UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA CELULAR

Factibilidad del vector de expresin de pTREX-GFP5(S65T) como

herramienta para la obtencin de lneas fluorescentes estables de
Trypanosoma evansi
Presentado por:
Br. Ali Agudelo
Tutoras: Dra. Palmira Guevara
Dra. Nereida Parra

LABORATORIO DE GENTICA MOLECULAR

IBE-UCV
LABORATORIO DE FISIOLOGA DE PARASITOS
IVIC/MPPEUCT

Caracas, Julio 2015

____________________________________________________RESUMEN
La Tripanosomiasis animal causada por Trypanosoma evansi es una enfermedad que
presenta una distribucin amplia, extendindose en el sur y centro de Amrica, frica, el
sudeste asitico (Lun y Desser, 1995). La evolucin de la enfermedad causada por T. evansi
vara considerablemente de acuerdo con la susceptibilidad del hospedador y la virulencia de
la cepa. Los sntomas se caracterizan por fiebre y anemia en la fase aguda, seguido de
emaciacin, edema, caquexia y aumento del tamao de los ndulos linfticos y del bazo en
la fase crnica (Luckins y col. 1999).
La aplicacin de herramientas de gentica reversa se plantea como un avance en el objetivo
de estudiar las relaciones parsito-hospedador, la posibilidad de la invasin de clulas del
husped, caracterizar el tropismo del parasito en los distintos rganos del husped y
tambin, si la evaluacin de la efectividad de drogas tripanocidicas in vivo como in vitro
sera ms eficiente que mediante las tcnicas disponibles actualmente. Esto se plantea
mediante la produccin de lneas fluorescentes estables en Trypanosoma evansi.
La transfeccin de los parsitos se har usando el plsmido pTREXn-GFP5(S65T) el cual
posee como marcador selectivo la resistencia a la gentamicina y como gen reportero la
protena verde fluorescente. Para ello se deber primero estimar el IC50 a la gentamicina y
estandarizar el protocolo de transfeccin.
El objetivo del trabajo sera evaluar entonces la factibilidad de transfectar T. evansi con un
plsmido diseado para T. cruzi apelando a la potencia de la presin selectiva como
promotor de la insercin del ADN exgeno al ADN cromosomal del parsito.

___________________________________________1._INTRODUCCIN
Las enfermedades tropicales desatendidas han ganado la atencin de lo pases potencias
econmicas en los ltimos aos. Estas enfermedades son causadas por parsitos, bacterias o
virus, considerados hasta hace poco como aquellas para las cuales el financiamiento a la
investigacin escasea en relacin al impacto de las patologas producidas (WHO 2010). La
tripanosomiasis humana, animal y la leishmaniasis, causada por protozoarios parsitos de la
familia trypanosomatidae, son algunas de estas enfermedades tropicales desatendidas, todas
con un impacto socioeconmico alto.
1.1 Tripanosomiasis animal por Trypanosomaevansi.
La tripanosomiasis causada por Trypanosoma evansi presenta una distribucin amplia,
extendindose en el sur y centro de Amrica, frica, el sudeste asitico (Lun y Desser,
1995). En Venezuela,la tripanosomiasis atribuida a T. evansi est ampliamente distribuida
en diferentes regiones del pas, existen reportes de una seroprevalencia de 40% en caballos
criollos de 3 hatosdel estado Apure (Forlano y col. 2011)
Esta parasitosis afecta una variedad de animales domsticos (caballos, bfalos,
bovinos, camellos y perros), as como a la fauna silvestre, siendo el chigire o capibara
(Hydrochoerus hydrochaerus) uno de los reservorios del parsito en Amrica del Sur.(Arias
y col. 1997). La evolucin de la enfermedad causada por T. evansi vara considerablemente
de acuerdo con la susceptibilidad del hospedador y la virulencia de la cepa (Brun y col.
1998). En el continente americano la enfermedad es ms severa en caballos, bfalos y
perros; mientras que los bovinos son afectados de una forma moderada. Por otro lado en
frica los camellos son ms afectados. Los cuadros clnicos de esta tripanosomiasis se

caracterizan por fiebre y anemia en la fase aguda, seguido de emaciacin, edema, caquexia
y aumento del tamao de los ndulos linfticos y del bazo en la fase crnica (Luckins y col.
1999).
El parsito es transmitido por insectos hematfagos de los gneros Tabanus,
Stomoxys, Atylotus y Lyperosia (Hoare, 1972). Tambin puede transmitirse por va oral
mediante la ingestin de carne o sangre contaminada y por murcilagos vampiros
(Desmodus rotundus) (Losos y col., 1986). En el murcilago el parsito puede pasar por la
mucosa oral y desarrollar la fase crnica de la enfermedad manteniendo niveles de
parasitosis que facilitan la dispersin de transmisin a travs de grandes distancias en
periodos cortos de tiempo, hecho imposible en la transmisin mediante la mosca, debido a
que la infectividad disminuye a medida que se seca el contenido estomacal del insecto.
1.2 Ciclo de vida.
El ciclo de vida de T. evansi es simple, ya que solo interviene un vector y el
hospedador, sin cambios morfolgicos del parsito en ninguno de stos. La transmisin es
fundamentalmente mecnica. Durante la picadura o mordedura del vector, dependiendo si
el vector es un insecto o un murcilago, el parsito pasa desde las partes bucales, hacia el
torrente sanguneo del hospedador donde contina su multiplicacin por fisin binaria
(figura 1). El ciclo se completa cuando el hospedador es nuevamente picado o mordido y el
vector extrae sangre contaminada con tripanosomas que sern inoculados en otro animal
durante la prxima picadura/mordedura (Parra 2011).

En algunos animales silvestres como los chigires o capibaras no se evidencian signos

clnicos de la enfermedad, por lo que pueden ser considerados como reservorios del
parsito (Arias y col.1997).
An cuando T. evansi es consideradoun patgeno nicamente para animales, recientemente
se han reportado casos de infecciones en humanos en el continente asitico (Joshiy col.
2005).

Figura 1. Esquema del ciclo de vida de Trypanosomaevansi.Tomada

http://www.vet.uga.edu/VPP/clerk/womack/index.php

conmodificaciones

de

T. evansi solo presenta las formas sanguneas que son similares de los tripomastigotes de
T. brucei. La especie generalmente es monomrfica por lo tanto las cepas de distintas reas
geogrficas y diferentes huspedes son indistinguibles, estos tripanosomas de forma
alargada miden entre 1433 m de largo con un ancho de 1.52.2 m. Los tripomastigotes
poseen un flagelo libre y un kinetoplasto pequeo subterminal (Hoare, 1972).

