UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO JOO DEL REI

CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS

Protenas recombinantes para aplicaes teraputicas: uma

reviso com nfase nos vetores e sistemas de expresso

Gabriela Silveira dos Santos

Orientadora: Isabel Cristina Braga Rodrigues

Ouro Branco
Junho/2015

Protenas recombinantes para aplicaes teraputicas: uma

reviso com nfase nos vetores e sistemas de expresso

Gabriela Silveira dos Santos

Trabalho de Concluso de Curso apresentado

como requisito parcial s exigncias do curso de
Bacharelado em Engenharia de Bioprocessos do
Departamento de Qumica, Biotecnologia e
Engenharia de Bioprocessos da Universidade
Federal de So Joo Del Rei.

Orientadora: Isabel Cristina Braga Rodrigues

Ouro Branco
Junho/2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO JOO DEL REI

CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS

Protenas recombinantes para aplicaes teraputicas: uma

reviso com nfase nos vetores e sistemas de expresso

Gabriela Silveira dos Santos

A Banca Examinadora, composta pelos membros abaixo, avaliou este TCC:

_____________________________________________________
Isabel Cristina Braga Rodrigues - Orientadora

______________________________________________________
Natlia Rocha Barboza Examinador 1

______________________________________________________
Edson Romano Nucci Examinador 2

Ouro Branco,___/___/____

RESUMO

Molculas formadas por polipetdeos ou protenas com sequncias de aminocidos

idnticas protena humana nativa e com aplicaes no tratamento de doenas so
chamadas biofrmacos. O uso dessas protenas como agentes teraputicos uma
ideia relativamente nova, porm durante muitos anos a estrutura e as caractersticas
das protenas vm sendo estudadas. A insulina e o hormnio do crescimento
humano foram as primeiras protenas teraputicas a serem usadas. A insulina era
extrada do tecido pancretico animal e o hormnio do crescimento humano obtido
da hipfise de cadveres, preparaes estas de segurana reduzida em relao aos
riscos de desenvolvimento de efeitos adversos, devido possibilidade de
copurificao de patgenos. Atualmente, com o avano da biologia molecular,
possvel manipular o material gentico das clulas e promover a expresso das
protenas humanas em outros organismos, tornando, por exemplo, o processo de
purificao mais eficiente e seguro. Um gene inserido em um sistema de expresso
adequado (bactria, fungo, clula animal ou vegetal) juntamente com o veculo de
clonagem, os chamados vetores, que permitem que os fragmentos de DNA a serem
clonados sejam introduzidos e propagados em uma clula hospedeira adequada.
Existem, no mercado mundial, mais de 350 medicamentos elaborados com o uso da
biotecnologia e j esto sendo avaliados novos biofrmacos para o tratamento de
mais de 150 doenas, como cancr, hepatites, diabetes mellitus, entre outras. O
presente trabalho procurou discutir as diferentes plataformas de expresso e vetores
utilizados na produo de protenas recombinantes para aplicaes teraputicas e,
ainda, exemplificar a construo dos vetores e a seleo das clulas hospedeiras
com a reviso de algumas pesquisas promissoras na produo de citocinas,
insulina, eritropoietina e fator IX da coagulao sangunea.

Palavras-chave: biofrmacos, DNA recombinante, vetores, sistemas de expresso.

ABSTRACT

Molecules formed of polypeptides or proteins having amino acid sequences identical

to the native human protein and applications for treating diseases is called
biopharmaceuticals. The use of these proteins as therapeutic agents is a relatively
new idea for many years but the structure and characteristics of proteins have been
studied. The insulin and human growth hormone were the first therapeutic proteins to
be used. Insulin was extracted from animal tissue and pancreatic human growth
hormone obtained from the pituitary of dead bodies, these security preparations
reduced the risks of development of adverse effects due to the possibility of
copurificao pathogens. Nowadays, with the advancement of molecular biology, it is
possible to manipulate the genetic material of cells and promote the expression of
human proteins in other organisms, eg making the process more efficient and safe
purification. A gene inserted into a suitable expression system (bacterium, fungus,
animal or plant cell) with the cloning vehicle, so-called vectors, which allow the DNA
fragments to be cloned are introduced and propagated in a suitable host cell. There,
in the world market, more than 350 drugs produced using biotechnology and are
already being evaluated new biopharmaceuticals to treat more than 150 diseases like
cancer, hepatitis, diabetes mellitus, among others. The present study sought to
discuss the different expression platforms and vectors used to produce recombinant
proteins for therapeutic applications, and also illustrate the construction of vectors
and selecting host cells with the review of some promising research on the
production of cytokines, insulin, erythropoietin and factor IX of blood coagulation.

Keywords: biopharmaceuticals, recombinant DNA, vectors, expression systems.

SUMRIO

1. INTRODUO........................................................................................................7
2. OBJETIVO.................................................................................................................9
2.1 Objetivos Especficos....................................................................................9
3. REVISO DA LITERATURA...................................................................................10
3.1 - Aplicao de protenas recombinantes para a sade humana................13
3.2 A Tecnologia do DNA Recombinante.........................................................16
3.3 Vetores...........................................................................................................17
3.4 - Sistemas de expresso para a produo de biofrmacos.......................27
3.5 - Estudos de Caso...........................................................................................33
3.5.1 - Citocinas..................................................................................................33
3.5.1.1 - Interferon cIFN-.................................................................................34
3.5.2 - Fatores de crescimento hematopoitico..............................................34
3.5.2.1 - Eritropoietina.......................................................................................35
3.5.3 - Hormnios................................................................................................37
3.5.3.1 - Insulina................................................................................................37
3.5.4 - Fatores de coagulao sangunea........................................................38
3.5.4.1 - Fator IX da coagulao sangunea.....................................................39
3.6 - Aspectos de mercado...................................................................................40
4. CONCLUSO..........................................................................................................43
5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................................44

1. INTRODUO
A tecnologia do DNA recombinante ou engenharia gentica consiste em processos
de manipulao do DNA, podendo isolar sequncias de DNA e inseri-las em uma
clula hospedeira, sendo possvel, posteriormente, separar e purificar as protenas
produzidas nesse processo. Essa tecnologia abriu novos campos, no s de
possibilidades teraputicas, como tambm no entendimento de diversas doenas e
vem ganhando cada vez mais espao na economia (SOUSA, 2006; REIS, 2009). O
DNA do doador extrado ter os genes de interesse isolados e estes, sero inseridos
em vetores e transferidos para uma clula receptora, esta ir amplificar os
fragmentos gnicos por replicao do DNA (clonagem) ou, mediante a montagem
correta do vetor, com os sinais de expresso adequados, ir expressar a protena
codificada pelo gene clonado (GRIFFITHS et al., 2000).

