; MADER, K. Liquid and semisolid SLN dispersions for
topical application: Rheological characterization. European Journal of Pharmaceutics and
LOPES, H. P.; SIQUEIRA JR, J. F. Endodontia: Biologia e Tcnica. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan; 2004.
LOVE, R.M. Regional variation in root dentinal tubule infection by streptococcus gordonii.
Journal of Endodontics, v.22, n.6, p.290,1996.
101
LOFTI, M.; VOSOUGHHOSSEINI, S.; RANJKESH, B.; KHANI, S.; SAGHIRI, M.; ZAND,
V. Antimicrobial efficacy of nanosilver, sodium hypochlorite and chlorhexidine gluconato
against Enterococcus faecalis. African Journal of Biotechnology, v.10, n.35, p.6799-6803,
2011.
LUO, Y.; CHEN, D.; REN, R.; ZHAO, X.; QIN, J. Solid lipid nanoparticles for enhancing
vinpocetines oral bioavailability. v.114, pag. 53-59, 2006.
MARSHALL, J.R.G.W.; MARSHALL, S.J.; KINNEY, J.H.; BALOOCH, M. The dentin

substrate: structure and properties related to bonding. Journal of Dentistry, v.25, p.441-58,
1997.
MEHNERT, W.; MADER, K.; Solid lipid nanoparticles: Production, characterization and
applications. Advanced Drug Delivery Reviews. n.47, p.165-196, 2001.
MENG, N.; ZHOU, N.L.; ZHANG, S.Q.; SHEN, J. Controlled release and antibacterial
activity chlorhexidine acetate /CA) intercalated in montmorillonite. International Journal of
Pharmaceutics, v. 382, p.45-49, 2009.
MILLER, T.A.; BAUMGARTNER, J.C. Comparison of the antimicrobial efficacy of

irrigation using the endovac to endodontic needle delivery. Journal of Enodontics, v.36, n.3,
p.509511, 2010.
MULLER, R. H.; MADER, K.; GOHLA, S. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled
drug delivery a review of the state of the art. European Journal of Pharmaceutics and
MULLER, R. H.; RADTKE, M.; WISSING, S. A. Solid lipid nanoparticles (SLN) and
nanostructured lipid carriers (NLC) in cosmetic and dermatological preparations. Advanced
Drug Delivery Reviews, n.54, suppl. 1, p.131-155, 2002.
MULLER, R. H.; PETERSEN, R. D.; HOMMOSS, A.; JARDEIKE, J. Nanostructured lipid

carriers (NLC) in cosmetic dermal products. Advanced Drug Delivery Reviews, n.59, p.522530, 2007.
MUSIAL, W.; KOKOL, V.; VONCINA, B. Deposition and release of chlorhexidine from
non-ionic and anionic polymer matrices. Chemical Papers, v.64, n.3, p.346-353, 2010.
102
NERWICH, A.; FIGDOR, D.; MESSER, H.H. pH changes in root dentin over a 4-week
period following root canal dressing with calcium hydroxide. Journal of Endodontics, v.19,
p.302-206, 1993.
NHUNG, D. T. T.; FREYDIERE, A. M.; CONSTANT, H.; FALSON, F.; PIROT, F.

Sustained antibacterial effect of a hand rub gel incorporating chlorhexidine-loaded
nanocpsulas (Nanoclhorex). International Journal of Pharmaceutics, v.334, p.166172,
2007.
PAGONIS, T.C.; CHEN, J.; FONTANA, C.R.; DEVALAPALLY, H.; RUGGIERO, K.;
SONG, X.; FOSCHI, F.; DUNHAM, J.; SKOBE, Z.; YAMAZAKI, H.; KENT, R.;
TANNER, A.C.R.; AMIJI, M.M.; SOUKOS, N.S. Nanoparticle-based endodontic
antimicrobial photodynamic therapy. Journal of Endodontics, v. 36, p. 322-328, 2010.
PALLOTTA, R.C.; RIBEIRO, M.S.; MACHADO, M.E.L.; Determination of the minimum