1.3Taxonoma y relaciones filogenticas

Los tripanosomas son parsitos obligatorios de todas las clases de vertebrados y son
transmitidos generalmente por vectores artrpodos y sanguijuelas. Hoare en 1972
subdividi los tripanosomas de mamferos en dos secciones Salivaria y Estercoraria
dependiendo de su modo de desarrollo en el vector. El grupo como un todo es caracterizado
por presentar variacin antignica, fenmeno estudiado en las especiesde T. brucei, T.
evansi, T. equiperdum, T. vivax, entre otras. Tambin se ha hecho un esfuerzo enorme en
identificar cepas morfolgicamente idnticas de los tripanosomatidos

indirectamente

mediante la caracterizacin de isoenzimas y directamente comparando polimorfismos entre

secuencias de ADN del kinetoplasto y nuclear (Stevens y col. 2001) concluyendo que el
gnero Trypanosoma representan un grupo monofiletico y que T.evansi y T. equiperdum
son derivados recientes de T. brucei. Esto concuerda con los resultados obtenidos de la
reciente secuenciacin del genoma nuclear de T. evansi y el anlisis comparativo con la
cepa de referencia de T. b. brucei ha mostrado que 94.9% de las secuencias codificantes
propuestas (CDS) tienen un ortlogo en T. evansi, y que 94.6% de los ortlogos no
repetitivos tienen una identidad nucleotdica igual o mayor al 95%, revelando una extensiva
similaridad con T. brucei, apoyando al argumento que propone clasificar a T. evansi como
una subespecie de T. brucei.(Carnes y col. 2015)
El anlisis del ADN del kinetoplasto de T. evansi ha mostrado que los minicrculos son
homogneos, atribuido a la ausencia de reproduccin sexual y evidenciado la ausencia de
maxicrculos, lo que implica una prdida de la capacidad del parsito de realizar la
fosforilacin oxidativa impidiendo la generacin de ATP. En consecuencia no es posible el

desarrollo del T. evansi en la mosca tse-ts impidiendo la transmisin por este vector.
(Borst y col., 1987)
1.4 Genoma, gentica y expresin en tripanosomtidos, el caso de T. evansi
El genoma de T. evanside 25,43 Mpb, recientemente reportado por Carnes y col,
(2015), est distribuido en 13 cromosomas y 100 minicromosomas de 50 a 100 kb. Se han
identificado 8.919 genes codificantes de protenas, 1.190 pseudogenes y 65 genes de ARN
de transferencia. Los minicromosomas se caracterizan por portar los genes de las variantes
de las glicoprotenas de superficie (VSGs) (Gibson 1999) y por la presencia de elementos
altamente repetitivos o copias de ADN satlite de 177-500 pb de tamao En la mayora de
los eucariotas la polimerasa I es la encargada de transcribir los RNA ribosomales, la
polimerasa II los ARN mensajeros y los ARN pequeos no codificantes y la polimerasa III
transcribe los ARN de transferencia. T.evansi al igual que otros tripanosomas, emplea la
polimerasa I para transcribir las protenas VSG (Clayton y col. 2002). Este proceso debe ser
regulado con precisin para que se exprese solamente una variante en cada parsito.
En cuanto a la expresin, en los tripanosomtidos el genoma generalmente diploide
est organizado en agrupaciones de genes en tndem (policistrnicos), con decenas a
cientos de secuencias codificadoras de protenas libres de intrones, no relacionadas en
funcin, organizadas secuencialmente en la misma hebra y mantenidas separadas entre s
por secuencias intergnicascortas (IS) (El-Sayed y col. 2005). Estos arreglos son transcritos
por la RNA polimerasa II dando como resultado transcritos policistrnicos. A diferencia de
los operones bacterianos que contienen genes relacionados con un mismo proceso
biolgico, estas unidades transcripcionales de los tripanosomtidos no tienen relacin
aparente. Adems pueden mostrar diferentes patrones de expresin a pesar de estar todos
7

codificados en un mismo policistrn (Berriman y col. 2005). La maduracin de los mRNA

involucra reacciones de trans-splicing (Figura 2).El complejo trans-spliceosomal es
responsable de la poliadenilacin del gen aguas arriba y la adicin del splice leader (SL),
primero separando mRNAs individuales de los transcritos primarios policistrnicos, para
seguidamente aadirun segmento corto 39 nucletidos de RNA con un residuo metilado
llamado cap, al extremo 5 del gen aguas abajo. Esta reaccin de transesterificacin
requiere la presencia de un dinucletido AG aceptor del splicingo edicin en el extremo
3 de la regin intergnica del pre-RNA, conocido como sitio de empalme (splice-site),
donde se lleva a cabo la adicin de la secuencia lder (Liang y col. 2003). Debido a este
mecanismo inusual de produccin de mRNAs, el sitio de inicio de la transcripcin parece
ser poco importante para la regulacin gentica. Incluso pareciera que la transcripcin por
parte de la polimerasa II es constitutiva (Martinez-Calvillo y col. 2003).
Las secuencias intergnicas son la fuente de las regiones no transcritas o
untranslated regions (UTR) las cuales determinan la estabilidad del mRNA, as como la
eficiencia de traduccin.La expresin de genes, ya sea en etapas especficas del desarrollo o
de forma constitutiva, est en su mayora definida por las secuencias intergnicas de
manera post-transcripcional (Clayton y col.2002).

Primer paso.

Y- structuraintermedia

Segundo paso.

ARNm

Degradacin

Figura 2. Mecanismo de trans-splicing para el procesamiento de ARNmmonocistrnico en

tripanosomtidos.
(A) El sitio de corte GU 5 en el RNA del splice leader y el aceptor3 AG en el pre-mRNA estn indicados.
BP, branchpoint;Py segmento polipirimdinico. El valo oscuro en el extremo 5del RNA del SL indica la
estructura cap. (B)Reaccion de transesterificacin(C) El resultado de la transesterificacin es un ARNm
maduro concapping y poliadelinacin y un ARN ramificado que ser degradado. SS: Splicig site; Py: Track
de pirimidinas; SL: splice leader.(tomado con modificaciones de Liang 2003).

1.5. Herramientas genticas.

Aplicar la gentica clsica no es posible en T. evansi ya que al igual que otras

especies de kinetoplastidios, la reproduccin sexual en los tripanosomas es muy poco
frecuente, representando una limitacin para el abordaje a los estudios genticos.En
consecuencia,el enfoque que debe aplicarse es la gentica reversa.

La gentica reversa es un enfoque viable gracias a la tecnologa del ADN recombinante.