Os vetores so molculas de DNA carregadoras que levam outra sequncia de DNA

para o interior da clula hospedeira. Estes so capazes de amplificar, em centenas
de cpias, a informao gentica que foi inserida. Isso ocorre devido presena de
sinais moleculares que possibilitam que estes fragmentos de DNA sejam replicados
dentro da clula hospedeira, produzindo cpias de DNA recombinante que sero
passadas para as clulas filhas. Alm disso, existe a possibilidade da expresso de
genes contidos em suas sequncias, a expresso ocorrer devido presena dos
sinais moleculares pertinentes, como as sequncias promotoras. Os vetores devem
ser de tamanho pequeno e possuir stios de clonagem onde sero inseridos os
fragmentos de DNA estudados (ALBERTS et al., 2009; ZAHA et al., 2014).
As principais aplicaes da biotecnologia moderna na rea de sade o uso da
engenharia

gentica

para

produo

de

biofrmacos.

Biofrmacos

so

biomolculas, como protenas (incluindo anticorpos) e cidos nucleicos (DNA ou

RNA) utilizados para fins teraputicos ou de diagnstico in vivo. Diferem dos
frmacos convencionais por sua estrutura complexa e, consequentemente,
impossibilidade de sntese qumica (MADEIRA, 2013).

Segundo Marques (2005), diversos processos utilizando diferentes sistemas de

expresso, como clulas de bactrias (Escherichia coli, principalmente), leveduras,
fungos filamentosos, clulas de insetos e de mamferos, animais e plantas
transgnicos, so atualmente empregados na indstria biofarmacutica para
produo de protenas teraputicas, como fatores de coagulao sangunea,
anticorpos monoclonais, fatores de crescimento celular, hormnios, citocinas, entre
outros.
A escolha do sistema de expresso influencia o carcter, a quantidade e o preo do
produto final. E a aplicao da protena a ser expressa deve ser sempre
considerada, o sistema deve ser capaz de expressar a protena recombinante de
modo a se obter o mximo de rendimento por clula cultivada, alm da gerao de
protenas que tenham a atividade biolgica desejada, promovida, principalmente,
pelas modificaes ps-traducionais corretas. A maioria dos produtos aprovados
pela FDA (Food and Drug Administration) so produzidos usando sistemas
procariticos (bactrias) ou eucariticos (leveduras ou cultura de clulas de
mamferos) e que utilizam vetores plasmidiais (MARQUES, 2005).
Embora o sistema de expresso de protenas heterlogas em E. coli seja bastante
difundido e mais frequentemente utilizado do que outros,

quando se pretende

expressar alguma protena recombinante, o melhor sistema deve ser escolhido de

acordo com as caractersticas da protena de interesse, por exemplo, as protenas
que necessitam de glicosilao no so adequadamente expressas neste sistema.
Alm do sistema de expresso, a escolha dos vetores tambm importante. O vetor
utilizado deve ser construdo de acordo com as informaes especficas sobre a
protena, como a sequncia extra de amina terminal, alm disso, deve existir
tambm, compatibilidade entre o stio de restrio e a regio de leitura. Deve ainda
conter os sinais moleculares para expresso e endereamento da protena e pode
conter outras sequncias que facilitem a posterior purificao da protena heterloga
(MONCLARO, 2013).
De acordo com os diversos avanos da Engenharia Gentica, da importncia na
produo de biofrmacos recombinantes que conferem menores riscos aos
pacientes em relao a contaminaes oriundas do processo de preparao e da

possibilidade de reduzir os custos de produo destas biomolculas utilizando

organismos geneticamente modificados, o presente trabalho far uma breve reviso
da literatura abordando os principais vetores e sistemas de expresso utilizados na
produo de protenas recombinantes com aplicaes teraputicas.

2. OBJETIVO
Este trabalho tem como objetivo abordar as caractersticas dos principais vetores e
sistemas de expresso utilizados na produo de protenas recombinantes com
aplicaes teraputicas.

2.1 Objetivos Especficos

Apresentar as principais caractersticas dos vetores de clonagem e expresso
utilizados em Engenharia Gentica.
Apresentar as principais caractersticas dos principais sistemas de expresso
utilizados na produo de protenas recombinantes.
Abordar estudos de casos sobre a produo de protenas recombinantes com
aplicaes teraputicas.
Expor as expectativas de mercado dos biofarmacuticos.