inhibitory concentration of four medicaments used as intracanal medication. Australian
Endodontic Journal, n.33, p.107-111, 2007.
PAQUETTE, L.; LEGNER, M.; FILLERY, E. D.; FRIEDMAN, S. Antibacterial efficacy of

chlorhexidine gluconate intracanal medication in vivo. Journal of Endodontics, v.33, n.7,
p.788-795, 2007.
PARSONS, G. J.; PATTERSON, S. S.; MILLER, C. H.; KATZ, S.; KAFRAWY, A. H.;
NEWTON, C. W. Uptake and release of chlorhexidine by bvine pulp and dentin speciments
and their subsequent acquisition of antibacterial properties. Oral Surgery, Oral Medicine,
Oral Pathology, v.49, p.455-459, 1980.
PEREZ, F., ROCHD, T., LODTER, J. P. in vitro study of penetration of three bacterial strains
into root dentine. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, v. 76, p.97-103, 1993.
PINHEIRO, C.R.; GUINESI, A.S.; CAMARGO, E.J.; PIZZOLITTO, A.C.; FILHO, I.B.
Bacterial leakage evaluation of root canals filled with different endodontic sealers. Oral
Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, v.108,
n.6, p.56-60, 2009.
PRADO, M. J. V.; OLIVEIRA, R. C.; FERREIRA, R. S. F.; VIEIRA, R. C. P. A.; PINHO, J.

J. R. G. A retirada do timerosal do mercado farmacutico e sua substituio pelos derivados
de amnio quartenrio: avaliao do risco/benefcio. Lecta, v.22, n.1/2, p.37-47, Jan/Dez
2004.
103
PUBCHEM. Pubchem substance database. 2008. http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/.
Acessado em agosto de 2010.
RICUCCI, D.; SIQUEIRA JR, J.F.; BATE, A.L.; FORD, T.R.P. Histologic investigation of
root canaltreated teeth with apical periodontitis: a retrospective study from twenty-four
patients. Journal of Endodontics, v.35, n.4, p.493-502, 2009.
RINGEL, A. M.; PATTERSON, S. S.; NEWTON, C. W.; MILLER, C. H.; MULHERN, J.

M. In vitro evaluation of chlorhexidine gluconate solution and sodium hypochlorite salution
as root canal irrigants. Journal of Endodontics, v.8, p.200-204, 1982.
RUSSEL, A.D.; DAY, M.J. Antibacterial activity of chlorhexidine. Journal of Hopital

Infection, v.25, p.229-238, 1993.
SCHAFER, E.; BOSSMANN, K. Antimicrobial efficacy of chlorhexidine and two calcium

hydroxide formulations against Enterococcus faecalis. Journal of Endodontics, v.31, n.1,
p.53-56, 2005.
SCHAFFAZICK, S. R.; GUTERRES, S.; FREITAS, L.; POHLMANN, A. Caracterizao e

estabilidade fsico-qumica de sistemas polimricos nanoparticulados para administrao de
frmacos. Qumica Nova, v. 26, n. 5, p. 726-737, 2003.
SCHILKE, R; LISSON, J. A.; BAUB, O.; GEURTSEN, W. Comparison of the number and
diameter of dentinal tubules in human and bovine dentine by scanning electron microscopic
investigation. Archs Oral Biol, v.25, p.355-61, 2000.
SCHLAFER, S.; VAETH, M.; HORSTED-BINDSLEV, P.; FRANDSEN, E.V.G. Endodontic

photoactivated disinfection using a conventional light source: an in vitro and ex vivo study.
Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology,
v.109, n.4, p.634-641, 2010.
SEN, B.H.; WESSELINK, P.R.; TURKUN, M. The smear layer: a phenomenon in root canal
therapy. International Endodontic Journal, v.28, n.3, p.141, 1995.
SEN, B. H.; SAFAVI, K. E.; SPANGBERG, L. S. W. Antifugal effects os sodium hypoclorite

and chlorhexidine in root canals. Journal of Endodontics, v.24, n.4, p.235-238, 1999.
SIEKMANN, B.; WESTESEN, K. Melt-homogenized solid lipid nanoparticles stabilized by

