TEMA 12

Identificacin microbiana (I):

mtodos convencionales y mtodos
rpidos (manuales y automatizados)

Tema 15. Identificacin microbiana:

mtodos bioqumicos
1. Esquema general de identificacin microbiana
2. Mtodos convencionales
2.1. Pruebas bioqumicas
3. Mtodos rpidos
3.1. Sistemas manuales
3.1.1. API
3.1.1.1. Lectura e interpretacin de los resultados
3.1.1.2. Diferentes tipos de galeras API
3.1.1.3. Sistema ATB (API automatizado)
3.1.2. Enterotubo
3.1.2.1. Lectura e interpretacin de los resultados
3.2. Sistemas automatizados
3.2.1. Abac-Abactor II
3.2.1.1. Procedimiento
3.2.2. Vitek
3.2.2.1. Procedimiento

1. Esquema general de identificacin microbiana

Muestra
Microscopio (fresco/tinciones)
Pruebas inmunolgicas
Pruebas genticas
Aislamiento
(medios selectivos)

Cultivo puro

1. Esquema general de identificacin microbiana

Cultivo puro

Microscopio (fresco/tinciones)
Pruebas bioqumicas
Pruebas inmunolgicas
Pruebas genticas

Pruebas de
sensibilidad a
antibiticos

Identificacin

2. Mtodos convencionales
2.1. Pruebas bioqumicas
- Algunas pruebas bioqumicas se denominan PRUEBAS RPIDAS
porque evalan la presencia de enzimas preformadas y se realizan de
forman inmediata:
- CATALASA
- CITOCROMO C- OXIDASA
- COAGULASA
- SOLUBILIDAD EN BILIS, .

2. Mtodos convencionales
- La mayora de las pruebas bioqumicas convencionales de
identificacin se llevan a cabo cultivando los microorganismos
(bacterias) en medios que contienen el sustrato a metabolizar
- El medio se incuba generalmente de 18 a 24 horas
- La reaccin positiva se revela por cambios en el pH a consecuencia
del proceso metablico (el medio debe incluir un indicador) o bien
detectndolo directamente mediante reactivos especiales

2. Mtodos convencionales
Pruebas bioqumicas en tubos (medios lquidos)

Aceite

Fermentacin
de la lactosa

Prueba VP

Pruebas en
anaerobiosis (O/F)

2. Mtodos convencionales
Pruebas bioqumicas en tubos (medios slidos)

Kligler
Prueba del citrato

2. Mtodos convencionales
Pruebas
bioqumicas
en placas

Hidrlisis del almidn

Crecimiento
en bilis
Crecimiento en sal y
Utilizacin de manitol

3. Mtodos rpidos
- Sistemas comerciales:
- Manuales: el operador debe realizar la inoculacin y la lectura
- Automatizados: instrumentos que efectan la inoculacin, la
incubacin y la lectura de manera automtica, evaluando los
resultados un ordenador que determina la identificacin
- Ventajas:
- Rapidez de manipulacin
- Homogeneidad de resultados que permite la comparacin entre
distintos laboratorios
- Disposicin de bases de datos computerizadas para interpretar los
resultados

3.1. Sistemas manuales

- En la dcada de los 60 aparecieron los primeros sistemas comerciales de
identificacin (Enterotubo)
- Los primeros sistemas se disearon para enterobacterias (frecuencia en
muestras clnicas, rpido crecimiento y buen conocimiento de las
pruebas bioqumicas necesarias para su identificacin)
- Ventajas de estos sistemas
- Fiabilidad
- Ocupan poco espacio en incubacin y almacenamiento
- Duracin larga (caducan en 6 a 12 meses)
- Fcil manejo, inoculacin e interpretacin de los resultados
- Tanto las pruebas como los medios son uniformes

3.1. Sistemas manuales

- Muchos de estos sistemas incluyen en pequeos pocillos de plstico una
mnima cantidad de medio o del sustrato a estudiar, liofilizado o desecado
- El medio se inocula directamente o bien el sustrato se rehidrata con un
pequeo volumen de una suspensin del microorganismo en agua destilada
o en medio de cultivo
- El sistema se incuba y transcurrido un tiempo se leen los resultados
- Los sistemas suelen incluir entre 10 y 50 pruebas
- Existen sistemas dirigidos a la identificacin de distintos grupos de
bacterias: enterobacterias, bacilos Gram negativos no fermentadores,
estafilococos, estreptococos, neisserias, corineformes, bacterias anaerobias;
y levaduras
- Todos los sistemas manuales comercializados deben manipularse y leerse
de acuerdo con las instrucciones del fabricante

3.1. Sistemas manuales

API (Biomrieux)
- Tiras de plstico con 20 minitubos con un orificio en la parte superior
para la inoculacin y que contienen los sustratos deshidratados de 20
pruebas bioqumicas
- Se suministran dentro de sobres de aluminio sellado
- La suspensin bacteriana se prepara a partir de colonias aisladas
inoculadas en solucin salina estril (NaCl al 0,85%)

