Prctica No. 5.

Filtracin por membrana para la

determinacin de Coliformes totales, coliformes fecales y
Estreptococos fecales.

MICROBIOLOGA DE LOS ALIMENTOS

EQUIPO No.4

INGENIERA BIOQUMICA
PRACTICA #5

PROFESOR:M.C. Miguel ngel Daz Alday.

INTEGRANTES:

BIVIANO YEVALES BRAYAN

GONZALES CASTRO GABRIEL
REBOLLEDO ALARCON MIGUEL NGEL
SANTIAGO RUEDA CELENE
VALENTE RODRIGUEZ JESUS ALBERTO

FECHA DE ENTREGA: 11 DE MARZO DEL 2015

NDICE
PROBLEMA.......3
FUNDAMENTO....3
HIPOTESIS....3
OBJETIVOS...3
INTRODUCCIN..........3
MARCO TERICO........4
MATERIAL Y EQUIPO...12
PROCEDIMIENTO.12
RESULTADOS...13
DISCUSIN DE RESULTADOS.....14
CONCLUSIN...14
GLOSARIO.....15
BIBLIOGRAFA...16

PROBLEMA:
La presencia de bacterias patgenas en el agua destinada al consumo humano es un
riesgo siempre presente, que se incrementa en las reas de mayor densidad de la
poblacin. La tcnica de filtracin por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra
de agua problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie
quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan membranas que tienen un tamao de
poro de 0.45 micras ya que la mayora de los microorganismos tienen un tamao superior
(dimetro).
La normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable de consumo
pblico establece como anlisis microbiolgicos a realizar las determinaciones de:
coliformes totales, coliformes fecales, grmenes totales, estreptococos fecales y
clostridios sulfito-reductores. El nmero de determinaciones se establece para cada tipo
de anlisis, si este es mnimo, normal o completo.

FUNDAMENTO
En la tcnica de filtracin por membrana, el grupo coliformes se define como todas las
bacterias aerbicas y anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas que
desarrollan una colonia roja con brillo metlico dentro de 24 horas de incubacin en un
medio tipo Endo conteniendo lactosa. El grupo coliformes produce aldehdos por la
fermentacin de la lactosa.
E. coli bacteria perteneciente al grupo coliformes, que en un medio adecuado y a una
temperatura restrictiva de 44,5 C +/- 0,2C, fermenta la lactosa produciendo cido, gas,
posee actividad -D-glucoronidasa y actividad triptofanasa. Son negativas a la actividad
oxidasa y ureasa.

OBJETIVOS:
Este mtodo se utiliza para medir la calidad sanitaria del agua potable. Se aplica a
agua clorada o agua naturales de muy baja contaminacin y sin turbidez.
Al finalizar, el trabajo prctico, el estudiante estar en capacidad, mediante la
consulta bibliogrfica y la aplicacin de las tcnicas microbiolgicas, de realizar el
control microbiolgico del agua de proceso, utilizando la tcnica de la Membrana
Filtrante.

INTRODUCCION
La presencia de bacterias patgenas en el agua destinada al consumo humano es un
riesgo siempre presente, que se incrementa en las reas de mayor densidad de la
poblacin. La tcnica de filtracin por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra
de agua problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie
quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan membranas que tienen un tamao de
poro de 0.45 micras ya que la mayora de los microorganismos tienen un tamao superior
(dimetro).
La normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable de consumo
pblico establece como anlisis microbiolgicos a realizar las determinaciones de:
coliformes totales, coliformes fecales, grmenes totales, estreptococos fecales y
clostridios sulfito-reductores. El nmero de determinaciones se establece para cada tipo
de anlisis, si este es mnimo, normal o completo

