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Introduccin a la terapia gnica

Curso de Gentica Molecular


Ciencias Biolgicas
Universidad de Jan

TERAPIA GNICA
Introduccin de secuencias de ADN (naturales o artificiales) en
clulas para alterar su expresin gnica con fines teraputicos.
No se incluye el transplante de mdula sea o de hgado.
Dos tipos principales de terapia gnica:
Somtica: Introduccin de ADN en clulas no reproductivas,
puede ser in vivo o ex vivo. No permanece en la descendencia
del organismo tratado.
Germinal: Introduccin de ADN en clulas reproductivas.
Modifica el patrimonio gentico de la especie y puede ser
transmitido a la descendencia. Presenta graves inconvenientes
ticos aunque en animales (ratones) est muy desarrollada
(knock-outs y transgnicos).

TERAPIA GNICA
Tipos de terapia gnica
Reemplazar

un

gen

defectuoso

(ciruga

gentica),

enfermedades hereditarias monognicas.


1. Manipulacin para aumentar la expresin de genes
(citocinas, etc.)
2. Reducir la expresin de un gen potencialmente daino
(oligonucletidos antisentido)
3. Introducir un gen no-humano (resistencia a metales,
antibiticos, patgenos, etc.)

TERAPIA GNICA

Tipos de problemas tratables por terapia gnica


1. Enfermedades heredables (fibrosis qustica,
etc.)
2. Enfermedades adquiribles
Infecciosas (virus, bacterias, parsitos)
Cncer
Arteriosclerosis
Etc.

TERAPIA GNICA
Mtodos de introduccin de ADN
Transfeccin:
Fsicos: Biolstica (genegun), electroporacin
Qumicos: Lipidos catinicos, fosfato clcico,
polmeros, etc.
Biolgicos: ADN unido a ligandos de receptores
de membrana expresados en clulas diana
Transduccin: dependientes de virus
Retrovirus
Adenovirus
Virus Adeno-Asociados (AAV)
Herpesvirus

TERAPIA GNICA
Tipos de reparto del ADN
EX VIVO:
Paciente no est directamente expuesto al sistema
de transferencia gnica.
Posibilidad de monitorizar la expresin del transgen
Trabajo sobre poblaciones de clulas especficas
IN SITU:
ADN dirigido directamente a un rgano o tumor
IN VIVO:
ADN introducido directamente a travs de la sangre

Protocolos de terapia gnica aprobados

Crecimiento de la terapia gnica


1988 - 2000
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0

Protocolos de terapia gnica aprobados

Progresin de ensayos clnicos


sobre terapia gnica
300
250
200
150
100
50
0

Phase I

Phase I-II

Phase II

Phase III

Esquema estructura de los retrovirus

Esquema ciclo de vida de los retrovirus

Produccin de retrovirus defectivos para terapia gnica

Problemas de los retrovirus en terapia gnica

Se ha observado la desconexin de los genes a las pocas


semanas de la introduccin. Posiblemente por metilacin. El
cambio de promotores puede aliviar este problema.
Posibilidad de integracin aleatoria que desrregule o inactive
genes celulares imprescindibles.
Dificultad para infectar clulas quiescentes (cerebro, hgado).
Baja eficacia de transduccin viral en tejidos vivos.
Limitacin a 7-7,5 Kb