the nontonic surfactant tyloxapol 1. Preparation and particle size determination. Pharm
Pharmacol Lett. n.3, p.194-197, 1994.
104
SIGNORETTI, F. G. C.; GOMES, B. P. F. de A.; MONTAGNER, F.; TOSELLO, F. B.;
JACINTO, R. C. Influence of 2% chlorhexidine gel on calcium hydroxide ionic dissociation
and its ability of reducing endotoxina. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral
Radiology, and Endodontology, v.111, n.5, p.653-658, 2011.
SINGLA, M.; AGGARWAL, V.; LOGANI, A.; SHAH, N. Comparative evaluation of rotary
ProTaper, Profile, and conventional stepback technique on reduction in Enterococcus faecalis
colony-forming units and vertical root fracture resistance of root canals. Oral Surgery, Oral
Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, v.109, n.4, p.105-110,
2010.
SIQUEIRA Jr., J. F.; UZEDA, M.; FONSECA, M. E. A scanning electron microscopic

evaluation of in vitro dentinal tubules penetration by selected anaerobic bacteria. Journal of
Endodontics, v. 22, p.308-10, 1996.
SIQUEIRA, J. F.; UZEDA, M. Intracanal medicaments: evaluation of the antibacterial effects

of chlorhexidine, metronidazole, and calcium hydroxide associated with three vehicles.
Journal of Endodontics, v.23, n.3, p.167-169, 1997.
SIQUEIRA JR, J.F.; SEN, B.H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral
Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, v.97, n.5, p.632-41, 2004.
SIQUEIRA JR, J.F.; GUIMARES-PINTO, T; RAS, A.N. Effects of chemomechanical

preparation with 2.5% sodium hypochlorite and intracanal medication with calcium hydroxide
on cultivable bacteria in infected root canals. Journal of Endodontics, v.33, n.7, p.800-805,
2007.
SIRN, E. K.; HAAPSALO, M.P.P; WALTIMO, T. M. T.; ORSTAVIK, D. In vitro

antibacterial effect of calcium hydroxide combined with chlorhexidine or iodine potassium
iodide on Enterococcus faecalis. European Journal of Oral Science, v.112, p. 326-31, 2004.
SJOGREN, U.; HAGGLUND, B.; SUNDQVIST, G; WING, K. Factors affecting the longterm results of endodontic treatment. Journal of Endodontics, v.16, p.498-504, 1990.
SJOGREN, U.; FIGDOR, D.; SPANGBERG, L.; SUNDQVIST, G. The antimicrobial effect
of calcium hydroxide as a short-term intracanal dressing. International Endodontic Journal,
v.24, n.3, p.119-125, May 1991.
105
SOARES, J. A.; LEONARDO, M. R.; TANOMARU FILHO, M.; SILVA, L. A. B.; ITO, I.
Y. Effect of rotary instrumentation and of the association of calcium hydroxide and
chlorhexidine on the antisepsis of the root canal system in dogs. Brazilian Oral Research,
v.20, n.2, p.120-126, 2006.
SOARES, J. A.; LEONARDO, M. R.; TANOMARU FILHO, M.; SILVA, L. A. B.; ITO, I.
Y. Residual antibacterial activity of chlorhexidine digluconate and camphorated pmonochlorophenol in calcium hydroxide-based root canal dressings. Brazilian Dental
Journal, v.18, n.1, p.8-15, 2007.
TAKAHASHI, G.; HOSOYA, N.; TAKIZAWA, H.; NAKAMURA, J. Periapical

environment after applying Ca(OH)2 into root canals in vitro. Journal of Dental Research,
p.52, 1996.
TANOMARU FILHO, M.; LEONARDO, M. R.; SILVA, L. A. B.; ANIBAL, E. F.;

FACCIOLI, L, H. Inflammatory response to different endodontic irrigating solutions.
International Endodontic Journal, v.35, p.735-739, 2002.
TANOMARU, J. M. G.; LEONARDO, M. R.; TANOMARU FILHO, M.; BONETTI FILHO,

I.; SILVA, L. A. B. Effect of different irrigation solutions and calcium hydroxide on bacterial
LPS. International Endodontic Journal, v.36, n.11, p.733-739, Nov 2003.
TEIXEIRA, Z. Potencial Zeta. Disponvel em: www.nanobiotec.iqm.unicamp.br/download/