Trabaja en la direccin opuesta de la gentica clsica ya que se comienza a partir de una
protena o ADN del gen sobre el cual no se tiene informacin y entonces se busca la
9

manera de obtener un gen mutante, logrando luego un fenotipo mutante. Algunas

herramientas de la gentica reversa incluyen: la transfeccin estable o temporal con
vectores de expresin utilizando promotores homlogos y genes de resistencia a
antibiticos para la seleccin (ejemplo el gen de la neomicin fosfotransferasa que confiere
resistencia al antibitico G418), la expresin condicional de genes utilizando elementos
regulatorios heterlogos como la polimerasa del virus T7 y el gen represor del opern de la
tetraciclina, la produccin de mutantes por desplazamiento del gen salvaje a travs del
knockout del gen mediante recombinacin, el ARN de interferencia (RNAi), el rescate
funcional de mutantes mediante complementacin con el gen salvaje, la mutagnesis
mediada por transposones (Cross, 2008).
Buena parte de este conjunto de herramientas ha sido desarrollado para el estudio de los
tripanosomtidos (Tabla 1) permitiendo el anlisis funcional degenes, para evaluar el
tropismo o la resistencia a frmacos.
Con la secuenciacin completa del genoma de T. brucei (Berriman y col. 2005), se ha
vuelto rutinario el diseo de oligonucletidos y la amplificacin de las secuencias laterales
apropiadas para el knockout de genes por recombinacin homloga (Asbroek y col. 1990) y
es posible utilizar el procedimiento knockout funcional mediante la interferencia del ARN
para bajar el nivel de expresin de genes individuales o familias de genes (Ngo 1998).
Hasta hace relativamente poco, se crea que los mecanismos involucrados en la
transformacin de T. brucei eran distintos de los otros tripanosomatidos, posiblemente por
los diferentes requisitos para la replicacin autnoma. La transformacin estable parece
estar mediada exclusivamente por la integracin del vector (Asbroek y col. 1990) y en los
ensayos de expresin transitoria, es esencial un promotor fuerte. Aun cuando se ha logrado
la transformacin de T. brucei con vectores episomales las lneas son inestables y el vector
10

se pierde rpidamente al quitar el factor selectivo del medio (Kelly 1995). La

transformacin estable de los tripanosomas usualmente se realiza mediante electroporacin
con un pulso corto de alto voltaje seguido de seleccin con antibiticos. En las formas
procclicas de T. brucei, este mtodo puede tener eficiencias alrededor de 10-3 10-6
(McCulloch

2004). En contraste, las formas sanguneas son considerablemente ms

difciles de transfectar, ya que la tasa de supervivencia de las clulas es baja y la

recombinacin homloga parece ser menos eficiente. Se han hecho intentos de mejorar la
eficiencia de la transformacin en las formas sanguneas mediante el uso de diferentes
condiciones de cultivo, buffers y parmetros de electroporacin (Li, 1996). Sin embargo, la
eficiencia de la transformacin estable (10-7 10-8) est varios rdenes de magnitud por
debajo en comparacin con las formas procclicas. Existen otras tcnicas como por ejemplo
la biobalstica con la cual se pueden obtener mayores tasas de transformacin estable para
las formas sanguneas (Hara 2002), pero como este mtodo requiere un trabajo ms intenso
adems de equipos especiales, la electroporacin ha quedado como el mtodo usual para la
transfeccin de tripanosomas.
1.6 Vectores de expresin en Tripanosomatdeos
Un vector de expresin debe tener todos los elementos que le permitan la expresin
eficiente de genes especficos. Inicialmente, para el mantenimiento episomal del vector se
necesita un origen de replicacino de lo contrario la funcin insertada se pierde en las
sucesivas divisiones celulares. En Tripanosomatdeos estos elementos son un promotor
fuerte que puede ser especie especfico (con frecuencia se ha utilizado el promotor de los
genes ribosomales), las seales de trans-splicing y poliadenilacion, para la maduracin
efectiva del ARNm; las regiones conservadas y no traducidas (UTRs) que regulan la

11

estabilidad del ARNm y la expresin estadio especifica (Figura 2). Si se busca lograr la
integracin del transgen al genoma para una expresin estable se debe tener en cuenta
tambin la inclusin de unos segmentos de tamao apropiado que permitan la
recombinacin homloga.

Figura 2. Plsmido pLUN100.Este contiene una regin intergnica de la -tubulina que contiene la
secuencia blanco de la endonucleasa MluI permite la linealizacin del plsmido con la finalidad de facilitar la
integracin al genoma por recombinacin homloga. Tambin tiene el promotor de PARP (Protena
prociclicica acidica repetitiva), adems del gen de la neomicin fosfotransferasa y el de la luciferasa cada uno
precedido de un sitio de empalme el cual permite la maduracin apropiada de ambos transcritos. Ambas
protenas una vez expresadas le otorga la resistencia a la presin selectiva del antibitico G418 y la
fluorescencia inducida.

T. brucei posee algunas caractersticas que hacen favorable su estudio mediante las
herramientas de la gentica reversa: es fcil de cultivar in vitro, se puede transfectar
eficientemente usando electroporacin, existen actualmente hasta 6 marcadores de
resistencia a antibiticos tiles en la seleccin, posee un sistema intrnseco de ARN de
interferencia y se ha logrado la expresin de sistemas inducibles mediante el uso de
polimerasa de bacterifago T7 y el sistema del represin de la tetraciclina (Cross, 2008).
La similitud de secuencias de T. evansi a esta especie filogenticamente ancestral
(Carnes y col., 2015), apoya la idea que las herramientas de la gentica reversa sean
factibles para el estudio de T. evansi.
12

Tabla 1. Resumen de herramientas de gentica reversa aplicadas en

tripanosomatidos.
T. brucei

T. cruzi

Leishmania

T. evansi

Transfeccin transitoria

+++

++

ND

Transfeccin estable

+++

++

+++

ND

Episomales
Cromosmicos
Regulables
Marcador selectivo:
Positivo
Negativo

+
+++
+++

++
+
-

+++
+++
+

ND
ND
ND

6
1

3
1

8
2

ND
ND

Gene Knock-out

+++

++

+++

ND

+*

Posible

ND

ND

+++

ND

ND

Rescate funcional

ND

+++

ND

Mutagnesis por
transposones

++

ND

Tamao del Genoma (MB)

35

40

35

251

11

>30

~36

131

Vectores de expresin:

Cruces sexuales/ formacin

de hbridos
Clonamiento posicional
RNAi (Knock-out funcional)

# de cromosomas

El smbolo + indica que un mtodo ha sido establecido, el nmero de + refleja una aproximacin a cun
bien funciona o su aplicacin en una especie determinada. ND, no determinado (Tomado con modificaciones
de Beverly 2003)* (Akopyants, 2009)1(Carnes y col 2015)