MARCO TEORICO
La presencia de bacterias patgenas en el agua destinada al consumo humano es un
riesgo siempre presente, que se incrementa en las reas de mayor densidadde la
poblacin. La tcnica de filtracin por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra
de agua problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie
quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan membranas que tienen un tamao de
poro de 0.45 micras ya que la mayora de los microorganismos tienen un tamao superior
(dimetro).
La normativa para abastecimiento y control de calidadde agua potable de consumo
pblico establece como anlisis microbiolgicos a realizar las determinaciones de:
coliformes totales, coliformes fecales, grmenes totales, estreptococos fecales y
clostridios sulfito-reductores. El nmero de determinaciones se establece para cada tipo
de anlisis, si este es mnimo, normal o completo.
FILTROS DE MEMBRANA
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Los filtros de membrana son filtros de superficie, que muestran una estructura
microporosa precisa. Durante la filtracin las partculas mayores que los poros de la
membrana son retenidas de forma fiable en la superficie de la misma. Las particulas ms
pequeas pueden pasar el filtro.
Filtracin a travs de membrana

El nmero de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante la filtracin

de volmenes especficos de la muestra a travs de filtros de membrana. Por lo general,
estn compuestos de steres de celulosa, tpicamente con poros de 0,45 mm de dimetro
que retienen los coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra.
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Despus se incuban las membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. En la

prctica, la tcnica de filtracin de membrana ofrece resultados comparables a los que se
obtienen con el mtodo de tubos mltiples.
Una de las ventajas del mtodo de filtracin a travs de membrana es la prontitud con que
pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo
rpidamente acciones correctivas y operar en la planta de agua de nuevo en forma
normal. Esta tcnica puede aplicarse en el anlisis de casi todos los tipos de agua,
tambin se utiliza en el anlisis de leche y otros alimentos lquidos.
El anlisis bacteriolgico del agua es vital en la prevencin de epidemias como resultado
de la contaminacin del agua. El examen bacteriolgico de abastecimientode agua no
implica la bsqueda directa de los grmenes patgenos. El ensayo se basa en el
supuesto de que todas las aguas contaminadas con desechos humanos o animales son
potencialmente peligrosas.
Por consiguiente, el control sanitario del agua se hace con mtodos bacteriolgicos para
determinar la presencia de contaminacin fecal. Las pruebas para la determinacin de
patgenos no se usan rutinariamente debido a que detectarlos en diluciones altas es muy
difcil y adems se encuentran en nmero muy inferior al de las bacterias entricas, las
cuales tienen una tasa de mortalidad mucho ms lenta.

El examen bacteriolgico del agua usualmente

involucra dos ensayos: la estimacin del nmero de
bacterias de acuerdo con el conteo total en placa y
la determinacin, ms significativa, de la presencia o
ausencia de miembros del grupo coliforme.
El grupo coliorme incluye a todas las bacterias en
forma de bastoncillos que son aerobias o anaerobias
facultativas, Gram negativas, no esporogneas, que
fermentan la lactosa con produccin de gas en un
medio de cultivo prescrito en un perodo de 48
horas, a 35 C.
El

nmero

de

organismos

coliformes

en

el

excremento humano es muy grande; la excrecin

diaria

por

habitante

400x109nmeros

de

vara
unidades

entre

125x109y

formadoras

de

colonias. Su presencia en el agua es considerada

como un indicadorde contaminacin fecal y por lo tanto,de contaminacin con organismos
patgenos. En aguas residuales la relacin de organismos coliformes con organismos
entricos patgenos es muy grande, del orden de 106/1.
Los coliformes no solamente provienen del excremento humano sinotambin pueden
encontrarse en los desechos de animales de sangre caliente, animales de sangre fra y en
el suelo. Por lo tanto, la presencia de coliformes en aguas superficiales indica
contaminacin proveniente de residuos humanos, animales o erosin del suelo
separadamente, o de una combinacin de las tres fuentes. Aunque no es posible distinguir
entre coliformes de origen humano o animal, existe un ensayo especial para diferenciar
entre coliformes fecales y coliformes del suelo. Para el efecto, se usa unmedio de cultivo
EC para incubacin a 44.5 C durante 24 hr. Este ensayo no reemplaza la tcnica usual,
pero es aplicable en estudios de contaminacin de ros, fuentes de agua cruda, sistemas
de tratamiento de aguas residuales y aguas para recreacin.
Para determinar la presencia de bacterias del grupo coliforme se aceptan dos mtodos: el
mtodo de los filtros de membrana y el mtodo de los tubos mltiples de fermentacin.
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Tcnica del Filtro de Membrana