Aula12-09-%20zeta.ppt. Acessado em setembro de 2011.
TROPE, M.; DELANO, E. O; ORSTAVIK, D. Endodontic treatment of teeth with apical

periodontitis: single vs. multisite treatment. Journal of Endodontics, v.25, p.345-350, 1999.
TROPE, M.; BERGENHOLTZ, G. Microbiological basis for endodontic treatment: can a

maximal outcome be achieved in one visit. Endodontic Topics, v.1, p.40-53, 2002.
TURK, B.T.; ATES, M.; SEN, B.H. The effect of treatment of radicular dentin on
colonization patterns of Candida albicans. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology,
Oral Radiology, and Endodontology, v.106, n.3, p.457-62, 2008.
TURK, B.T.; SEN, B.H.; OZTURK, T. In vitro antimicrobial activity of calcium hydroxide
mixed with different vehicles against Enterococcus faecalis and Candida albicans. Oral
Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, v.108,
n.2, p.297-301, 2009.
106
VAGHELA, D.J.; KANDASWAMY, D.; VENKATESHBABU, N.; JAMINI, N.; ARATHI,
G. Disinfection of dentinal tubules with two different formulations of calcium hydroxide as
compared to 2% chlorhexidine: As intracanal mnedicaments against Enteroccoccus faecalis
and Candida albicans: An in vitro study. Journal of Conservative Dentistry, v.14, n.2,
p.182-186, 2011.
VALERA, M.C.; MAEKAWA, L.E.; OLIVEIRA, L.D.; CARVALHO, C.A.T.; KOGA-ITO,

C.Y.; JORGE, A.O.C. Avaliacao da solucao de clorexidina 2 % e medicamentos sobre
Escherichia coli e sua endotoxina em canais radiculares. Brasilian Dental Science, v.12, n.3,
p.38-43, 2009.
VIANNA, M. E.; GOMES, B. P. F. A.; BERBER, V. B.; ZAIA, A. A.; FERRAZ, C. C. R.;
SOUZA-FILHO, F. J. In vitro evaluation of the antimicrobial activity of chlorhexidine and
sodium hypochlorite. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and
Endodontics, v.97, n.1, p.79-84, 2004.
VIANNA, M. E.; HORZ, H. P.; CONRADS, G.; ZAIA, A. A.; SOUZA-FILHO, F. J.;
GOMES, B. P. F. A. Effect of root canal procedures on endotoxins and endodontic pathogens.
Oral Microbiology and Immunology, v.22, p.411-418, 2007.
WALTIMO, T. M. T.; ORSTAVIK, D.; SIRN, E. K.; HAAPASALO, M. P. P. In vitro

susceptibility of Candida albicans to four disinfectants and their combinations. International
Endodontic Journal, v.32, p.421-429, 1999.
WAGNER, C.; BARTH JR, V.C.; OLIVEIRA, S.D.de; CAMPOS, M.M. Effectiness of the
proton pump inhibitor omeprazole associated with calcium hydroxide as intracanal
medication: an in vivo study. Journal of Endodontics, v.37, p.1253-1257, 2011.
WOLLE, C.F.B.; ZOLLMANN, L.deA.; ETGES, A.; VITALIS, G.S.; LEITE, C.E.;
CAMPOS, M.M. Effects of the antioxidant agent tempol on periapical lesions in rats with
doxorubicin-induced cardiomyopathy. Journal of Endodontics, v.38, p.191-195, 2012.
YEUNG, S.Y.; HUANG, C.S.; CHAN, C.P.; LIN, C.P.; LIN, H.N.; LEE, P.H.; JIA, H.W.;
HUANG, S.K.; JENG, J.H.; CHANG, M.C. Antioxidant and pro-oxidant properties of
chlorhexidine and its interaction with calcium hydroxide solutions. International
Endodontic Journal, v.40, n.11, p. 837-844,2007.
ZAMANY, A.; SAFAVI, K.; SPANGBERG, L. S. The effect of chlorhexidine as an