13

____________________________________________2.ANTECEDENTES
La transformacin usando genes reporteros ha permitido avances en las ltimas
dcadas con respecto al entendimiento de muchas caractersticas de la biologa de los
parsitos Tripanosomatdeos y su relacin con los huspedes a nivel celular y de tejido. La
construccin de vectores de expresin estable, en forma episomal o para su insercin en el
genoma, permiti obtener lneas transformante estables expresando diferentes genes
reporteros en Leishmania, T. brucei y T. cruzi que fueron aplicados para abordar
experiencias a nivel subcelular, celular y de interaccin parsito-vector.
Los primeros intentos exitosos datan de 1991 con la expresin de -galactosidasa y
-glucuronidasa como enzimas reporteras en Leishmaniatropicausando el vector de
expresin pX63NEO. Con ello se demostr que era posible la expresin transitoria de
ambas enzimas en las cuales resultaron tener una mayor sensibilidad que la comnmente
usada CAT (cloranfenicol acetiltransferasa)(Lebowitzy col., 1991).La bioluminiscencia
mediada por la expresin estable de la enzima luciferasa de lucirnaga fue utilizada por
primera vez en 1992 paradeterminar las seales de importacin de protenas al glicosomaen
formas procclicas de T. brucei(Sommer,1992).
A finales de los noventa, se introduce el uso de la autofluorescencia de la protenas
de fluorescencia verde GFP (por sus siglas en ingls Green FluorescentProtein),
originalmente de la medusa Aquorea victoriapara lograr lneas fluorescentes estables y
estudiar el desarrollo de los parsitos en los vectores. Utilizando el vector pXGFP5(S65T)R-promotor de forma episomal, Guevara y col (2001) obtuvieron lneas estables de
Leishmaniadonovanipermitiendo evaluar el desarrollo de esta especie del viejo mundo en

14

especies de vectores deAmrica (Lu. longipalpis, Lu. ovallesis,Lu. youngi), provenientes

de colonias y aislados de la naturaleza, demostrando el potencial de esta aproximacin para
determinar capacidad vectorial. Posteriormente, Guevara y col. (2005) lograron la
expresin de las protenas GFP y DsRed en cepas deT. cruziy Trypanosoma rangeli
empleando dos vectores de expresin, el pTREX-n y pBsCalB1/CUB01, con ello se pudo
avanzar en el estudio del ciclo en el vector Rhodnius prolixus en infecciones simples y
mixtas(Figura 3).

Figura 3. Plsmido pTREXn-GFP5(S65T).Este contiene dos genes marcadores selectivos AMP y NEO que
le otorgan resistencia a la ampicilina y el G418 respectivamente. Tambin tiene un gen reportero el de la
protena verde fluorescente inserto en el sitio de clonamiento multiple. Los factores que permiten una
expresin eficiente son el promotor ribosomal de T. cruzi, la regin hx1 que es una seal para el transplicing
al igual que las regiones intergenicas del locus de la enzima GAPDH (gliceraldehido 3-fosfato
deshidrogenasa).

Estos genes reporteros han sido usados progresivamente desde entonces porque son
de fcil visualizacin/deteccin, estables, de costo accesible y de baja toxicidad, adems de
no ser expresados en clulas de mamferos. Una de las principales ventajas de la utilizacin
de parsitos expresando fluorescencia in vivo es que no requieren fijacin y permiten una
visualizacin en tiempo real para el seguimiento de las infecciones in vitro e in vivo.

15

La obtencin de lneas de parsitos fluoresciendo de manera estable proporciona

una poderosa herramienta para el descubrimiento y desarrollo de nuevas drogas as como
para la visualizacin in vivo de los procesos biolgicos de infeccin y tropismo tisular
durante la infeccin en los huspedes mamferos con tcnicas no invasivas. Recientemente
Canavaciy col (2010) evaluaron la eficacia de drogas antiparasitarias en ensayos tanto in
vitro como in vivo, usando cepas de T. cruzi expresando la protena fluorescente Td-tomato
a partir del vector pTREX-n, Los autores demostraron que los ensayos realizados con
parsitos fluorescentes culminados en dos semanas, fueron equivalentes a las pruebas
tradicionales que requieren ms de cuarenta das. El procedimiento con parsitos
fluorescentes in vivo permiti el rpido descarte de drogas consideradas prometedoras en
ensayos in vitro y cuya eficiencia result nula o inferior a los tratamientos actuales una vez
evaluadas en el ensayo in vivo.
En el Laboratorio de Fisiologa de Parsitos en el Instituto Venezolano de
Investigaciones Cientficas (IVIC) se desarrolla una lnea de trabajo que aborda la
caracterizacin parasitolgica, inmunolgica e histoqumica de varias cepas venezolanas de
T. evansipara profundizar en el estudio de las interaccines parsito-hospedador. Los
trabajos de caracterizacin realizados por Perrone en 2003, cubrieron la evaluacin del
comportamiento

parasitolgico,

la comparacin de los

patrones

antignicos e

isoenzimticos, as como la comparacin de los electrocariotipos de varias cepas de T.

evansi, estableciendo diferencias significativas en la virulencia de al menos 9 aislados de T.
evansi.
Mediante la aplicacin de la tcnica de amplificacin aleatoria de polimorfismos del
ADN (RAPD)Perrone y col (2009) se logr confirmar que los aislados de T.evansi TeAp16

N/D1 y TeGu-N/D1 estn ubicados taxonmicamente en grupos distintos, ms cercanos a

T. brucei y T. equiperdum. La caracterizacin se ha ampliado a la evaluacin del tropismo y
los cambios patolgicos estructurales que las cepas de T. evansi ocasionan en los ratones.
El anlisis de estructuras celulares por medio de la aplicacin de microscopia electrnica,
(Tejero y col 2009) detect cambios en la morfologa de las mitocondrias y gotas lipdicas
de hepatocitos de ratn (Mus musculus) infectados con T.evansi obtenido de un equino
infectado naturalmente en el estado Guarico, En 2011 Parra compar el comportamiento
parsitologico de varios aislados de T. evansi, encontrando que TeAp-N/D1 es el ms
virulento y patognico. Tambin evalo comparativamente perfiles proticos mediante
inmunoblot con lo que se pudo identificar protenas relacionadas con la virulencia del
parsito.
Conociendo la experiencia del Laboratorio de Gentica Molecular del Instituto de
Biologa Experimental, (IBE)

Facultad de Ciencias, UCV, en el manejo de las

herramientas de gentica reversa, particularmente en la produccin de lneas fluorescentes

estables en tripanosomas, surge la necesidad de producir las lneas antes mencionadas con
Trypanosoma evansi con el objetivo de estudiar a profundidad las relaciones parsitohospedador, la posibilidad de la invasin de clulas del husped, determinar el tropismo del
parasito en los distintos rganos del husped y tambin, si la evaluacin de la efectividad de
drogas tripanocidicas in vivo como in vitro sera ms eficiente que mediante las tcnicas
disponibles actualmente en el Laboratorio de Fisiologa de Parsitos del IVIC. Por esta
razn se considera importante transfectar la cepa venezolana Teva1 de T. evansi
previamente caracterizada bioqumica, molecular y parasitolgicamente, explorando la
factibilidad de los vectores de expresin disponibles.