10

3. REVISO DA LITERATURA
Desde os primrdios os microrganismos so utilizados na produo de alimentos e
bebidas. Durante a dcada de 1940 vrios processos de cultivo em massa de microorganismos, em condies estreis, desencadearam a produo comercial de
antibiticos, vacinas, enzimas, aminocidos e esterides (VILLEN, 2002).
Tambm a partir da dcada de 1940, foram firmadas evidncias diretas que o DNA
fosse a molcula possuidora da informao gentica, sendo o cdigo que determina
todas as caractersticas dos seres vivos, com os experimentos de Avery e seus
colaboradores. Culminando, em 1953, com a formulao da estrutura desta
macromolcula por James Watson e Francis Crick. Estes pesquisadores
propuseram, utilizando os postulados de Erwin Chargaff (1940) e dados de difrao
de raios X obtidos por Rosalind Franklin e Maurice Wilkins (1950), que a estrutura do
DNA era formada por duas cadeias de nucleotdeos ligadas por ligaes fosfodister
entre os nucleotdeos. Essas cadeias se encontram pareadas em uma orientao
antiparalela e unidas por ligaes de hidrognio entre as bases nitrogenadas
complementares (A/T e C/G). As duas cadeias formam uma hlice que lembra uma
escada em espiral onde os degraus so as bases nitrogenadas e o corrimo
formado pelas desoxirriboses e os grupos fosfatos. A partir da definio da estrutura
do DNA, os cientistas tambm propuseram as bases para transmisso da
informao gentica, na qual a replicao do DNA utilizaria um molde de DNA
parental e ocorreria pela complementaridade de bases nitrogenadas (WATSON e
CRICK, 1953; REIS, 2009). A partir de ento, vislumbrou-se grandes avanos nas
tcnicas da biologia molecular.
J na dcada de 1960, foi possvel verificar um grande progresso na decifrao do
cdigo gentico, sendo esta considerada a descoberta mais importante do sculo,
para a gentica molecular. A descoberta das enzimas de restrio, em 1978, por W.
Arber, H. Smith e D. Nathans, possibilitou a construo de molculas de DNA
recombinante, fazendo com que segmentos especficos de molculas de DNA de
origens diferentes pudessem ser ligados. As enzimas de restrio so protenas
bacterianas, de alta especificidade, capazes de reconhecer uma base especfica na

11

dupla hlice do DNA e cort-las em fragmentos que sejam facilmente manipulados,

tornando possvel recombinar ou criar organismos transgnicos (CARUSO 2007;
ZAHA et al., 2014).
Outro avano significativo foi o desenvolvimento da reao em cadeia da polimerase
(PCR), por Kary Mullis em 1983. A PCR permite a amplificao in vitro de
sequncias determinadas de DNA a partir de uma amostra de cido nuclicos e
oligonucleotdeos iniciadores (primers) especficos para as regies do DNA que se
deseja amplificao. Na presena de uma DNA polimerase termoestvel (Taq
polimerase polimerase de Thermus aquaticus), do par de primers e dos
desoxirribonucleotdeos (dNTPs) que compem a molcula de DNA, possvel
amplificar a regio de interesse a partir de uma quantidade diminuta de DNA
(MOLINA e TOBO, 2004; ZAHA et al., 2014).
Estes avanos impulsionaram a Tecnologia do DNA Recombinante, surgindo as
perspectivas do incio da sntese de uma variedade de protenas heterlogas,
possibilitando

novas

descobertas

que

permitiram

criao

de

vacinas,

desenvolvimento de tcnicas de seleo e identificao de genes na transferncia

gentica de um organismo para outro, produo de enzimas para aplicao
industrial e a produo de molculas biolgicas com fins teraputicos (CARUSO,
2007; DA ROCHA e MARTIN, 2011).
Protenas heterlogas, so protenas recombinantes obtidas a partir da insero de
um gene de um organismo em outro organismo pela tecnologia de DNA
recombinante. A produo de protenas recombinantes heterlogas envolve uma
srie de passos, como (i) a identificao e caracterizao gentica da protena e das
suas propriedades bioqumicas; (ii) a definio dos requisitos estruturais para a sua
atividade funcional, como as modificaes ps-traducionais; (iii) a definio do
sistema de expresso, ou seja, das clulas que iro expressar a protena
recombinante e (iv) a definio do vetor que ir conduzir o gene ao sistema de
expresso selecionado (WALSH, 2002; ABDI e CGEE, 2008; PATIO, 2011; AMB e
INTERFARMA, 2013).

12

A tecnologia do DNA recombinante permitiu a expresso de protenas heterlogas

em micro-organismos e outras clulas hospedeiras, possibilitando o isolamento e a
transferncia de um gene de um organismo para outro resultando em um indivduo
geneticamente igual ao utilizado para receber a molcula de DNA recombinante,
porm com uma nova caracterstica gentica, proveniente de outro, que no da
mesma espcie, criando, desta forma, um organismo geneticamente modificado
(OGM) (GANDER e MARCELLINO, 1997).
Um OGM aquele que foi submetido a tcnicas que modificaram seu genoma. J o
termo transgnico utilizado para nomear organismos que foram submetidos a
tcnicas especficas de insero de uma parte do genoma de outra espcie,
conferindo-lhes modificao no genoma original. Portanto, os transgnicos so um
tipo de OGM, mas nem todo OGM um transgnico (COSTA e COSTA, 2009).
O processo da tecnologia de DNA recombinante consiste basicamente na extrao
do DNA do organismo contendo o gene de interesse, logo aps, por intermdio de
enzimas de restrio, o DNA cortado em fragmentos menores. Os genes de DNA
isolados so inseridos em pequenos fragmentos de DNA cortados pela mesma
enzima de restrio, estes pequenos fragmentos so denominados vetores. A
enzima DNA ligase, responsvel por unir as extremidades livres do DNA do vetor e
do DNA doador, dando origem ao DNA recombinante. Em seguida, executa-se a
fase de transformao, na qual o DNA recombinante inserido em uma linhagem
celular (bacteriana, animal ou de leveduras). Por fim, ocorre o processo de seleo,
as clulas so separadas em transformadas e no-transformadas. Uma nica clula
recombinante selecionada para dar origem a outras atravs da diviso celular,
todas as clulas filhas devem conter uma cpia do vetor portador do gene inserido.
Agora, as clulas so ento induzidas a expressar o novo gene. Dependendo de
qual o sistema celular selecionado ou da montagem do DNA recombinante, a
protena heterloga poder ser encontrada dentro das clulas ou fora destas, no
meio circundante (GRIFFITHS et al., 2000; SOUSA, 2006).
A expresso de protenas heterlogas em organismos geneticamente modificados
apresenta, sob o ponto de vista econmico, uma vantagem considervel em relao
aos processos clssicos de produo de protenas, pela purificao das mesmas de

