QUI132

FormaC
Integrantes:BrunoMilesi,CarolinaCceres,DaroVargas,ValentinaDonoso

PruebaGrupal
Fechaentrega:29/06/2015hastalas23:59.

Seccindeseleccinmltiple:
resaltarrespuestacorrectaennegrita.

1) La finalidad de realizar una trituracin y homogeneizacin de las muestras al extraer

cidosnucleicoses:
a. Dispersarlaslipoprotenasdelasmembranasdelasclulas.
b. Neutralizarlascargasnegativasquecausanlaprecipitacindeloscidosnucleicos.
c. Romper las clulas de los tejidos produciendo la liberacin del contenido
celularynuclear.
d. Separarendosfasesloscidosnucleicosdelosdemscomponentesdelaclula.
e. Desnaturalizarloscomplejosproteicospresentesenlasmembranascelulares.

2) La diferencia entre elmtododeenzimaticoyeldelaOtoluidina,enlacuantificacinde

glucosa,esque:
a. el primero es especfico para glucosa, el segundo puede reconocer otros
azcares.
b. elprimeroesqumicoyelsegundoenzimtico.E
c. Elprimeronecesitacurvadecalibrado,elsegundono.
d. el primero necesita de una medicin un patrn, en cambio el segundo requiere una
curvadecalibrado.
e. ningunadelasanteriores.

Seccindepresentacindeunprotocolodelaboratorio.
Respetelosespaciospararesponder,ycoloquesololainformacinprecisaynecesaria.

I)Desdeunsacodeazcar,cuantificarglucosamedianteOtoluidina.

Paso 1. Primero se debe diluir el azcar a una concentracin conocida, luego preparar

una batera de tubos rotulados, todos los tubos deben tener la misma cantidad de
volumen total, por lo tanto, se pondr un volumen especfico de esta azcar diluida
(diferente en cada tubo) y una cantidad de agua para compensar un volumen equitativo
dentro de cada tubo, dentro de estos tubos debe ir un BLANCO el cual solo contendr
agua y o-toluidina.

Paso 2. Se agrega un mismo volumen del reactivo contra glucosa o-toluidina para

cada tubo.

Paso 3. Homogeneizacin del tubo cerrandolas con membranas de parafilm en la boca

del tubo , para posteriormente ser puestos a bao maria por 10 minutos y observar un
cambio de color (desde incolora a verde), cabe destacar que el parafilm no se extrae
mientras los tubos estn expuestos al calor.

Paso 4. Luego de dejar enfriar los tubos se procede a vaciar stos en celdillas para

cuantificar mediante un espectrofotmetro las distintas absorbancias

de los tubos.El

espectrofotmetro leer la absorbancia a partir de los haces de luz que traspasan por la
muestra siendo este dependiente de la concentracin (A mayor concentracin,mayorser
laabsorbancia,yviceversa).Apartirdeestosdatos,seformulalacurvadecalibrado.

Posible resultado que esperan obtener. Pueden fundamentar con: valores tericos,
imgenes,grficos,ecuaciones,etc..

El uso de las propiedades espectrofotomtricas de las molculas de glucosa

permiten que, a travs de la absorbanciaqueseobtienedesdeel espectrofotmetro
, puedan ser graficadas y as obtener resultados cuantitativos, a diferencia del uso
de marcadores colorimtricos(no presentados), los cuales solo dan resultados
cualitativos(Fig.1)


Fig.1

El uso de otoluidina al momento de hacer contacto con la glucosa, tiendeamarcar

por colorimetra la cantidad de glucosa presente en cada tubo (gradientes de
colores) a lo que a mayor cantidad de glucosa tendr una mayor coloracin verde
por parte de la otoluidina,lo que es confirmado en las tablas de absorbancia vistas
enlosresultados.

Apartirdelacurvadecalibrado,podemoscalcularlasconcentracionesdemuestras
desconocidasatravsdesugrfico,atravsdelasiguientefrmula(Fig.2):
Fig.2

Dnde, Abs
es la absorbancia obtenida por el espectrofotmetro ,
b
es el
intercepto obtenido a partir del grfico de la curva de calibrado,
meslapendiente,
tambin obtenida a partir del grfico y
C es la concentracin de muestra que
queremosconocer.

SeccinCurvasdecalibrado.
Escribasiemprelosparmetrosdelaecuacindelarectayutilicesiempre3decimales.