endodontic disinfectant. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology
and Endodontics, v.96, n.5, p.578-581, 2003.
107
ZEHNDER, M. Root canal irrigants. Journal of Endodontics, v.32, n.5, p.389-398, 2006.
ZERELLA, J.A.; FOUAD, A.F.; SPANGBERG, L.S.W. Effectiveness of a calcium hydroxide

and chlorhexidine digluconato mixture as disinfectant during retreatment of failed endodontic
cases. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontics,
v.100, p.756-761, 2005.
108
ANEXOS
ANEXO 1 Validao da metodologia analtica para doseamento da clorexidina nas

suspenses e gis de nanopartculas.
1. Especificidade
a capacidade que o mtodo possui de medir exatamente um composto em presena

de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradao e componentes da
matriz. Nos mtodos cromatogrficos, precaues necessrias para garantir a pureza dos picos
devem ser levadas em considerao (ANVISA, 2003).
Neste estudo, como mtodo de garantir a pureza do pico, amostras de nanopartculas
sem o frmaco foram injetadas no CLAE, assim como a pasta de hidrxido de clcio pura,
confrontando os cromatogramas expressos pelos pontos da curva analtica, como mostra a
Figura 39.
Podemos observar que no h presena de picos na suspenso sem o frmaco e nem na
pasta de hidrxido de clcio, o que nos faz verificar que nenhum componente que faz parte
das suas composies est interferindo na formao do pico presente na amostra padro.
Figura 39: Sobreposio de cromatogramas: linha azul correspondente a nanopartcula lipdica sem a
presena de frmaco; linha preta correspondente ao hidrxido de clcio e linha vermelha correspondente
amostra padro de clorexidina.
109
O cromatograma exibe um pico em 3,3 minutos, aps anlise da amostra de
clorexidina, o que representa que 3,3 minutos o tempo de reteno da clorexidina e ser
utilizado para determinao da presena de clorexidina nas amostras de suspenses e gis.
2. Linearidade
Para a construo da curva analtica, foi pesado o equivalente a 0,01 g de clorexidina,