13

rgos animais ou do sangue de doadores. Esses sistemas podem ser induzidos,

sob condies controladas, a sintetizar protenas em grandes quantidades. Alm
disso, a produo de protenas a partir de micro-organismos mais facilmente
controlada em biorreatores, a produo contnua e o controle de processo
facilitado. Assim, a tecnologia do DNA recombinante representou uma revoluo na
cincia e permitiu que genes especficos pudessem ser isolados de um genoma, ou
do ambiente, e manipulados. Os avanos cientficos e tecnolgicos tm ampliado o
emprego de micro-organismos ou clulas modificadas geneticamente visando
produo de protenas de interesse em diversas reas e, em especial, na rea
clnica (ABDI e CGEE, 2008).

3.1 - Aplicao de protenas recombinantes para a sade humana

Segundo VILLELA (2008), os biofrmacos podem ser definidos como frmacos cujos
princpios ativos so protenas teraputicas recombinantes obtidas por processo
biolgico, normalmente apresentam estrutura molecular complexa de difcil
caracterizao e replicao. Alm disso, so molculas diversas e muito mais
pesadas do que as molculas que compem os medicamentos tradicionais e
apresentam peso molecular cem a mil vezes maiores do que as molculas
sintticas. Geralmente, a expresso biofrmaco refere-se a protenas obtidas por
engenharia gentica (REIS, 2009; AMB e INTERFARMA, 2013).
At o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, muitas protenas eram
obtidas a partir do isolamento de fontes naturais, porm essas formas de obteno
apresentavam alguns riscos ligados segurana do produto final. Por exemplo, o
hormnio do crescimento, obtido a partir da glndula pituitria de cadveres e o fator
VIII, protena fundamental na cascata de coagulao sangunea, obtido a partir de
sangue humano, nestes casos, os riscos de contaminao com doenas infecciosas
provenientes do doador so significativos. Alm disso, havia tambm limitao da
quantidade produzida. Os primeiros biofrmacos surgiram para substituir esta
produo convencional de protenas e tm revolucionado as opes de tratamento

14

para muitas doenas, como hemofilia, diabetes mellitus e hepatite (BENAVIDE,

2013).
Durante os ltimos 30 anos, a indstria de biotecnologia lanou mais de cem
protenas recombinantes e atualmente, mais de trezentos e cinquenta medicamentos
esto sendo avaliados para o tratamento de diversas doenas, desde cncer at
desordens genticas raras (ABDI e CGEE, 2008).
As protenas teraputicas podem ser classificadas em dois grupos, as protenas que
no requerem modificaes ps-traducionais e as que requerem modificaes pstraducionais, como N-glicosilao. As modificaes ps-traducionais so alteraes
de resduos de aminocidos que ocorrem nas proteinas aps a sua sntese, podem
ocorrer por excluso de resduos ou adio de molculas a um ou mais
aminocidos. Estas modificaes podem alterar o tamanho, a composio, a
atividade

das

protenas,

alm

das

interaes

com

outras

protenas

consequentemente afetam a funo que desempenham (MARQUES, 2008).

Protenas no glicosiladas so tipicamente expressas em Escherichia coli ou na
levedura Saccharomyces cerevisiae. J as protenas recombinantes que requerem
modificaes ps-traducionais, na maioria dos casos, so expressas em clulas de
mamferos, que tm a capacidade de imitar a glicosilao humana. Sistemas de
expresso eucariticos inferiores, tais como clulas de levedura e de insetos so
normalmente incapazes de proporcionar glicosilaes de mamfero (GERNGROSS,
2004; MADEIRA, 2013).
Os principais tipos de biofrmacos esto representados pelas citocinas (interferons e
interleucinas); fatores de crescimento hematopoitico (eritropoietina); hormnios
(hormnio do crescimento, insulina, gonadotrofinas); fatores da coagulao
sangunea

recombinantes

(fator

VIII,

fator

IX);

agentes

trombolticos

(estreptoquinase); enzimas (fator ativador de plasminognio, glucocerebrosidase);

vacinas (vacina recombinante contra a hepatite B); imunoconjugados e anticorpos
monoclonais (anticorpos semelhantes queles produzidos no corpo e adaptados
para reagir especificamente sobre alvos selecionados). A Tabela 1 apresenta as
principais protenas recombinantes teraputicas disponveis no mercado mundial
(AMB e INTERFARMA, 2013; BENAVIDE, 2013).

15

Tabela 1 - Classes de biofrmacos e seus principais representantes disponveis no mercado

(BENAVIDE, 2013).

CLASSE
Fatores
sanguneos

PRODUTO
Fator VIII
Fator VIIa
Fator IX
Fator ativador de
plasminognio

Anticoagulantes
e trombolticos

Hormnios

Hirudina
Protena C ativada
Insulina
Insulina anloga
Insulina inalvel
Hormnio do
crescimento humano
Hormnio folculo
estimulante
Calcitonina

Fatores de
crescimento

Glucagon
Eritropoietina
Eritropoietina anloga
GM-CSF
Interferon alfa

Interferon e
Interleucinas

Enzimas

Interferon beta
Antagonista de receptor
de interleucina 1
Interleucina 2
Glicosidase
L-iduronidase
N-acetilgalactosamina
4-sulfatase
Alfa galactosidase

INDICAO

ANO

TERAPUTICA

APROVAO

Hemofilia A
Algumas formas de
hemofilia
Hemofilia B
Infarto do miocrdio e
infarto agudo do miocrdio
Terapia anticoagulante e
preveno de trombose
venosa
Septicemia
Diabetes Mellitus
Diabetes Mellitus
Diabetes Mellitus
Algumas formas de
deficincia de crescimento
Infertilidade, anovulao e
superovulao
Osteoporose psmenopausa e doena de
Paget
Hipoglecemia
Anemia
Anemia
Neutropenia induzida por
quimioterapia
Hepatite B e C e vrios
tipos de cncer
Esclerose mltipla
Artrite reumatide