17

_________________________________________________3. OBJETIVOS
Objetivo general:
Determinar

la factibilidad del vector de expresin pTREX-GFP5(S65T) como

herramienta para la obtencin de lneas fluorescentes estables de cepas venezolanas

de la especie Trypanosoma evansi.
Objetivos especficos:

Confirmar la identidad de la cepa venezolana TeAp-N/D1 de Trypanosoma evansi.

Determinar el IC50 al antibitico G418 en la cepa venezolana TeAp-N/D1de

Trypanosoma evansi.

Determinar el porcentaje de sobrevivencia de la cepa venezolana TeAp-N/D1 de

Trypanosoma evansi a las condiciones de electroporacin utilizadas

para la

transfeccin en tripanosomatideos.

Aislar y caracterizar el vector pTREXn-GFP5(S65T).

Normalizar las condiciones del protocolo de transfeccin en tripanosomtidos para

T. evansi.

Transfectarla cepa venezolana TeAp-N/D1de Trypanosoma evansi con el vector

pTREXn-GFP5(S65T)

18

_________________________________4. MATERIALES Y MTODOS

4.1.Material biolgico, cultivo y aislamiento

Cepas de parsitosTeAp-N/D1:
Se usar la cepa de Trypanosoma evansi MEQU/VE/03/TeAp-N/D1 aislada
originalmente de un caballo infectado del estado Apure otorgada por el Laboratorio de
Fisiologa de Parsitos del Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas (IVIC).
Cultivo de parsitos:
El criopreservado de la cepa TeAp-N/D1 de Trypanosoma evansi ser descongelado
a temperatura ambiente y posteriormente se inocularn los parsitos en ratas por va
intraperitoneal para su reactivacin. Cuando las parasitemias alcancen valores aproximados
de 107 parsitos/mLde sangre, los animales anestesiados sern sacrificados por puncin
cardaca en presencia de EDTA 10% y la sangre obtenida representar el material
parasitolgico inicial inculo experimental para el cultivo.La sangre extrada ser
inmediatamente sometida a cromatografa de intercambio inico en condiciones de
esterilidad para la purificacin de los parsitostal como se describe a continuacin.
Purificacin de parsitos por cromatografa de intercambio inico:
Se utilizar latcnica de cromatografa de intercambio inico en columna de DEAECelulosa equilibrada en tampn fosfato salino glucosado, pH 8, de acuerdo al mtodo
deLanham y Godfrey (1972). El empaquetamiento de la columna de DEAE-Celulosa se
har bajo condicionesde esterilidad, en campana de flujo laminar, utilizando tampn fosfato
salino ytampn fosfato salino glucosado estril. Los parsitos eludos de la columna se
19

centrifugarn a 1500 g x 10 minutos, se eliminar el sobrenadante y luego se resuspendern

en 2 ml de tampn fosfato salino glucosado para la posterior cuantificacin del rendimiento
de la purificacin.

Determinacin de Viabilidad Celular (Mtodo de Azl de tripano):

En un tubo pequeo se mezclara 50 Lde la suspensin celular estril (2-10 x

106clulas/mL) con 50 uLde solucin Azl de tripano0,2 % (P/V) en PBS. Se colocar
inmediatamente la suspensin en un hemocitmetro y se dejar decantar las clulas por 1
minuto. Luego se observar al microscopio a 40 X dentro de los 3 minutos siguientes a la
coloracin, contando clulas muertas (azules) y clulas vivas (no teidas). Finalmente se
calcular el nmero de clulas viables por mL y el porcentaje de clulas viables (viabilidad)
(Hunt 1987).
Cultivo del parsitoT. evansi
Los parsitos(1.25 x 106clulas/mL en 5mL)sern cultivados y mantenidos en medio
de crecimiento: MEM (Medio mnimo esencial con sales de Earle, suplementado con
aminocidos no esenciales), glucosa lmg/mL, NaHCO3 2,2 mg/mL, HEPES 10 mM, Lglutamina 2 mM, Piruvato de Sodio 2 mM, 2-Mercaptoetanol 0,2 mM, Hipoxantina 0,2
mM, suero de caballo 20% (previamente inactivado por calor), 100 UI de penicilina, 50
g/mLgentamicina pH 7,3.En una atmosfera de CO2 al 5% mantener a 37C(Protocolo
modificado de Kaminsky y col (1998).

20

4.2Identificacin molecular
ADN genmico de T. evansi ser extrado a partir de un sedimento de 109
tripanosomas siguiendo el protocolo de un estuche comercial para el aislamiento de ADN
genmico BDtractTM de Biotech. Consiste en la lisis de las membranas citoplasmticas y
nuclear con detergentes aninico y no inicos, remocin de ARN contaminante con una
solucin de ARNasa, precipitacin de las protenas por saltingout y precipitacin del
ADN genmico con isopropanol. Luego del lavado con isopropanol, el ADN se disolvi en
100L de agua destilada(Perrone, 2003).
Las reacciones de PCR sern ejecutadas en un termociclador(MJ Research, modelo
PTC-200) con un volumen final de 15L por cada 100ng de ADN genmico. El cebador

usado ser el mini A 5-GGGTTTTTTAGGTCCGAG-3 y el mini B como antisentido 5CCGAAAATAGCACGTG-3 (Njiru y col., 2006)Las condiciones de la reaccin son las
siguientes:

MgCl2

2,5

mM,

dNTPs

800

M,

Taq

Polimerasa

(Platinum

invitrogen)0,5U/ensayo, Mini A 0,2 M, Mini B 0,2 M, buffer taq 10% V/V.

4.3 Determinacin del IC50 de T. evansi a G418.
Se cultivarn varios viales de parsitos suplementados con concentraciones
crecientes del antibitico G418, con un rango de concentracin de 0 a 500 g/mL por un
periodo de 10 a 12 das consecutivos dichos cultivos sern monitoreados mediante cmara
de Neubauer para determinar la concentracin con la cual se inhibe el crecimiento del 50%
de los parsitos con respecto al control. El valor de IC50 se obtendr por regresin lineal.