API (Biomrieux)
- Los tubos se rellenan con una pipeta estril o con una jeringa y aguja,
con cuidado de no formar burbujas que impiden el contacto entre el
sustrato y la suspensin bacteriana
- Algunos tubos se llenan hasta la cpula y
a otros se les aade aceite de parafina para
obtener condiciones de anaerobiosis

Cpula
Tubo

Aceite de parafina

API (Biomrieux)

- Tras la inoculacin se introducen en una bandeja de plstico con tapa

para mantener la humedad durante la incubacin; la bandeja tiene
unos pocillos que se llenan con agua de grifo para mantener la humedad

- La tira se incuba de 18 a 24 horas a 37C

Lectura e interpretacin de los resultados

- Hay pruebas de lectura directa y otras que necesitan
la adicin de reactivos
- Las pruebas positivas y negativas se identifican por el
color que adquieren los medios tras la incubacin o
tras la adicin de reactivos
Pruebas negativas

Pruebas positivas

API STAPH

API STREP

Lectura e interpretacin de los resultados

- Los resultados se interpretan en funcin de la tabla de lectura
- A cada prueba se le asigna el valor + (segn sea positiva o
negativa)
Cdigo binario de 20 dgitos

+-+++-+---+++-+-+-++

- Obtencin de un nmero binario de 20 dgitos

10111010001110101011
- Muy incmodo para trabajar

Lectura e interpretacin de los resultados

- Se convierte el cdigo binario (+ +) en un cdigo octal

- Las pruebas se agrupan de tres en tres

- A cualquier prueba negativa, ocupe el lugar que ocupe, se le asigna el valor 0
- Si la primera prueba de un triplete es positiva se le asigna el valor 1
- Si es positiva la segunda se le asigna el valor 2
- Si es la tercera, se le asigna el valor 4

Lectura e interpretacin de los resultados

- Al final, las 20 pruebas se transforman en un nmero o cdigo de 7
dgitos que constituye el NMERO DE BIOTIPO

etc.

Cdigo de la muestra: 5215773

Pruebas no incluidas en la galera

Klebsiella pneumoniae
o Serratia liquefaciens

Lectura e interpretacin de los resultados

- Los resultados se anotan en la tarjeta y la identificacin se comprueba
en un manual o en la base de datos de un ordenador

Lectura e interpretacin de los resultados

API 20E

API STAPH

API 20 STREP

API 20 NE

API NH

API LISTERIA

API CORYNE

API 50 CH
API CANDIDA

Sistema ATB (API semi-automatizado)

Enterotubo (Becton Dickinson Diagnostics)

- Tubo de polipropileno en forma de lpiz dividido en 12 compartimentos
que permite la realizacin de diferentes pruebas bioqumicas (se pueden
leer 15 resultados)

12 medios de cultivo

15 pruebas bioqumicas

Enterotubo

Enterotubo
- El centro del tubo est atravesado por un alambre que sirve para la
inoculacin y sobresale por los dos extremos que estn tapados
por sendos tapones de rosca

-No necesita preparar suspensin bacteriana

- Se inocula directamente desde colonias aisladas

Enterotubo

Hilo metlico para

inocular el Enterotubo
Compartimentos
del Enterotubo

Enterotubo
- El alambre se vuelve a insertar en los 4 primeros compartimentos (para
conseguir condiciones anaerobias) y el resto se rompe, colocando a
continuacin los dos tapones de rosca
- Con el alambre roto se agujerean los 8 compartimentos restantes para
incubar en aerobiosis
- Se incuba horizontalmente de 18 a 24 horas a 37C

Enterotubo
- Pruebas de lectura directa
- Pruebas de lectura indirecta: los reactivos se inyectan con una aguja
hipodrmica a travs del tubo de propileno

Lectura e interpretacin de los resultados

-Tras la incubacin se leen las pruebas obtenindose un nmero binario
de 15 dgitos (100100111001010) segn que stas sean positivas (1)
o negativas (0)
- Se agrupan las pruebas de tres en tres y se obtienen los nmeros octales (la
primera prueba de cada triplete vale 4 si es positiva; la segunda vale 2 y la
tercera vale 1; sin son negativas, cualquiera que sea su posicin valen 0)
- A partir de los nmeros octales se
obtiene el NMERO DE BIOTIPO
DE 5 DGITOS
- La identificacin se comprueba en un
registro de perfiles denominado
ENCISE (Enterobacteriaceae
Numerical Coding and Identification
System)

Lectura e interpretacin de los resultados

3.2. Sistemas automatizados

Abac Abactor II (Menarini Diagnostics)
- Es un sistema automatizado e informatizado para identificacin de
bacterias gram negativas y realizacin de pruebas de sensibilidad a
antibiticos
- Se compone de un conjunto de rotores (Abac) y de un instrumento
para la distribucin del inculo y la lectura de las pruebas (Abactor)

Abac Abactor II
Sirve para:

1. Identificacin de bacterias Gram negativas y determinacin

simultnea de su sensibilidad a 15 antibiticos, basado en tcnicas de
dilucin en medio lquido
2. Determinacin de la sensibilidad bacteriana frente a 16
antibiticos, de bacterias Gram negativas, Gram negativas urinarias,
estafilococos y estreptococos
3. Determinacin de la concentracin mnima inhibitoria (CMI)