1992
1996

Carcinona de clulas
renais
Doena de Pompe
Mucopolissacaridose I
Mucopolissacaridose IV

1992

Doena de Fabry

2001

1997
1996

1997
2001
1982
1996
2006
1985
1995

1999
1998
1989
2001
1991
1986
1993
2001

2006
2003
2005

Chamados de biofrmacos de primeira gerao, os medicamentos como insulina,

hormnio de crescimento e fatores de coagulao, consistem em protenas com
sequncias de aminocidos idnticas protena humana nativa, so obtidos pela

16

transfeco do gene humano para um sistema adequado (sistema de expresso

celular) e aps a sntese, essas substncias recombinantes so isoladas e
purificadas. Os biofrmacos de segunda gerao so aqueles sintetizados de forma
a apresentar propriedades teraputicas diferenciadas em relao s naturais, ou
seja, o gene alterado antes da transfeco, de tal forma que a estrutura da nova
protena expresse as caractersticas pretendidas. Geralmente essas alteraes so
realizadas para melhorar algum aspecto da atividade da protena ou do polipeptdio,
como a alterao do tempo de meia-vida (REIS, 2009; AMB e INTERFARMA, 2013;
BENAVIDE, 2013; NUNES 2014).
Diferente dos frmacos qumicos que so obtidos por meio da sntese qumica do
seu princpio ativo, os biofrmacos so geralmente, produzidos pela tecnologia do
DNA recombinante. Pela biossntese em clulas vivas que necessitam modificao
para a produo (expresso) de substncias em condies controladas (REIS, 2009;
INTERFARMA, 2012). Alm das diferenas quanto origem, os medicamentos
tambm se diferem quanto ao tamanho das molculas, os medicamentos
provenientes de sntese qumica so em geral pequenas molculas estveis e
podem ser replicadas de forma idntica. J os medicamentos biolgicos, so
formados por molculas grandes e complexas e quando submetidas a pequenas
variaes

das

condies

de

conservao

armazenamento

apresentam

instabilidade (INTERFARMA, 2012).

3.2 A Tecnologia do DNA Recombinante

Tambm chamada Engenharia Gentica, consiste nas tcnicas de manipulao do
DNA que permitem introduzir um gene de um organismo em uma clula hospedeira.
DNA recombinante refere-se uma sequncia de DNA artificial resultante da
combinao de diferentes sequncias. A tcnica central destas metodologias a
clonagem molecular, que consiste na transformao de uma clula receptora com o
DNA recombinante e a propagao destas molculas no interior da clula, gerando
cpias idnticas (CARUSO, 2007; CESCA, 2011). Esta tecnologia foi responsvel
por uma revoluo nas pesquisas na dcada de 80 e a partir da tem contribudo

17

muito para compreenso do genoma, bem como o conhecimento da estrutura e da

funo dos genes (BORGES-OSRIO, 2013).
O DNA do doador extraido e cortado em fragmentos que contm vrios genes,
esses fragmentos de DNA so inseridos em um vetor. As molculas de vetor com as
inseres so chamadas de DNA recombinante, porque consistem em novas
combinaes de DNA a partir do genoma do dador (que pode ser proveniente de
qualquer organismo) com DNA do vetor a partir de uma fonte completamente
diferente (GRIFFITHS et al., 2000).
Nos tpicos que se seguem, ser feita uma reviso sobre os principais vetores e
sistemas de expresso, utilizados na tecnologia do DNA recombinante, para
expresso de protenas heterlogas com finalidades teraputicas.

3.3 Vetores
So molculas de DNA carregadoras que levam uma sequncia de DNA (o gene)
para o interior da clula hospedeira possibilitando que este fragmento de DNA seja
replicado. O vetor parte principal para a expresso do gene, pois permite que os
fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados na clula
hospedeira, por conterem sinais moleculares que so reconhecidos pelas mesmas
(ALBERTS et al., 2009).
Estes vetores devem ser relativamente pequenos, se possvel, de tamanho inferior a
10kb. Isso se deve ao fato de que as molculas pequenas so mais fcies de
manipular e mais difceis de sofrerem fragmentao durante a purificao.
Geralmente os vetores so derivados de DNA de bacterifago, DNA viral eucaritico
ou plasmdeo e os mais utilizados so caracterizados por serem bons veculos de
clonagem (BROWN, 2003; ALBERTS et al., 2009). Todos os vetores de clonagem
devem conter sequncias que permitam sua replicao autnoma dentro da clula
hospedeira, possuir ao menos um stio nico de clonagem que um stio de
restrio que no se repete na molcula e permitir a insero stio-especifica de