21

4.4 Transformacin, aislamiento y caracterizacin del vector pTREX-GFP5(S65T)

Preparacin de clulas competentes por CaCl2
El protocolo a seguir, ser tomado de Sambrook y col. (1989)conalgunas
modificaciones. Se utilizar la cepaEscherichiacoliDH10B de (Gibco-BRL): F-mcrA
(mrr-hsdRMS-mrcBC) 80dlacM15 lacX74 deoRrecA1 endA1 araD139 (ara, leu)
7697 galUgalK -rpsLnupG Inicialmente se inocularn 2 mLde caldo LB con una colonia
aislada de la cepa mencionada, el cultivo se dejar crecer con agitacin durante toda la
noche a una temperatura de 37C, pasado el tiempo de incubacin, se agregarn 8 mL de
caldo LB fresco al precultivo y se someter a incubacin por una hora adicional (a 37C
con agitacin). Seguidamente, las clulas sern recuperadas por centrifugacin a 4000g, a
4C por 10 minutos. El sedimento celular ser lavado con solucin salina (NaCl 0.85%)
estril, y luego se recuperarn nuevamente por centrifugacin, manteniendo las mismas
condiciones de centrifugacin del paso anterior. Este sedimento ser resuspendido en una
solucin de CaCl2 50mM estril a 4C, y luego se someter a incubacin en hielo durante 1
hora. Posteriormente las clulas sern recuperadas por centrifugacin a 4000g por 10
minutos, y se resuspendern en 500L de CaCl2 50mM estril a una temperatura de 4C.
Esta suspensin celular se utilizar inmediatamente para llevar a cabo la transformacin.
Transformacin de clulas competentes.
El protocolo de transformacin bacteriana ser tomado de Sambrook y col. (1989)
conciertas modificaciones. Se tomarn 100L de la suspensin de clulas competentes, las
cuales sern mezcladas con aproximadamente 10ng de ADN plasmdico (pTREXGFP5(S65T)), en un volumen que no exceder los 10L. Esta mezcla ser incubada en
hielo por 1 hora. Transcurrido este tiempo se aplicar un choque trmico a 45C por 90
22

segundos. Inmediatamente las clulas sern resuspendidas en 1mL de LB e incubadas por 1

hora a 37C con agitacin. El cultivo ser centrifugado por 2 minutos a 5000g y el
sedimento celular ser resuspendido en 200 Lde LB para luego ser sembrados en dos
placas

de

Agar

LB,100L de

cultivo

en cada

placa,

suplementadas

con

estreptomicina(40g/mL) y ampicilina (100g/mL), las placas se incubarn durante toda la

noche a una temperatura de 37C.
Aislamiento de ADN plasmdico a gran escala.
La metodologa a seguir ser tomada, con algunas modificaciones, de Birnboim y
Doly (1979) (referido en Sambrook y col., 1989). Inicialmente se inoculararn 4mL de
caldo LB con una colonia aislada del recombinante de inters, y se dejar crecer hasta
saturacin a 37C con agitacin durante toda la noche. Este precultivo ser amplificado en
200mL de medio super rico (Na2HPO4 0.6%; KH2PO4 0.3%; NaCl 0.05%; NH4Cl 0.1%;
caldo LB 10mL/100mL de medio; glucosa 0.2%; Mg2SO4 0.025%; CaCl2 0.0015%;
casaminocidos 0.1%) a 37C y con agitacin hasta que alcance una D.O. 560nm de 1.0. A
continuacin ser enriquecido con caldo LB fresco (10mL/100mL), casaminocidos (0.1%
concentracin final) y glucosa (0.5% concentracin final), y se incubar por 30 minutos a
37C con agitacin. Pasado este tiempo se aadir Cloranfenicol hasta una concentracin
final de 50 mg/mL, y se mantendr la incubacin a 37C por 14 horas. Las clulas sern
recuperadas por centrifugacin a 4000g por 15 minutos. El sedimento celular se lavar con
10mL de solucin salina estril (NaCl 0.85%) y se someter a centrifugacin a 4000g por
15 minutos. El sedimento celular ser resuspendido en 2.5mL de Solucin de Lisis I
(glucosa 50mM; Tris-HCl pH 8.0; EDTA 10mM) y se incubar por 10 minutos en hielo.
Luego sern aadidos 6mL de Solucin de Lisis II (SDS 1%; NaOH 0.2N), mezclando
23

cuidadosamente por inversin e incubando en hielo por 15 minutos. Seguidamente se

aadirn 4.5mL de Solucin de Lisis III (Acetato de Sodio 3M; pH 5.2), mezclando
suavemente e incubando en hielo por 20 minutos. El sobrenadante ser recuperado y los
cidos nucleicos que all se encuentran sern precipitados con la adicin de igual volumen
de Isopropanol, mantenindose a 4C por 30 minutos. El sedimento de cidos nucleicos se
obtendr mediante la centrifugacin a 12000g por 30 minutos para luego proceder al secado
y resuspensin en 1mL de tampn TE (Tris-HCl 10mM pH 8.0; EDTA 1mM). A esta
solucin se la aadir RNAsa A (10mg/mL en 5mM de Acetato de Sodio pH 4.8 hervida
por 10 minutos) a una concentracin final de 50g/mL, y se someter a incubacin a 37C
por 30 minutos, seguido de una segunda incubacin a 37C con Proteinasa K a una
concentracin final de 10g/mL. Posteriormente se aadir igual volumen de solucin
LiCl2 5M y se incubar en hielo durante 30 minutos. Despus esta mezcla se centrifugar a
12000g por 20 minutos. El sobrenadante recuperado ser sometido a extraccin con igual
volumen de una mezcla Cloroformo: Fenol (1:1), seguido de una extraccin con igual
volumen de una mezcla de Cloroformo: Alcoholisoamlico (24:1), en ambos casos, la
mezcla ser centrifugada a 12000g por 30 minutos. El ADN contenido en el sobrenadante
ser precipitado con 2.5 volmenes de Etanol 99%, una solucin de Acetato de Sodio 0.3M
pH 5.2 y 1L de glicgeno (2% v/v), para luego centrifugar a 12000g por 15 minutos.
Finalmente se realizarn lavados del sedimento con Etanol 70%, para dejarlo secar y
resuspenderlo en un volumen no mayor de 300L de tampn TE (Tris-HCl 10mM pH 8.0;
EDTA 1mM).
4.5Digestin de ADN con enzimas de restriccin.