Abac Abactor II
Abac: son rotores con 32 compartimentos con medios de cultivo
deshidratado para la identificacin bacteriana y el estudio automatizado
de la sensibilidad antimicrobiana. Hay tres tipos:
- Abac-Identibiograma II: rotores que incluyen 13 pruebas
bioqumicas y 15 antibiticos a una concentracin nica o doble
- Abac-Antibiograma: rotores que incluyen 16 antibiticos a doble
concentracin
- Abac-CMI: rotores que incluyen aminoglucsidos y beta-lactmicos
- Vienen empaquetados en bolsas de aluminio al
vaco y se pueden conservar hasta 18 meses a
temperatura ambiente

Cdigo de colores

Abac Abactor II
Abactor II: instrumento que realiza la distribucin del inculo y la
lectura de los rotores de forma automtica; interpreta e imprime en
una tarjeta los resultados de la identificacin bacteriana y las
pruebas de sensibilidad

Abac Abactor II
Descripcin de Abactor
- En la parte izquierda est el sector destinado a la distribucin
automtica del inculo y la homogeneizacin del cultivo despus de la
incubacin, mediante una breve centrifugacin
Inoculacin: 8 mL de suspensin en la cavidad central
Se produce una centrifugacin breve a baja velocidad que reparte el
volumen por igual entre todos los compartimentos del rotor

inoculacin

Abac Abactor II
- La incubacin se realiza en una estufa, se saca el Abac y se lleva a una
estufa a 35-37C
- En la parte central est el sector que realiza la muestra la lectura de los
rotores. El sistema de lectura consta de una fuente de luz que es enfocada
por una lente al centro del pocillo
- En la parte derecha se encuentra el teclado numrico para la
introduccin del nmero de identificacin de las muestras y las teclas de
funcin
Tarjeta de lectura: son del mismo color que la etiqueta colocada en los
rotores y est formada por TRES HOJAS AUTOCOPIABLES DIFERENTES

lectura

Abac Abactor II
La primera hoja es para el microbilogo e indica:
- Resultados de las pruebas bioqumicas
- Nombre (probable o exacto) de la bacteria
- Posibles pruebas adicionales para confirmar identificaciones
probables
- Perfil de sensibilidad a los distintos antimicrobianos (resistente,
intermedio, sensible)
- CMI (en el caso del Abac CMI)
- Las otras dos copias se destinan al mdico e indican:
- Identificacin definitiva
- Perfil de sensibilidad
Interpretacin de los resultados
- Exacto
- Probable
- Imposible

Abac Abactor II

Procedimiento

1. Realizar suspensin bacteriana

a partir de colonias aisladas

3. Colocar el rotor en Abactor para

que la rotacin del aparato durante
unos segundos transfiera 0,1 mL
de inculo a cada compartimento

2. Verter 8 mL del inculo en

la cavidad central del Abac

4. Incubar el Abac en recipiente adecuado

en la estufa a 37C de 18 a 20 horas

5. Colocar el rotor de nuevo en Abactor, esperar

y retirar la tarjeta con los resultados impresos

Vitek (Biomerieux)

- Sistema automatizado e informatizado que permite la identificacin de

bacterias Gram negativas y Gram positivas incluyendo patgenos de orina,
patgenos entricos, levaduras, anaerobios, Neisseria y Haemophilus, e
indica la susceptibilidad a antimicrobianos
Incubador y lector
Mdulo de llenado y sellado

Tarjetas
Programa

Disco duro

Impresora

Vitek
- Las tarjetas son de plstico transparente
- Tienen 24 micropocillos con sustratos deshidratados
- El llenado de las tarjetas se realiza por succin al vaco (puede llenar 10
a la vez) en el mdulo de llenado
Pocillo con
sustrato
Transferencia automtica del
inculo por succin al vaco

Vitek
- La incubacin se realiza dentro del mismo aparato, se pueden
incubar 240 tarjetas a la vez
- El mdulo de lectura admite 30, 60, 120 240 tarjetas
- Se le pueden pedir resultados en cualquier momento del proceso
- La identificacin se obtiene en 4-6 horas de
media (2 horas en el caso de bacterias de
crecimiento rpido)

Procedimiento

1. La tarjeta se marca con un nmero que

el sistema puede leer directamente

2. Despus de aadir diluyente al tubo que

contiene la muestra, se colocan las tarjetas
en el soporte con el tubo de transferencia
dentro del tubo de muestra

3. Las tarjetas se colocan en el mdulo de

llenado y sellado donde la muestra ser
introducida por succin al vaco en los
pocillos, sellando despus la tarjeta

Procedimiento

4. Las tarjetas se colocan en una

bandeja y se introducen en el
mdulo de incubacin y lectura

5. Una hora despus de cargar la

muestra ya se puede pedir
un informe preliminar

6. El informe final se imprime

automticamente para cada
tarjeta al final del ciclo