18

outra molcula de DNA (insertos). Alguns vetores possuem stios para vrias
endonucleases de restrio posicionados lado a lado, em um segmento denominado
de stio mltiplo de clonagem (ZAHA et al., 2014).
Em algumas ocasies as clulas procariticas so incapazes de produzir protenas
funcionais a partir de gene eucarioto, as expresses desses genes necessitam de
vetores que possuem os sinais para expresso gnica que so reconhecidos pelas
clulas selecionadas como sistemas de expresso (BROWN, 2003). Possuem
sequncias de DNA que direcionam a sntese da protena codificada no inserto
gnico, ou seja, possuem sequncia promotora reconhecida pela RNA polimerase
do sistema de expresso, bem como stios de ligao ao ribossomo e sequncias
terminadoras tambm reconhecidas pela clula hospedeira (ALBERTS et al., 2009).
So, portanto, destinados a ativar um gene clonado e produzir cpias da protena
codificada em uma clula dita recombinante (KLUG et al., 2010).
Os plasmdeos so molculas circulares de DNA e existem independentes da clula
bacteriana e em alguns organismos eucariticos unicelulares, como leveduras.
Quase sempre portam um ou mais genes responsveis por caractersticas teis
exibidas pela bactria hospedeira. Alm disso, todos os plasmdeos possuem pelo
menos uma sequncia de DNA capaz de atuar como origem de replicao sendo
apto a multiplicar-se no interior da clula independentemente do cromossomo
bacteriano principal (BROWN, 2003; ZAHA et al., 2014).
Os plasmdeos utilizados como vetores so os mais simples e combinam a facilidade
de purificao com a alta eficincia de transformao, devem possuir basicamente
uma origem de replicao (ORI), um marcador de seletividade e o stio de clonagem.
A origem de replicao consiste em uma sequncia especfica do plasmdeo com
cerca de 1.000 pares de bases (pb). Neste local, h um conjunto de elementos
regulatrios envolvidos no controle do nmero de cpias do plasmdeo que sero
produzidas em uma nica bactria. Reconhecida a origem, a replicao do DNA se
inicia e segue continuamente, independentemente do restante da sequncia de
nucleotdeos, fazendo com que qualquer sequncia inserida no plasmdeo seja
replicada. O marcador de seletividade, normalmente um gene de resistncia a
antibitico confere a capacidade de identificao da bactria que recebeu o

19

plasmdeo. Alm disso, os plasmdeos quase sempre so portadores de um ou mais

genes que atribuem caractersticas fenotpicas apresentadas pela bactria
hospedeira e estes genes marcadores contm stios de restrio nicos ou mltiplos
que sero utilizados para clonar o fragmento de DNA de interesse. Neste local, o
plasmdeo ser clivado por endonucleases, tornando-se linear, de forma a permitir a
insero do fragmento de DNA (BROWN, 2003; MACEDO et al., 2015).
A Figura 1 mostra o mapa do vetor plasmidial de clonagem pGEM - T Easy, da
marca Promega, disponvel no catlogo do fabricante. Neste mapa possvel
observar os principais componentes de um vetor plasmidial utilizado para clonagem,
a origem de replicao (ori), o marcador de seleo representado por um gene de
resistncia a antibitico, no caso resistncia ampicilina (Ampr) e o stio mltiplo de
clonagem (SMC), o qual se encontra inserido no interior do gene lacZ. No SMC so
encontrados diversos stios para enzimas de restrio nos quais o vetor plasmidial
pode ser aberto (PROMEGA, 2010).
Na Figura 1, destacado que o SMC se encontra no interior do gene lacZ, sendo
este mais um sistema para seleo das clulas recombinantes. Caso o inserto de
DNA seja corretamente ligado a esta regio, o gene interrompido e a enzima galactosidase no expressa. Caso o inserto de DNA no seja ligado a esta regio
e as extremidades do plasmdeo sejam ligadas entre si, haver expresso da
referida enzima. A expresso da -galactosidase visualizada pela utilizao de um
substrato, semelhante lactose, ligado a um cromforo (X-Gal). Este substrado
quando hidrolisado gera um pigmento azul, colorindo as colnias. Caso a clula
hospedeira receba o plasmdeo vazio ela, ainda sim, ir se desenvolver em um meio
com antibitico, mas suas colnias sero azuis, indicando que estas clulas no
possuem o DNA recombinante corretamente montado (BROWN, 2003).

20

Figura 1: Vetor plasmidial de clonagem pGEM - T Easy da Promega, destacam-se os

principais componentes de um vetor de clonagem: ori, origem de replicao bacteriana;
Ampr, gene de resistncia ampicilina e stio mltiplo de clonagem (SMC) inserido no gene
lacZ e com destaque para os diversos stios de restrio (Adaptado de PROMEGA, 2010).

A Figura 2 mostra o mapa do vetor plasmidial de expresso pQE-30 Xa, da marca

Qiagen, disponvel no catlogo do fabricante (QIAGEN, 2015). Como dito
anteriormente, este tipo de vetor possui os componentes essenciais de um vetor de
clonagem, importantes para a replicao do plasmdeo. Uma origem de replicao
(ColE1), o marcador de seleo representado por um gene de resistncia a
antibitico, no caso resistncia ampicilina (Ampicillin) e o stio mltiplo de
clonagem (MCS). Ainda, neste vetor, so observadas as sequncias sinalizadoras
para a expresso heterloga de protenas, como a sequncia promotora (PT5) e o
stio de ligao ao ribossomo (RBS).

21

Figura 2: Vetor plasmidial de expresso pQE-30 Xa da Quiagen, destacam-se os

principais componentes de um vetor de expresso: PT5, sequncia promotora; lacO,
elemento operador; RBS, stio de ligao ao ribossomo; 6xHis, peptdeo de fuso; FXa, stio
de reconhecimento de protease; MCS, stio mltiplo de clonagem; Stop cdons, cdons de
terminao para a sntese de protenas; ColE1, origem de replicao e Ampicillin, gene de
resistncia ampicilina (Adaptado de QIAGEN, 2015).

Outro tipo de vetor utilizado para expresso e clonagem so aqueles baseados no

genoma de bacterifagos. Bacterifagos so vrus que infectam especificamente
bactrias, possuem estruturas simples, DNA envolvido por um capsdeo e uma
cauda formada por molculas proteicas. Como o DNA dos fagos tem capacidade de
replicao autnoma, eles podem ser utilizados como vetores. As molculas de DNA
dos fagos em geral, possuem vrios genes essenciais replicao e que codificam
componentes do capsdeo (BROWN, 2003; ZAHA et al., 2014). As protenas so
produzidas separadamente a partir do DNA viral que est sendo replicado,
posteriormente, o capsdeo e o DNA se renem para formar nova partcula viral
(ZAHA et al., 2014).
O fago um exemplo, parasita obrigatrio da Escherichia coli, o qual
necessariamente injeta seu DNA na bactria hospedeira para a sua multiplicao.