Citocinas necesarias para la


hematopoyesis
IL-2,4,6,7,10,13,14,15
Lnea linfoide

Linfocitos B

IL-2,4,6,7,9,12,15

Linfocitos T

IL-2,12,15
IL-3

clula
madre

Natural Killer
Clulas maduras
(TPO)/IL-11

Stem Cell
Factor(SCF),
IL-3

GM-CSF
G-CSF/GM-CSF

CFU-GEMM

Lnea mieloide

EPO
CFUs

Plaquetas
Monocitos
Polimorfos
G.Rojos
Clulas maduras

Varios receptores de factores de


crecimiento contienen la cadena comn
IL-2R
IL-2

IL-15R

IL-7R

IL-15

T
B
NK

IL-4

IL-7

T
B

IL-9R
IL-9

C
T
B
NK

IL-4R

C
T
B

Terapia gnica para X-SCID


Y vector retroviral
cadena
comn

mdula sea
co-cultivo

insercin en el paciente
gen expresado en las
clulas precursoras

desarrollo correcto de
linfocitos B y NK

cocultivo
clulas madre

reconstitucin
de un sistema inmune
funcional

Inmunodeficiencia combinadad severa ligada


al cromosoma X
1. Aparece durante la infancia con infecciones recurrentes
oportunsticas. Los nios suelen tener infecciones tpicas del
SIDA como Candida albicans, Pneumocystis carinii. Sin
tratamiento es mortal en el 100% de los casos
2. SCID ligado al cromosoma X aparece por una mutacin en
la cadena comn del los receptores de citocinas, el gen est
situado en el cromosomas X. Presenta una incidencia de
1/50,000. Los pacientes tienen unos niveles muy bajos de
linfocitos T y elevadas cantidades de linfocitos B inmaduros
no funcionales.
3. La nica terapia curativa es el transplante de mdula. Este
sistema es eficaz en el 100% de los casos con HLA idntico.
4. La ciruga gentica es potencialmente curativa

Resultados terapia gnica para X-SCID : qu pasa con


los niveles de expresin del transgn?
M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71

Deteccin del ARNm de la cadena C mediante RT-PCR

Resultados terapia gnica para X-SCID : qu pasa con los niveles


de linfocitos?
M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71

Paciente 1

Paciente 2

Niveles cuantificados por citometra de flujo

Resultados terapia gnica para X-SCID : beneficios clnicos


M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71
IL-2

IL-15

IL-7

IL-4

IL-9

As a likely consequence of development and sustained function of the immune


system, clinical improvement was observed in both patients. In P2, protracted
diarrhea as well as extensive graft-versus-host disease (GVHD)-like skin lesions
disappeared. Both patients left protective isolation at days 90 and 95 and are now
at home 11 and 10 months, respectively, after gene transfer without any
treatment. Both enjoy normal growth and psychomotor development. No side
effects have been noted. A similar result has since been achieved in a third
patient 4 months after gene transfer. These results demonstrate that in these
patients, a selective advantage was conferred to T and NK lymphocyte
progenitors, enabling full-blown development of mature and functioning T and NK
lymphocytes.

Virus de ADN utilizados en terapia gnica


Adenovirus:
Potencialmente patognicos
Comn en terapia gnica in situ
Insertos de ADN grandes (35Kb)
Amplio espectro de clulas diana
Puede transducir clulas quiescentes
En cultivo se pueden obtener grandes cantidades (1011/ml)
Problemas: Inmunognicos y expresin transitoria (3 semanas)
AAV:
Virus humanos no patognicos
Sitio de integracin preferente (Cromos. 19)
Amplia variedad de tejidos diana pero no muy eficaz
Slo permite insertos de 5 Kb
No tiene sistema de empaquetamiento eficiente e independiente

Terapia gnica 2003


Problemas
1. A los 10 aos de la aprobacin del primer estudio de terapia gnica ms de 4000
pacientes han recibido este tratamiento en todo el mundo. Muy pocos han tenido
beneficios clnicos definitivos.
2. Hace un par de aos muri un paciente despus de un tratamiento de terapia
gnica
3. Algunos ensayos clnicos han sido suspendidos debido a obscurantismo por parte
de los investigadores en los informes preceptivos de la FDA.
4. Dos pacientes de X-SCID han desarrollado leucemia

Promesas
1. Recientemente una enfermedad mortal (X-SCID) ha sido curada por terapia
gnica
2. Avances en la biologa molecular y los sistemas de transferencia gnica
acelerarn el uso de la terapia gnica.