24

El ADN plasmdico ser digerido con enzimas de restriccin como parte de la

caracterizacin y anlisis del vector de expresin y los recombinantes obtenidos. Estas
reacciones se llevarn a cabo bajo las condiciones recomendadas por la casa comercial en
cuanto a: concentracin de la enzima por microgramo de ADN a digerir, concentracin
final del tampn, temperatura y tiempo de incubacin. Generalmente estas reacciones se
llevarn a cabo en un volumen final de 15L para digestiones no preparativas, y en el caso
de digestiones preparativas el volumen final ser de 50 L. Con el fin de eliminar el RNA
presente, se le aadir RNAasa A (10mg/mL de 5mM de Acetato de Sodio pH 4.8 hervida
por 10 minutos) a la reaccin hasta alcanzar una concentracin final de 50g/mL.
4.6Anlisis de ADN mediante electroforesis en geles de agarosa.
Con la electroforesis se evaluar la integridad y la concentracin del ADN aislado,
viendo el tamao de los fragmentos de ADN producto de la digestin con enzimas de
restriccin. La concentracin de agarosa ser de 0,8g/mL. Inicialmente las muestras sern
cargadas en los bolsillos de los geles luego de ser mezcladas con tampn de carga 6x (Azul
de Bromofenol 0.25%; Cianol Xileno 0.25%; Sacarosa 40%), utilizando una relacin
muestra:tampn de 5:1. Las corridas electroforticas se realizarn en tampn TAE 1x (TrisAcetato 40mM; EDTA 1mM pH 8.0) utilizando un voltaje no mayor a 5V/cm. Luego de la
corrida, los geles sern teidos en Bromuro de Etidio (0.5mg/mL) (Sambrook y col. 1989)
y el ADN ser visualizado bajo luz Ultravioleta con la ayuda de un transiluminador
acoplado a un sistema Gel-Doc 1000 (BioRad) a una longitud de onda de 302nm. El
registro de las imgenes se llevar a cabo con un sistema de digitalizacin de imgenes
utilizando el programa de computacin QuantityOne (BioRad).

25

4.7Electroporacin, seguimiento y seleccin de lneas transfectantes estables.

Las experiencias de transfeccin de parsitos se realizarn siguiendo el protocolo de
Hariran y col. (1993) (revisado de Campelo2006), con algunas modificaciones. Las clulas
de Trypanosoma evansi provenientes de la purificacin por columna DEAE sern ajustadas
a una concentracin de 107-108 clulas/mL mediante lavados en solucin salina estril
(NaCl 0.85%) dos veces. El sedimento celular ser resuspendido en medio LIT sin hemina
(Triptosa 1.5%; Infusin de Hgado 0.2%; Extracto de Levadura 0.5%; Glucosa 0.4%; NaCl
0.9%; KCl 0.04%; Na2HPO4 0.75% pH 7.4) a una concentracin final de 8.9 x 108-109
clulas/mL. Un volumen de 350L de esta suspensin celular ser colocado en cubetas de
electroporacin BTX de 2mm pre-incubadas en hielo por 10 minutos. Las clulas sern
mezcladas con 200g de ADN plasmdico de pTREXn-GFP5(S65T) en un volumen no
mayor a 40L. La mezcla ser incubada en hielo por 10 minutos para luego proceder a la
electroporacin utilizando el Gene Pulser II BioRad, bajo las siguientes condiciones: un
pulso simple de 300V, 1000-1500F y 25-100 de resistencia. Posterior a la
electroporacin las clulas sern incubadas 10 minutos en hielo y luego transferidas a viales
de 5mL de medio de crecimiento(descrito en la seccin 2.5) sin antibitico e incubadas a
28C por 48 horas. Pasado este tiempo, las clulas se recuperarn por centrifugacin a
3000g y se resuspendern en 5mL de medio de crecimiento con el antibitico G418, a una
concentracin final de 500g/mL. Los cultivos sern incubados por 1 semana a 28C.
Cumplido este lapso los parsitos sern transferidos a un medio de crecimiento sin droga
por 1 semana, repitindose este ciclo hasta obtener poblaciones estables que expresen el
marcador GFP.

26

______________________________________5. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

2015
2016
Abr. May. Jun. Jul. Ago. Sep. Oct. Nov. Dic. Ene. Feb. May
Revisin bibliogrfica
Aislamiento y caracterizacin del
vector
Determinacin de IC50 a G418
Confirmacin de la identidad de la
cepa mediante PCR
Clculo de la viabilidad de los
parsitos electroporados
Presentacin del seminario I
Normalizacin del protocolo de
tranfeccin
Transfeccin
Presentacin del seminario II
Escribir tesis y preparar defensa
Presentacin de TEG

27

_____________________________________________________________6. Factibilidad
La investigacin ser llevada a cabo con recursos y asesora del laboratorio de Fisiologa de
Parsitos del IVIC y as como tambin la disposicin del Laboratorio de Gentica
Molecular del IBE.

28

________________________________________________________7. REFERENCIAS
1. Arias, J., Garca, F., Rivera, M. and Lpez, R. 1997. Trypanosoma evansi in Capibara from
Venezuela. J. Wildl. Dis. 33: 359-361.
2. Akopyants, N.,Kimblin, N., Secundino, N., Patrick, R., Peters N., Lawyer, P., Dobson, D. y
colaboradores. 2009. Demonstration of genetic exchange during cyclical development of
leishmania in the sand fly vector. Science.324: 265-268
3. Asbroek T., Ouellette A., Borst P. 1990. Targeted insertion of the neomycin
phosphotransferase gene into the tubulin gene cluster of Trypanosomabrucei. Nature. 5:
348:174.
4. Berriman M, Ghedin E, Hertz-Fowler C, Blandin G, Renauld H, y colaboradores.2005.The
genome of the African trypanosome Trypanosoma brucei. Science.22: 309:416
5. Beverly, S. 2003.Protozomics: trypanosomatid parasite genetics comes of age. Nature.4:11-19
6. Borst, R, Fase-Fowler, F. and Gibson, W.C. 1987.Kinetoplast DNA of Trypanosoma evansi.
Molecular and Biochemical Parasitology. 23: 31-38.
7. Brun, R.; Hecker, H. and Lun Z.R. 1998. Trypanosoma evansi and Trypanosoma equiperdum:
distribution, biology, treatment and phylogenetic relationship. Vet. Parasitol.79: 95-107.
8. Campelo, R. 2007. Adaptacin de un Sistema de expresin condicional de genes de otros
kinetoplastida a Trypanosomarangeli. Tesis de licenciatura. Universidad Central de Venezuela.
Caracas, Venezuela.
9. Carnes, J., Anupama, A., Balmer, O., Jackson, A., Lewis, M., Brown, R.,Cestari, I. y
colaboradores.2015.Genome and Phylogenetic Analyses ofTrypanosomaevansiReveal
Extensive Similarity to T. brucei and Multiple Independent Origins for
Dyskinetoplasty.PLoSNeglTropDis.9(1): e3404
10. Canavaci, A, Bustamante J, Padilla A, Perez, B., Simpson L., XuD., y colaboradores. 2010.In
vitro and in vivo high-throughput assays for the testing of anti-Trypanosoma cruzi compounds.
PLoS Neglected Tropical Diseases.4:e740.
11. Clayton C. 2002. Life without transcriptional control? From fly to man and back again.EMBO
J21: 1881-1888
12. Cross, G.2008. Tools for genetic analysisin Trypanosomabrucei[enlinea]. The Rockeffeller
University.http://tryps.rockefeller.edu/trypsru2_genetics.html. [Consultado :3 junio 2015]
13. El-Sayed N, Myler P, Bartholomeu D, Nilsson D, Aggarwal G y colaboradores. 2005. The
genome sequence of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease. Science. 309: 409415.
14. Forlano, M., Melndez, R., Caneln, J.2011.seropositividad a Trypanosoma evansi en caballos
criollos infectados naturalmente en tres hatos del estado apure. fcv-luz.22:131-136