22

Aps a infeco da E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias: uma o estado
ltico (Figura 3a), em que o DNA do fago permanece na bactria como uma molcula
independente e ocorre a ativao de alguns genes do fago em conjunto com a
inativao de outros. Como resultado, o cromossomo do fago replicado e a sntese
das protenas do capsdeo ocorre imediatamente aps a replicao formando-se
novas partculas virais. Minutos aps a infeco, a clula hospedeira lisada e
ento ocorre a liberao de cerca de 100 novos fagos (BROWN, 2003;
NASCIMENTO et al., 2003).
A outra via que o cromossomo do fago pode seguir denominada de estado
lisognico (Figura 3b). O DNA do fago integrado ao genoma da bactria
hospedeira, por um processo de recombinao stio-especfica. Todos os genes do
profago, que a forma integrada do DNA do fago, ficam inativos, com exceo do
gene que produz a protena repressora do ciclo ltico. O profago pode ser liberado do
genoma da bactria e o fago reverte para o modo ltico, principalmente em situaes
de leso do DNA da clula hospedeira (BROWN, 2003). A bactria carregando o
profago multiplica-se e este replicado e distribudo para as bactrias descendentes
(NASCIMENTO et al., 2003).
Apesar de existir mais de um tipo de fago, todos eles possuem o mesmo padro de
infeco. O processo inicia-se com a fixao da partcula do fago na superfcie
externa da bactria e em seguida o seu material gentico injetado no interior da
clula, um processo denominado transfeco (Figura 3). Ento, enzimas especficas
replicam a molcula de DNA do fago que ento codificada por genes do seu
prprio cromossomo. Por fim, outros genes do fago dirigem a sntese dos
componentes proteicos do capsdeo fazendo com que novas partculas virais sejam
montadas e liberadas da bactria (BROWN, 2003).

23

Figura 3: Fixao do bacterifago na superfcie externa da bactria, seguido da

demonstrano dos ciclos ltico (a) e lisognico (b) (PASSARGE, 2012).

Para o empacotamento natural do DNA do fago necessria a presena das

sequncias cos, que so sequncias de 12 pb, posicionadas nas extremidades do
DNA linear. Estas sequncias devem estar distantes cerca de 35 a 50 kb para que o
empacotamento dentro do capsdeo do fago ocorra. Se a distncia entre dois stios
cos no for apropriada, o DNA no ser empacotado na forma de vrus infectivo
(ZAHA et al., 2014).
O DNA dos fagos pode ser modificado, pela tecnologia do DNA recombinante,
originando vetores para clonagem e expresso muito versteis, como ocorre com as
modificaes efetuadas no DNA do bacterifago , um dos fagos mais utilizados em
clonagem molecular. Uma poro do genoma viral, que no necessria para que o
fago infecte uma clula e replique seu DNA, removida e substituda por um DNA
exgeno. Esta poro do genoma viral flanqueada por stios para enzimas de
restrio, os dois fragmentos remanescentes (braos) compreendem agora uma
pequena parcela do genoma viral e no podem ser empacotados, a no ser que

24

molculas adicionais de DNA sejam ligadas a esses fragmentos, originando

genomas que podem variar de 75 a 105% do comprimento do genoma viral original,
dessa forma, so permitidos que insertos de 9 at 23 kb possam ser clonados. Estas
partculas so empacotadas in vitro e introduzidas na clula hospedeira por
transfeco, como ilustrado na figura 4 (ZAHA et al., 2014).

Figura 4: Representao esquemtica da utilizao de vetor derivado de bacterifago . O

processo de empacotamento do DNA no capsdeo vazio seleciona molculas de DNA do
tamanho adequado, podendo o fragmento central de 14 kb, neste exemplo, ser substitudo
por insertos de DNA de 9 a 24 kb (Adaptado de ZAHA et al., 2014).

Cosmdeos so molculas de DNA circulares extracromossomais originados da

juno de um plasmdeo com um bacterifago, possuem origem de replicao,
marcador de seleo (gene de resistncia a antibitico), uma sequncia cos do fago
e um ou mais stios de clonagem. Dentro da clula hospedeira, os cosmdeos so
replicados como um plasmdeo, e as clulas infectadas so selecionadas pela
resistncia adquirida para algum antibitico. Esses vetores podem ser usados como
veculos de clonagem molecular, empregando o sistema de empacotamento in vitro

25

que reconstitui a estrutura do fago (cabea e cauda), e assim so utilizados para

infectar a clula hospedeira, como relatado anteriormente para os vetores baseados
em bacterifagos. O DNA do cosmdeo injetado no interior da clula e ento se
replica como um plasmdeo normal, sem expresso de qualquer funo do fago
(NASCIMENTO et al., 2003; ZAHA et al., 2014; MACEDO et al., 2015).
Diferente dos plasmdeos bacterianos pequenos, os cromossomos artificias de
bactrias (BAC) possuem uma mdia de tamanho de insertos de 120 kb, podendo
alguns insertos chegarem a 300kb. So similares a outros plasmdeos, porm sua
origem de replicao derivada do plasmdeo F de E. coli., que permite que os BAC
sejam transferidos clula hospedeira por conjugao. Estes cromossomos so
molculas de DNA circulares que carregam uma marca de seleo (resistncia a
antibiticos) e marcadores que permitem a discriminao dos clones vazios e
cheios, como mencionado anteriormente. (BROWN, 2003).
Os vetores de clonagem para eucariotos foram desenvolvidos sob circunstncia
desejvel da utilizao de um hospedeiro diferente da E. coli para um experimento
de clonagem. A descoberta iniciou-se com um plasmdeo presente na maioria das
linhagens de Saccharomyces cerevisiae, o plasmdeo de 2m. Este possui 6kb de
tamanho que o torna ideal para um vetor, alm disso, o mesmo existe na clula de
levedura de 70 a 200 cpias e a replicao desses plasmdeos utiliza a origem de
replicao. Alguns vetores de clonagem para levedura contm genes que conferem
resistncia a inibidores como o metotrexato e o cobre (MOREIRA e MENDES, 1998;
BROWN, 2003).
Vrios tipos de vetores de clonagem utilizados com S. cerevisiae, e que so
derivados do plasmdeo 2m, foram desenvolvidos, como os plasmdeos
epissmicos para leveduras (YEps) que possuem uma origem de replicao que se
comporta como sequncia de replicao autnoma por meio de um segmento de
plasmdeos natural de S. cerevisiae. Alm disso, possui o gene LEU2 que permite
seleo de recombinantes pela utilizao de mutantes auxotrficos para leucina e,
tambm, a sequncia de pBR322 que faz com que haja replicao e seleo em
E.coli tambm (BORGES, 2009; AMORIM 2011). Os plasmdeos integrativos (YIps),
basicamente so plasmdeos bacterianos que contm um gene de levedura, porm