Todos los organismos que producen una colonia oscura, generalmente verde prpura con
brillo metlico, despus de incubacin por 24 horas, en medio de cultivo ENDO son
considerados miembros del grupo coliforme. El brillo metlico puede cubrir la colonia
entera o aparecer solamente en la parte central o en la periferia. La cantidad ideal de
muestra que se ha de filtrar debe ser aquella que produzcauncrecimiento de mximo 30
colonias de coliformes. Cuando se filtran porciones de menos de 20 ml, la muestra debe
diluirse y filtrarse un volumen mnimo de 30 ml.
Los filtros preparados se colocan directamente sobre el medio nutriente y se incuban,
normalmente, durante 24 horas, a 37 C 35 C.
El procedimiento consiste en hacer pasar a travs de un filtro de membrana, aplicando
vaco, un volumen medido de muestra de agua. A continuacinse coloca el filtro en un
recipiente estril y se incuba en contacto con un medio de cultivo, selectivo y diferencial.
En cada punto del filtro en el que durante la filtracinse capta una bacteria coliforme, se
desarrollar una colonia de bacterias coliformes. Se enumeran las colonias bacterianas,
practicndose un clculo simple para determinar el nmero de colonias de bacterias en
100 ml de muestra.
Volumen de agua analizada
El volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas
envasadas, en las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en
aguas superficiales y en general en aguas naturales sin tratar, el nmero de bacterias en
100 ml puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares. La siguiente tabla
proporciona unos datos que pueden servir de orientacin:

Tipos de agua

Coliformes totales

Potable de consumo pblico

100 ml

Envasadas

250 ml

Manantiales

15; 60; 100 ml

Lagos, depsitos

4; 15; 60; 100 ml

Acometidas

0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml

De playas

0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml

De ros

0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml

Residuales cloradas

0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml

Residuales sin tratar

0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml

Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente aadiendolas al

embudo de filtracin. Para muestras entre 1 y 30 ml, se aaden primero al embudo 20-30
ml de solucin tamponada estril y, encima de ella, se vierte la muestraa a filtrar.
Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones con
solucin tamponada estril.

Preparacin de diluciones
Para realizar una dilucin 1/10 (101

), se pipetea aspticamente 1 ml

de muestra en un tubo con 9 ml de

solucin tamponada estril y se

Muestra
1 ml

Diluyente
9 ml

Dilucin
1/10 (10-1)

agita.
Para realizar una dilucin 1/100
(10-2), se pipetea 1 ml de la
dilucin 1/10 en otro tubo con 9 ml
de solucin tamponada estril y se

Dilucin
1/10 (10-1)

Diluyente
9 ml

Dilucin
1/100 (10-2)

agita.

As sucesivamente se van haciendo las diluciones que se necesiten, dependiendo del grado
de contaminacin esperado de la muestra.

TOMA DE MUESTRA
La tcnica de muestreo depende del lugar donde se realiza dicho muestreo, para conocer
los detalles sobre la toma de muestras de aguas para anlisis microbiolgicos haga clic
sobre esta frase.

