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MICROBIOLOGIA GENERAL

COLORACIONES

I.

INTRODUCCION

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles


de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el
contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para
distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas,
paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo
ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el
colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma.
La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un
portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el
encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas
aparezcan mayores de lo que son realmente, de manera que las medidas de
las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha
precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna
afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados
con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se
combinan

con

intensidad

con

los

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constituyentes

celulares

cargados

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negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos.
Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la
safranina.
Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se
combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como
muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo
Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de
este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a
menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un
ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido
tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta
sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El
mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que
ahora s podr atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la
microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de
metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas
bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca
los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de
bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no
celular no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las
clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea.
Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para
la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los
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constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta
china (que es una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina
(un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo
satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica,
pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de
las clulas bacterianas
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante
forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras
celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales
inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y
deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos
estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente
existente.

Marco terico
Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas
tcnicas de tincin. Los mordientes intensifican la tincin porque aumentan la
afinidad de la clula por el colorante. Tambin se pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que
debido a su delgadez no podran ser visualizados de otra forma,
Existen tres tipos de tcnicas de tincin: simples, diferenciales y especficas:

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Tinciones simples: En las tinciones simples se usa un nico colorante, que
siempre es de tipo bsico. Se utilizan solamente para incrementar el contraste;
todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Por
tanto, la tincin simple mejora la observacin de la clula completa. Se fija el
espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se
absorba, se retira el exceso de colorante y la preparacin ya est lista para ser
observada. Si se utiliza un mordiente, hay que aadirlo justo antes del colorante.
Tinciones diferenciales: Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir
entre tipos de microorganismos. La tcnica de tincin diferencial consta de dos
etapas: una tincin primaria (siguiendo el mismo mtodo que en una tincin
simple) seguida de una tincin de contraste. En la tincin de contraste se utiliza
otro colorante que tie (y por tanto, revela) las clulas no teidas por el primer
colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiologa. Por ejemplo, la
tincin de Gram y la tincin de cido-alcohol resistencia, ambas aplicadas a
bacterias.
La tincin de Gram La tcnica de la tincin de Gram fue desarrollada por el
bacterilogo dans Christian Gram en 1884. Esta tincin clasifica las bacterias en
dos grupos: Gram positivas y Gram negativas La tcnica incluye tincin primaria,
decoloracin y tincin de contraste:

1. Se tie el espcimen con el primer colorante, cristal violeta, que tie de violeta.
2. Se aade el mordiente, yodo.

3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solucin de acetona o


etanol. En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tincin violeta,
pero las Gram positivas retienen el colorante.

4. Como colorante de contraste se aade safranina, que tie de rosa las bacterias
Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram
positivas les proporciona un color violeta ms intenso.
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Una tincin acido-alcohol se realiza segn los siguientes pasos

1. Tincin primaria con fucsina bsica, que tie todas las clulas de rojo.
2. Calentamiento suave de la preparacin para facilitar la penetracin del
colorante en el interior de la clula.
3. Decoloracin con una solucin de cido clorhdrico en etanol. Este decolorante
elimina la fucsina de todas las clulas excepto de las micro bacterias, que la
retienen debido a su superficie crea.

4. Coloracin de contraste con azul de metileno. Se tien de azul todas las clulas
previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciacin entre las clulas
deMycobacterum, an teidas de rojo, v las clulas restantes del espcimen.
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/docu
men/uni_02/56/cap305.htm

Objetivos

Reconocer los dos grandes grupos de bacterias existentes por el mtodo de


coloracin diferencial.
Demostrar la tincin de las esporas en contraste en una clula vegetativa.

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II.
MATERIALES Y METODOS
Materiales
Coloracin de Gram

Cultivo Escherichia Coli y Streptococcus.


Porta objetos.
Cristal violeta.
Lugol.
Alcohol-cetona.
Safranina.
Microscopio.