o qual foi colocado em um balo volumtrico de 10 mL, sendo o volume completado com
acetonitrila (1 mg/mL). A partir desta soluo me, a curva analtica foi construda nas
concentraes de 10, 15, 20, 25 e 30 g/mL, utilizando-se fase mvel como solvente.
Aps as diluies, as amostras foram filtradas com uma membrana de 0,45 m
Chromafil Xtra RC-45/25 (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Alemanha) e
analisadas em CLAE.
O procedimento foi feito em triplicata. As reas mdias, correspondentes a trs
determinaes para cada concentrao de clorexidina, foram plotadas no eixo das ordenadas e
as concentraes (g/mL), no eixo das abscissas, e a curva ento obtida.
Como possvel visualizar no grfico da Figura 40, a curva padro da clorexidina
apresentou regresso linear significativa (p<0,05), no havendo desvio significativo de
linearidade (p>0,05). A equao da reta para o mtodo foi: y = 82,38x + 28,962; onde x a
concentrao em g/mL e y a rea, apresentando um coeficiente de correlao de 0,9963.
Os parmetros de validao determinados apresentaram linearidade, exibindo um
coeficiente de correlao superior aos limites preconizados de 0,99. Isto permite uma
estimativa da qualidade da curva analtica obtida, sendo que quanto mais prximo de 1,0,
menor a disperso do conjunto de pontos experimentais (ANVISA, 2003a).
Esta curva foi utilizada para realizar o doseamento da clorexidina nas suspenses e
gis contendo o frmaco na forma livre ou nanoestruturada.
rea
110
Concentrao (g/mL)
Figura 40: Curva padro da clorexidina obtida por CLAE.
3. Preciso e repetibilidade
A preciso do mtodo foi avaliada atravs do desvio padro relativo (DPR) obtido pela
determinao da clorexidina na suspenso contendo nanopartculas lipdicas a 0,5 %,
avaliando-se a repetibilidade e a preciso intermediria do mtodo.
A repetibilidade do mtodo foi obtida atravs de seis repeties, na concentrao de
trabalho de 10 g/mL, no mesmo dia e nas mesmas condies experimentais. Porm, a
preciso intermediria foi avaliada em trs dias e por dois analistas diferentes. Preciso
definida como a avaliao da proximidade dos resultados obtidos, em uma srie de medidas,
de uma amostragem mltipla de uma mesma amostra e avaliada em trs nveis: a
repetibilidade, preciso intermediria e reprodutibilidade (ANVISA, 2003).
Segundo a ANVISA (2003), a repetibilidade (preciso intra-corrida) a concordncia
entre os resultados dentro de um curto perodo de tempo com o mesmo analista e mesma
instrumentao. A preciso intermediria (preciso inter-corridas) a concordncia entre os
resultados do mesmo laboratrio, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes
e/ou equipamentos diferentes. A reprodutibilidade (preciso inter-laboratorial) a
concordncia entre os resultados obtidos em laboratrios diferentes e no foi realizada neste
estudo.
A preciso de um mtodo analtico pode ser expressa como desvio padro relativo
(DPR) ou coeficiente de variao (CV %) de uma srie de medidas, no se admitindo valores
superiores a 5 % (ANVISA, 2003).
111
O resultado do DPR da repetibilidade foi de 2,8 + 0,3 % e da preciso intermediria de
2,2 + 0,4 %, valores estes inferiores a 5 %, podendo ser considerado um mtodo preciso.
4. Exatido
Para o teste de exatido, a soluo padro foi adicionada a amostra de forma a se obter
trs concentraes finais diferentes. Para isso, 0,01 g de clorexidina foram colocados em um
balo volumtrico de 10 mL e seu volume foi completado com acetonitrila para obteno de
uma soluo padro de concentrao de 1 mg/mL.
Em trs bales volumtricos diferentes, de 10 mL cada, foram colocados 20 L da
suspenso de nanopartcula lipdica a 0,5% de clorexidina, mais 50 L da suspenso me no
balo 1, 100 L no balo 2 e 150 L no balo 3, obtendo-se uma concentrao final de 15
g/mL, 20 g/mL e 25 g/mL, respectivamente. A Figura 41 ilustra o procedimento descrito
acima. Todos os bales tiveram seu volume completado com fase mvel e a concentrao de
clorexidina analisada em CLAE. O procedimento foi realizado em triplicata.
Suspenso padro
50 l
concentrao final:
20 l
Suspenso nanopartcula
lipdica slida 0,5%
100 l
20 l
150 l
20 l
bv.10 mL
bv.10 mL
bv.10 mL
15 g/mL
20 g/mL
25 g/mL
Figura 41: Fluxograma do teste de exatido.
112
A exatido expressa pela relao entre a concentrao mdia determinada
experimentalmente e a concentrao terica correspondente. Para a concentrao de 15
g/mL a exatido foi de 103,5 + 0,6 %; 20 g/mL de 101,8 + 0,3 % e 25 g/mL 103,8 + 1,7
%. Valores estes que consideram o mtodo exato.
113
ANEXO 2 Carta de aprovao pelo comit de tica para realizao do experimento em
ratos.
114
ANEXO 3 Carta de aprovao do comit de tica para estudo utilizando dentes
humanos.

Graciela Schneider Vitalis - Unifra

Caricato da

Informazioni sul documento

Titolo originale

Copyright

Formati disponibili

Condividi questo documento

Condividi o incorpora il documento

Opzioni di condivisione

Hai trovato utile questo documento?

Questo contenuto è inappropriato?

Copyright:

Formati disponibili

Graciela Schneider Vitalis - Unifra

Caricato da

Copyright:

Formati disponibili

CENTRO UNIVERSITRIO FRANCISCANO

PR-REITORIA DE PS-GRADUAO, PESQUISA E EXTENSO

UTILIZAO DE NANOPARTCULAS DE CLOREXIDINA COMO

GRACIELA SCHNEIDER VITALIS

UTILIZAO DE NANOPARTCULAS DE CLOREXIDINA COMO

Dissertao apresentado ao Curso de Mestrado

Orientador(a): Prof(a). Dr(a). RENATA PLATCHECK RAFFIN

Se vi mais longe foi por ter me apoiado em ombros gigantes

PUCRS e UFPEL pela oportunidade de trabalhar com pessoas dedicadas e dispostas

A medicao intracanal tem por objetivo eliminar os microrganismos presentes no

Palavras-chave: clorexidina, hidrxido de clcio, medicao intracanal, nanopartculas