AGAR ENDO
Endo describi el desarrollo de un medio de cultivo para diferenciar entre
microorganismos fermentantes y no fermentantes de la lactosa. Durante aos el agar
Endo ha sido un importante medio para el examen microbiolgico del agua potable y
residual, los productos lcteos y los alimentos; no obstante, el compendio actual de
mtodos estndar para analizar estos elementos recomienda las formulaciones de otros
medios.
El medio se utiliza an en microbiologa clnica y en otros sectores para elaislamiento y la
diferenciacin de la familia
Enterobacteriaceae.
La selectividad del agar Endo se debe a la combinacin del sulfito de sodio con fucsina
bsica, lo cual ocasiona la supresin parcialde los microorganismos gram-positivos. Los
coliformes fermentan la lactosa, produciendo colonias color rosa oscuro a rojizo con un
brillo metlico verdoso iridiscente y una coloracin similar en el medio. Las colonias de
microorganismos que no fermentan la lactosa son incoloras o de color rosa plido en
contraste con el fondo rosa claro del medio.
El agar Endo es un medio de cultivo diferencial y ligeramente selectivo utilizado para la
deteccin de coliformes y otros microorganismos entricos.

Colonias tpicas

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Los coliformes fermentadores de lactosa producen colonias rosadas a rojas, mientras que
las colonias de los microorganismos que no pueden fermentar este carbohidrato son
incoloras o rosado plido.
Las colonias tpicas de E. colien el Agar Endo son rosadas con un brillo verde metlico
caracterstico, debido a la elevada produccin de cidos y aldehdos como producto de la
fermentacin de la lactosa.

ENTEROCOCCS AGAR
Es un medio selectivo para el aislamiento y el recuento de estreptococos fecales (grupo
D) a partir de muestras clnicas.
El medio es una frmula estndar para el aislamiento de enterococos

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Dos peptonas proporcionan los nutrientes. Los estreptococos del grupo D (incluidos los
enterococos) hidrolizan la esculina para formaresculetina y glucosa. La esculetina
reacciona con una sal frrica para formar un complejo marrn oscuro o negro. Se incluye
el citrato frrico como indicador, que reacciona con la esculetina para producir un
complejo de marrn a negro.
Se utiliza bilis de buey para inhibir las bacteriasgram positivas diferentes de los
enterococos. La azida sdica inhibe losmicroorganismosgram negativos.

MATERIALES:

cajas de petrimillipord
Membranas filtrantes de 0,45 m de tamao de poro
Soporte del filtro con embudo
Sistema de vaco
Pipetas estriles de 10 y 1 ml.
Pinzas estriles
papel filtro
muestra de playa la angosta

PROCEDIMIENTO
Colocar un filtro de membrana estril sobre el soporte de filtracin.

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Adaptar el embudo y conectar el matraz a una bomba elctrica de vaco. Filtrar 100 ml de
muestra si se trata de agua potable, y 0,1 y 1 ml si se trata de aguas no potables,
previamente homogeneizadas.

Lavar con unos 30 ml de agua destilada.

Retirar el embudo.
Mediante las pinzas esterilizadas, transferir la membrana filtrante sobre losmedio de
cultivo contenido en dos cajas millipor, de modo que la superficie de filtracin quede hacia
arriba. Cerrar y esperar a que el filtro se adiera bien al medio, despus invertir ambas
placas e incuba una a 44C (+/-1C ) durante 24h y la otra a 35 +/- 2C.

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Se filtran 100 ml del agua a analizar previamente homogeneizada.

Se coloca el filtro de membrana sobre el medio KF se cierra la placa y se espera a que el

filtro membrana ase adiera bien al medio. Se invierte la placa y se incuban a 37C
durante 24 h.

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Se utiliza para la determinacin del nmero de estafhylococcus faecalis mediante

filtracin de un volumen determinado del agua a analizar a travs de filtros de membrana
e incubacin de los mismos sobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.

Hoja de campo
Muestra
Lugar de recoleccin
fecha
Receptor
Nota

Agua de playa
Playa l a angosta, Acapulco, Gro.
Santiago Rueda Celene.
Se tom la muestra de la playa ,

RESULTADOS:
En la determinacin de estafhylococcus fecalis obtuvimos resultados abundantes de
colonias que se desarrollaron en el tipo de agar KF por lo cual fue considerada
incontables para nosotros debido a que esta bacteria se encontraba en abundancia en la
muestra.