Coloracin de esporas

Verde de malaquita.
Safranina.
Pinzas de madera
Mechero de alcohol
Microscopio.
Asa de kelle

Mtodos
Coloracin de Gram
Colocar un medio liquido con bacterias sobre un porta objetos limpio, en
caso de que tratarse de una muestra solida colocar previamente una gota
de agua destilada estril sobre el portaobjetos y extender la muestra.
Fijar la muestra al aire o pasndola por encima de la llama de un mechero.
Despus de la fijacin de la muestra cubrirla con la solucin de cristal de
violeta.
Lavar con agua a chorro
Cubrir con lugol i dejar actuar de 2 a 3 minutos.
Lavar.
Decolorar con el alcohol-cetona hasta que se desprenda el colorante de la
lmina.
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Lavar.
Contrastar con safranina d30 segundos.
Lavar, secar y observar.

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Coloracin
diferencial

de

Hacer
la
bacteriana y
color.
Aadir verde

malaquita.
Calentar sin hervir hasta el desprendimiento de vapor por 3 veces.
Lavar.
Agregar safranina.
Lavar secar y observar.

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esporas.
extensin
fijar
al
de

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III.

RESULTADOS

Coloracin de Gram
ESCHERICHIA COLI
Despus de la coloracin se observ al microscopio y se
vio que los grmenes han cedido al color rojo por accin del alcohol-cetona y por
haber quedado sin coloracin han estado aptos para tomar el segundo color que
es el rojo por lo tanto son GRAM NEGATIVO.

STREPTOCOCCUS
Despus de la coloracin se observ al microscopio y se vio que los grmenes han
quedado teidos de color azul por los que son GRAM POSITIVOS

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Coloracin

diferencial de esporas

BACILLUS SUBTILLUS.
Despus de la coloracin se observ al microscopio y se vio la formacin de
esporas que eran de color verde y la presencia de clulas vegetativas que eran de
color rojo.

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IV.

DISCUSIONES

La tincin de Gram es la tincin diferencial ms utilizada de forma rutinaria y


prcticamente la primera prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen
antes de su estudio. Proporciona una informacin esencial, adems de sobre la forma,
tamao y agrupacin celular, como es el tipo y composicin de la pared que presentan
las bacterias. La tincin de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en
dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva y bacterias con pared de
tipo gram negativa. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma
distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares.
La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como
para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere
rigidez es el pptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en
varias capas interconectadas de pptidoglicano as como algo de cido teicoico.

TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L. 2007. Introduccin a la Microbiologa, 9


Ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
La tincin de Gram como qued demostrado en el laboratorio y como se confirma
en el anterior prrafo, sirve para diferenciar si las bacterias son gram + o gram -,
por lo cual se debe realizar los pasos bsicos a aplicar sobre la muestra para
determinar en qu categora se encuentra y estos pasos fueron explicados en
clase, con lo cual se puede afirmar que su uso es universal y que ninguno varia,
ya que se sigue el mismo orden especfico. Se puede concluir, que gracias a esta
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tincin se pueden dividir las bacterias en dos grandes categoras ya antes
mencionadas, y por ende se puede saber las caractersticas que posee cada
grupo, y gracias a estas se puede reconocer al momento de la realizacin del
experimento, con qu tipo de bacteria se est trabajando.
Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en
su interior formas de resistencia denominadas esporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas
extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma
vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la
espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una
nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. La tincin
especfica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.


2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con
agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo
colorante.
GAMAZO, C.; LPEZ-GOI, I., R. DAZ. 2005. Manual prctico de microbiologa.
Masson. Barcelona
Como se entiende del anterior prrafo existe un mtodo para poder observar las
esporas, el cual fue explicado en el laboratorio, con lo que se puede concluir que
este mtodo se aplica de forma universal, y que sus componentes o sus pasos a
seguir y los materiales a utilizar, son los mismos que se expusieron y se realizaron
en clase.

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V.

REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS

TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L. 2007. Introduccin a la


Microbiologa,

Ed.

Editorial

Mdica

Panamericana.

Buenos

Aires.

Argentina.
GAMAZO, C.; LPEZ-GOI, I., R. DAZ. 2005. Manual prctico de

microbiologa. Masson. Barcelona


http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen
/uni_02/56/cap305.htm

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