29

15. Guevara, P., Dias, M., Rojas, A., Crisante, G., Abreu-Blanco, M., Umezawa, E. y
colaboradores. 2005 Expression of fluorescent genes in Trypanosomacruzi and
Trypanosomarangeli (Kinetoplastida: Trypanosomatidae): its application to parasite-vector
biology. Journal of Medical Entomology.42:4856.
16. Hara, T., Yasuda, K., Fukuma, T. 2002. Effective gene transfer into Trypanosoma brucei
bloodstream forms by particle bormbardment. Mol Biochem Parasitol. 9:117:119.
17. Hoare, C. 1965. Vampire bats as
trypanosomes.ActaTropica. 22, 204216.

vectors

and

hosts

of

equine

and

bovine

18. Hoare, C. 1972. The Trypanosomes of Mammals: A Zoological Monograph, Blackwell

Scientic Publications,Oxford.
19. Hunt, S.V. 1987. Preparation of Lymphocites and accesory cells. Lymphocyte a Practical
Approach. G.C.B. Klausirl Press. UK.
20. Joshi P., Shegokar V., Powar R., Herder S., Katti R., Salkar H., Dani V. 2005. Human
trypanosomiasis caused by Trypanosomaevansiin India: the first case report. Am J Trop Med
Hyg.Sep;73(3):491-5
21. Kaminsky, R., Zweygarth, E. 1989. Feeder layer-free in vitro assay for screening
antitrypanosomal compounds against Trypanosomabruceibrucei and T. b. evansi. Antimicrob.
Agents Chemother. 33: 881
22. Lanham, S., Williams, J.,Godfrey D.1972.Detection of low concentrations of trypanosomes in
blood by column-separation and membrane-filtration. Trans R SocTropMed Hyg.66:4
23. Lebowitz, J., Coburn, C., Beverley, S. 1991. Simultaneous transient expression assays of the
trypanosomatid parasite Leishmania using beta-galactosidase and beta-glucuronidase as
reporter enzymes. Gene. 103:11923.
24. Li F., Gottesdiener KM.1996. An efficient method for stable transfection of bloodstream-form
Trypanosomabrucei. Nucleic Acids Res 5: 24:34.
25. Liang, X., Haritan, A., Uliel, S., Michaeli, S. 2003. Trans and cis splicing in trypanosomatids:
mechanism, factors, and regulation. Eukaryot Cell. 2:830-840.
26. Luckins, A. 1998. Epidemiology of surra: Unanswered questions. J. Protozool.Res. 8:106-119.
27. Luckins, A. 1999. Epidemiology of non-tsetse-transmitted tripanosomiasis-Trypanosoma
evansi in perspective. Newsletter on Integrated Control of Pathogenic Trypanosomes and their
Vectors. No. 1. (http://www.icpt.org/Newsletters/Newsletters1/newsletters1.html).
28. Lun, Z., Desser, S., 1995. Is the broad range of hosts and geographical distribution of
Trypanosoma evansi attributable to the loss of maxicircle kinetoplast DNA? Parasitology.
Today. 11: 131133
29. Martinez-Calvillo, S., Yan, S., Nguyen, D., Fox, M., Stuart, K., Myler, P. 2003. Transcription
of Leishmania major Friedlin chromosome 1 initiates in both directions within a single
region.Mol Cell. 11:1291-9.

30

30. McCulloch, R., Vassella, E., Burton, P., Boshart, M., Barry, J. 2004. Transformation of
monomorphic and pleomorphic Trypanosoma brucei. Methods in molecular biology.5386.
31. Ngo, H., Tschudi, C., Gull, K., Ullu, E. 1998. Double-stranded RNA induces mRNA
degradation in Trypanosomabrucei. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:14687.
32. Njiru, Z., Constantine, C., Masiga, D., Reid, S., Thompson, R., Gibson, W. 2006.
Characterization of tripanosoma evansi type B.Infect Genet Evol. 6:292-300
33. Parra, N. 2011. Anlisis secretmico y protemico de aislados de Trypanosomaevansi con
virulencia diferencial. Tesis doctoral.Universidad Simn Bolvar. Caracas. Venezuela.
34. Perrone, T.M. 2003. ''Tipificacin de aislados venezolanos de Trypanosomaevansi''. Tesis
Doctoral. Universidad Simn Bolvar.
35. Sambrook, J.,.Fritsch,F. and Maniatis,T. Molecular cloning: A laboratory manual: 2nd ed..
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
36. Sommer, J., Cheng, Q., Keller GA, Wang CC. 1992. In vivo import of firefly luciferase into
the glycosomes of Trypanosomabrucei and mutational analysis of the C-terminal targeting
signal. Molecular Biology of the Cell. 37:4959.
37. Stephen, L., 1986. Trypanosomiasis, A Veterinary Perspective. Pergamon Press, Oxford.
38. Stevens, J., Noyes, H., Schofield, C., Gibson, W. 2001. The molecular evolution of the
Trypanosomatidae. Advances in Parasitology. 48: 1-56.
39. Tejero, F.,Brun, S.,Roschman-Gonzalez,A.,Perrone-Carmona,T.M.,Aso,P.M.,Velasco,E.
&Finol,H.J. 2009. Trypanosoma evansi: Analysis of the ultraestrucural change in hepatic cells
during murine experimental infections. Acta Microscopica. 18:28-32
40. World-Health-Organisation. 2010. Working to overcome the global impact of neglected
tropical diseases. Geneva, Switzerland

31