A. Luego de extraer el ADN total desde un pltano, Ud. desea conocer su concentracin.
Para ello, utiliza un patrn de ADN de concentracin conocida, y construye la siguiente
tabla.

TabladeCalibrado
ADNpatrn100ug/ml(ml)

ConcentracinBSA(ug/ml)

Absorbancia(260nm)

0,15

0,0247

0,30

0,0555

0,60

0,122

0,90

0,180

1,20

0,245

1,50

0,313

La muestra que analiza, se prepar de la siguiente forma: De la solucin final se tomauna

alcuota de 0,5ml la cual se afora a 2,0ml. Luego, esta se diluye nuevamente al tomar
1.500uL aforndola en 5,5ml. As, las medidas del triplicado arrojan los siguientes valores:
0,1650,1690,166.Laabsorbanciaa280nmfue0,0900,0880,078,respectivamente.

Cul es la concentracin inicial de ADN (ug/ml), y comente el grado pureza de la

extraccin,quecontienelamuestradelpltano?

Secreaunatabladecalibrado

Sabiendoque:

Y=0,212x7,727x10^3

Factordedilucion[1]

2,0/0,54

Factordedilucion[2]

5,5/1,53(ml)

FactorDilucionTotal[T]

[1]*[2]12[T]

PorLotanto

Cinicial=absb/m*Fd

C[A]=0,165+7,727x10^3/0,212*129,8(ug/ml)
C[B]=0,169+7,727x10^3/0,212*1210(ug/ml)
C[C]=0,166+7,727x10^3/0,212*129,8l(ug/ml)

ConcentracininicialPromediodeDNA(ug/ml)

C[A]+C[B]+C[C]/39,86(ug/ml)

GradoPurezaDNA

gradopurezaDNAconabsorbanciaa260(nm)
[A]0,165
[B]0,169
[C]0,166

gradopurezaDNAconabsorbanciaa280(nm)

[A]0,090
[B]0,088
[C]0,078

Por lo tanto se emplea el cociente [A],[B],[C] A260/A280 para calcular la pureza de los
cidosnucleicos

[A]0,165/0,0901,83
[B]0,169/0,0881,92
[C]0,166/0,0782,12
Y se emplea un promedio de los cocientes paradeterminaruna purezadecidosnucleicos
fija

[A]+[B]+[C]/31,83+1,92+2,12/31,95PurezadeAcidosNucleicosoDNA

B. A su grupo de trabajo se le pide evaluar si una muestra de suelo es apropiado para el

cultivo de
Lophophora wiliamsii
de manera comercial. Se desconoce cunta protena tiene
elterrenoylaespecieencuestinrequierevaloresfijosparacrecerapropiadamente.

El tratamiento que serealizaeselsiguiente:sedisuelveunamuestrade2,44grdetierraen

50ml de HCl. Luego se toman 4ml y se afora a 250ml de agua. De esta solucin son
tomados 5,7ml, que despus sonpurificadosmediantefiltros,yseaforanaunvolumenfinal
de 100ml con HCl. De esta ltima solucin, se tomaron 3 alcuotas que son analizadas,
obteniendolossiguientesvaloresdeabsorbancia:0,6550,6450,654.

Adems, se prepar una batera de tubosparamedirlamasadeprotenas,utilizandocomo

patrnlaalbminasuerodebovino(BSA).

Tablaparaprepararlacurvadecalibrado
BSApatrn(ug/ml)

0,00

9,36

18,72

28,08

37,44

Abs

0,466

0,676

0,883

1,086

1,280

ElvolumendeensayodelospatronesylasMPfuede3ml.

Informeelcontenidoinicialdeprotenasenlamuestradesuelooriginal,expresadoeng/Lt.

.
2,44/50>0,0488

Fd[1]

250/462,5

Fd[2]

100/5,717,54

Fdtotal

[1]*[2]1096,49

SabiendoqueY=0,022*x+0,011seextrapolaconAbs=e*c*l

[C(a)](0,6550,011/0,022)*1096,5=x>32095(ug/ml)
[C(b)](0,6450,011/0,022)*1096,5=x>31590,2(ug/ml)
[C(c)](0,6540,011/0,022)*1096,5=x>32040ug/ml

Luego,sacamosunpromediodelaconcentraciones.

[C(a)]+[C(b)]+[C(c)]/3=31908ug/ml

Yfinalmente,cambiamoslasunidadesdesdeug/mlporg/L.

31908(ug/ml)1000(ml)1(g)
1(L)10^6(ug)

Contenidoinicialdeprotenas:31,908g/L