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Para la determinacin de coliformes totales y fecales donde se utilizo el medio agar EMB
los resultados fueron negativos debido a que no se desarrollo ninguna colonia tanto para
coliformes totales y fecales.

DISCUSIN DE RESULTADOS:
La muestra analizada fue extrada de la playa la angosta Acapulco, guerrero la cual fue
trasladada en frascos estriles para su anlisis. Posteriormente se llevaron a cabo tres
filtraciones de 100 ml de muestra, una en la caja con agar KF donde se desarrollaran
estafhylococcus fecalis, los resultados fueron colonias masivas con un color amarillo
crema y de buen tamao de formacin y en abundancia, debido a esto se consideraron
incontables por haber obtenido un crecimiento masivo y esparcido en el filtro membrana,
asiendo de esta manera imposible contar las colonias en el estereomicroscipio. En las
siguientes filtraciones realizadas donde se utilizo el medio de agar EMB para coliformes
totales y fecales, los resultados fueron negativos debido a que no obtuvimos ninguna
colonia tanto para coliformes totales como para fecales.

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CONCLUSIONES
Se determins Streptococcus fecalis en la muestra de agua de playa la angosta
Acapulco Gro; lo cual es es indicativo de que existe una contaminacin constante
y abundante en esta playa debido a que cualquier microorganismo que es capaz
de soportar altas concentraciones de sal como lo es dicha bacteria, solo puede
habitar en ella alrededor de 20 minutos para despus pasar a la fase de muerte,
es por eso que llegamos a la conclusin de que la fuente de contaminacin que conlleva
a esta playa es a menudo constante.

En la determinacin de coliformes totales y fecales los resultados fueron negativos para

ambos coliformes ,pensando en el tipo de estacin en que nos encontramos (invierno)
, las temperaturas podran no ser las
bacterias

adecuadas para el desarrollo de este tipo de

indicadoras de fuentes de contaminacin.

GLOSARIO
Coliforme:
La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que
tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como
indicadores de contaminacin del agua y los alimentos.

Clostridios:
Bacilos mviles, grampositivos y anaerobios. Crecen en el suelo, las cloacas,
sedimentos marinos, vegetacin en descomposicin, productos de animales y
vegetales, el tracto gastrointestinal del hombre, otros vertebrados e insectos. La
mayora de las especies que viven en el hombre son comensales inofensivos que
pueden convertirse en patgenos oportunistas.
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Esculina:
Es un glucsido txico que se encuentra en el fruto del castao de Indias
(Aesculushippocastanum) y en el Falso castao de California (Aesculuscalifornica). Los
efectos que produce su ingesta son: espasmos, dolor de estmago, diarrea,
desorientacin e incluso la muerte
Esporognesis, Dentro del ciclo de vida haplo-diplonte, es la parte en la que se producen
las microsporas y megasporas. Son producidas por el esporfito, diploide, que por meiosis
produce una ttrade de esporas haploides.
Fermentacin lctica:Es una ruta metablicaanaerbica que ocurre en el citosol de la
clula, en la cual se oxida parcialmente la glucosa para obtener energa y donde el
producto de desecho es el cido lctico.
Organismos entricosLas bacterias del grupo entrico forman un conjunto de
microorganismos muy heterogneo (el contenido de G+C del grupo vara del 40 al 60%)
cuya caracterstica comn ms relevante es ser anaerobios facultativos: desarrollan un
metabolismo respiratorio en condiciones aerobias y un metabolismo fermentativo en
anaerobias. Slo algunos miembros del grupo son capaces de respirar NO 3- aunque esta
no es una caracterstica general del grupo.

BIBLIOGRAFIA
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