Intracanal medication aims to eliminate micro-organisms present within the system of

LISTA DAS FIGURAS .......................................................................................................... 15

1.1. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 19

3.5.2. Preparo das amostras ...................................................................................................... 48

LISTA DAS FIGURAS

de clivagem; C) Clivagem da estrutura dentria; D) Dessecador utilizado para o processo de

Figura 30: Microscopia eletrnica de varredura. A) Micrografia eletrnica da deposio das

LISTAS DAS TABELAS

A estrutura dentria formada por esmalte, dentina e cemento. A dentina composta

Apesar dos inmeros medicamentos utilizados entre as sesses do tratamento

2.1. A ESTRUTURA DENTRIA

Figura 1: Estrutura dentria e sua diviso morfolgica.

A dentina apresenta vrios tbulos dentinrios em toda sua extenso, que so

Figura 2: Estrutura dentria, em destaque a presena dos tbulos dentinrios.

Figura 3: Estrutura dentria com presena de crie e contaminao do tecido pulpar.

As alteraes sistmicas so consideradas um grande problema de sade no Brasil e

Figura 6: Esquema didtico demonstrando a sequncia de procedimento do tratamento endodntico:

Para obteno de sucesso no tratamento, a desinfeco do sistema de canais

Em 1940, nos laboratrios de pesquisa da Imperial Chemical Industries Ltda.,

Figura 7: Estrutura qumica da clorexidina

A clorexidina representada pela frmula molecular de C22H30Cl2N10, com massa

So sistemas de liberao controlada de frmacos e apresentam como principais

Figura 8: Representao esquemtica de (a) nanocpsulas e (b) nanoesferas; e B. Representao

As nanopartculas lipdicas slidas foram desenvolvidas no incio da dcada de 1990

3.1. DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTCULAS CONTENDO CLOREXIDINA

Todo o processo de desenvolvimento, caracterizao e teste de estabilidade foram

3.1.1. Teste de solubilidade

Um teste piloto foi realizado visando avaliar a solubilidade da clorexidina na fase

3.1.2. Preparo das suspenses contendo nanocpsulas de clorexidina

Para o preparo das suspenses de nanocpsulas de clorexidina, tentou-se reproduzir o

Os componentes da fase orgnica e aquosa foram mensurados e colocados em

3.1.3. Preparo das suspenses contendo nanopartculas lipdicas slidas de clorexidina.

As suspenses contendo nanopartculas lipdicas slidas de clorexidina (NCL) foram

Tabela 2: Componentes da fase oleosa utilizados no preparo de suspenses contendo NCL.

Os componentes da fase oleosa foram pesados e colocados em banho-maria a 40 C

O volume final da suspenso foi de 100 mL e diferentes concentraes de clorexidina

3.1.4. Preparo dos gis contendo NCL.

Os gis foram preparados a partir da adio de hidroxietilcelulose a 1,5 % (m/v) s

3.2. CARACTERIZAO DAS NANOPARTCULAS

As suspenses e gis contendo NCL foram caracterizadas com relao determinao

3.2.1. Determinao do potencial zeta

3.2.2. Determinao do ndice de polidisperso e dimetro das partculas

A determinao do dimetro mdio e do ndice de polidisperso das nanopartculas nas

O pH das suspenses e gis das NCL foi verificado em um potencimetro (Digimed)

As anlises foram realizadas atravs de cromatografia lquida de alta eficincia

3.2.4.1. Mtodos Cromatogrficos

3.2.4.2. Preparo das amostras para o doseamento da clorexidina

Para a extrao da clorexidina das suspenses e gis, as amostras foram colocadas em

3.3. DETERMINAO DA ESTABILIDADE DAS SUSPENSES E GIS CONTENDO

As suspenses e gis de NCL 0,2 e 0,5 %, juntamente com o NBR e CL foram

3.4. ENSAIO MICROBIOLGICO