LABORATORIO 3: TRANSFORMACIN

GENTICA

Cdigo:
Vigencia:
Rev.:

BIOPINGALL01
30.04.2010
01

Ramo: Laboratorio de Ingeniera de Bioprocesos

Facultad Tecnolgica
Carrera: Ingeniera de Alimentos
Departamento de Ciencia y Tecnologa de los
Universidad de Santiago de Chile
Alimentos
Editado por los profesores: ngela Contreras, Sergio Aguilera

1. INTRODUCCION
La obtencin de organismos modificados genticamente considera la incorporacin de
ADN con las caractersticas deseadas mediante experimentos denominados de
transformacin gentica. Este proceso se realiza naturalmente en muchos
microorganismos que tienen la capacidad de presentar un estado natural de
competencia para la incorporacin de ADN exgeno. Sin embargo, otros carecen de
sistemas naturales de transformacin. Por ello, en los ltimos aos se ha logrado
desarrollar sistemas artificiales para producir "clulas competentes" en algunas de
ellas(como

Escherichia

coli,

Salmonella

typhimurium

algunas

especies

dePseudomonas), lo cual ha hecho avanzar los estudios genticos, especialmente

mediante manipulaciones in vitro: por ejemplo, la transformacin artificial de E. coli con
ADN plasmidial es una de los mtodos bsicos en biotecnologa.
Una de las tcnicas ms utilizadas es la transformacin gentica mediante choque
trmico, en el cual se obtienen clulas competentes en E. coli, para esto se concentra
un cultivo recogido en fase exponencial, mediante lavados sucesivos en una solucin
fra (4C) de cloruro de calcio, y posteriormente la mezcla de clulas y ADN se
someten a un proceso trmico (42C por 2 min). Este tratamiento altera las
membranas que envuelven las clulas (sobre todo la membrana externa) y aumenta
su permeabilidad al ADN exgeno. Los plsmidos entran generalmente a la clula
conservando su forma circular, por lo que este ADN no es degradado por las
endonucleasas citoplasmticas, mientras que los ADN lineales si son degradados.
Los transformantes en general se seleccionan en base a la resistencia a algn o
algunos antibiticos, resistencia conferida por los plsmidos artificiales y/o por la
expresin de algn fenotipo contenido en los genes del plsmido (ej. betagalactosidasa). En otras bacterias (Por ejemplo en ciertas Gram-positivas) el mtodo
consiste en obtener protoplastos en medio hipertnico, y un posterior tratamiento de
stos mezclados con el ADN exgeno con un agente como el polietilnglicol, lo cual
fomenta la fusin de protoplastos y el ingreso de tal ADN.
Recientemente se ha introducido la tcnica de la electroporacin, donde las clulas

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libre de sales (electrocompetentes) se someten a cortos pulsos de corriente elctrica

de alto voltaje, lo cual altera las membranas y permite la incorporacin de ADN en una
amplia variedad de bacterias, tanto Grampositivas como Gram-negativas

2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Transformar E. coli por medio de electroporacin.
2.2 Objetivos especficos
Entender los fundamentos de la transformacin por electroporacin.
Observar los cambios fenotpicos de las clulas transformadas.

3. ACTIVIDADES
3.1 Transformar E. coli utilizando plsmido pBluescript SK
3.2 Analizar las clulas transformadas mediante medios de cultivo selectivos.
3.3 Evaluar la produccin de una enzima, cuyo gen es insertado por medio de
transformacin.

4. MATERIALES
Clulas electrocompetentes de E. coli (cepa DH5 alfa), Plsmido pBlueScript SK,
Pipetas, Micropipetas, Medio LB lquido, Medio de cultivo LB con ampicilina y X-Gal (5Bromo-4-cloro-3-indolil

alfa-D-galactopiranosido),

Electroporador,

Cubetas

para

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electroporar, Tubos Eppendorf, Puntas para micropipetas, Agua ultra pura, Etanol.

5. PROCEDIMIENTOS
Todo el procedimiento se debe realizar manteniendo estrictas medidas de esterilidad,
para evitar contaminar sus resultados.
5.1 Transformacin de la bacteria Escherichia coli con el plsmido pBlueScript
SK
1. Deposite en dos cubetas de electroporacin 50 L de clulas competentes de la
bacteria E. coli DH5 alfa.
2. Agregue 2 L del plsmido a una de ellas y 1 L de agua ultra pura a la otra.
3. Mezclar bien, utilizando la micropipeta.
4. Encienda el equipo, seleccione el modo bacteria y el programa de operacin EC1.
5. Ubique una a una las cubetas en el equipo para electroporar.
6. Presione pulse para activar el pulso elctrico.
7. Registre los valores de voltaje y tiempo de aplicacin del pulso elctrico.
8. Retire la cubeta y agregue 1 mL de medio de cultivo lquido LB a cada cubeta.
9. Mezclar bien, utilizando la micropipeta, para arrastrar la totalidad de clulas.
10.Transfiera cada suspensin a un tubo eppendorf estril debidamente rotulado.

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11.Incube los tubos a 37 C por 30 minutos.

12.Tome 0,1 mL de cada transformacin y depostelos sobre placas de medio LB que
contienen ampicilina y x-gal. Rotule las placas correctamente.
13.Incube las placas a 37C hasta la prxima sesin.
5.2 Anlisis de resultados
1. Cuente el nmero de colonias que aparecen en cada placa.
2. Calcule la frecuencia de transformacin como UFC por cantidad de ADN utilizado
para transformar.
3. Anote las caractersticas de las colonias transformadas.

6. SESIONES
6.1 Primera sesin
1. Realizar la transformacin de E. coli por medio de electroporacin..
6.2 Segunda sesin
1. Evaluar los resultados obtenidos de la transformacin.