26

no se replicam como plasmdeos e sim integram-se ao DNA cromossmico da

levedura. Um YIp no pode replicar-se como um plasmdeo uma vez que no
contm qualquer parte do crculo de 2m, a expresso a partir destes vetores
baseada na integrao da informao gentica ao cromossomo da levedura
hospedeira atravs da recombinao homloga (BORGES, 2009). Outro exemplo,
so os plasmdeos replicativos (YRps), vetores extracromossomais que contm uma
sequncia de replicao autnoma que funciona como origem de replicao fazendo
com que sejam capazes de se multiplicar como plasmdeos independentes
(BORGES, 2009; AMORIM 2011).
E por fim, os cromossomos artificiais de leveduras (YAC) que so cromossomos
utilizados para a clonagem de longos fragmentos de DNA em levedura. O YAC pode
aceitar segmento de DNA exgeno de at 1.000 kb (quilo-bases) e so construdos
para conter um centrmero que o responsvel pela distribuio dos cromossomos
para as clulas filhas durantes a diviso celular, dois telmeros, que se localizam
nas extremidades de um cromossomo e faz com que essas extremidades sejam
replicadas

corretamente

impedem

degradao

do

cromossomo

por

exonucleases. Outra caracterstica a presena de origens de replicao que so

os locais ao longo do cromossomo onde a replicao do DNA se inicia (BROWN,
2003, KARP, 2005).
Para a deciso de qual tipo de vetor para levedura o mais adequado, deve-se levar
em conta alguns fatores como a frequncia de transformao, que indica o nmero
de transformantes possveis de serem obtidos por micrograma de DNA plasmidial. O
nmero de cpias, quanto maior o nmero de cpias do gene, maior ser o
rendimento do produto proteico e a estabilidade dos recombinantes, clulas
recombinantes de levedura devem reter o gene clonado por longos perodos em
cultura (NASCIMENTO et al., 2003).
Alm dos vetores para leveduras e fungos existem tambm os vetores de clonagem
para plantas superiores. So trs sistemas de vetores mais empregados, os vetores
baseados

nos

plasmdeos

que

ocorrem

naturalmente

em

Agrobacterium

tumefaciens, a transferncia direta utilizando diversos tipos de DNA plasmidial e os

vetores baseados em vrus de plantas. A A. tumefaciens um micro-organismo do

27

solo que infecta regies lesionadas do caule das plantas, induzindo a proliferao
cancerosa do tecido do caule. O plasmdeo Ti (indutor de tumor), presente nesta
bactria, um plasmdeo grande, superior a 200 Kb que est associado
capacidade de induo da doena dentro das clulas vegetais. Este plasmdeo
transporta diversos genes envolvidos no processo de infeco. Uma das principais
caractersticas do plasmdeo Ti que, aps a infeco, uma parte da molcula
integrada no DNA cromossomal da planta, o chamado T-DNA, esse mantido na
clula da planta e copiado para o genoma das clulas filhas. Desta forma, esta
propriedade explorada para inserir DNAs exgenos em clulas vegetais (BROWN,
2003; ZAHA et al., 2014).
Para a clonagem em clulas de mamferos, podem ser utilizados os retrovrus que
possuem a capacidade de insero de sequncias gnicas no genoma hospedeiro
ou pode ser realizada a microinjeo de plasmdeos bacterianos diretamente no
ncleo das clulas de mamferos (BROWN, 2003).

3.4 - Sistemas de expresso para a produo de biofrmacos

Sistemas de expresso so designados como clulas hospedeiras que recebem o
gene recombinado, com o objetivo de expressar este gene (INTERFARMA, 2012;
MADEIRA 2013).
Diversos so os sistemas de expresso para a sntese de protenas heterlogas,
como

bactrias

(procariotos),

fungos

leveduriformes

(leveduras),

fungos

filamentosos, plantas, clulas de mamferos, clulas de insetos e, at mesmo,

animais transgnicos. Contudo, o sistema mais frequentemente utilizado para
expresso heterloga o que utiliza a E.coli como clula hospedeira (STRYER,
1988; LEWIN, 1994; LEWIN, 1997; ZAHA et al., 2014).
Para a escolha do sistema devem ser avaliados alguns fatores como (i) a aplicao
final da protena a ser expressa, (ii) o custo da produo e purificao do produto de
interesse, (iii) a capacidade de controlar o produto final incluindo o seu

28

processamento ps-traducional, (iv) o tempo necessrio para expresso do gene at

a protena purificada e (v) a aprovao pelas agncias regulamentadoras
(GERNGROSS, 2004; MADEIRA, 2013).
Embora o sistema de expresso de protenas heterlogas em E. coli seja bastante
difundido e largamente utilizado devido facilidade e o baixo custo de cultivo, pela
reprodutibilidade e abundncia de protenas que a mesma produz e devido
gentica j bem conhecida deste micro-organismo. Este sistema no vantajoso
para expresso de protenas que necessitam de modificaes ps-traducionais,
principalmente a glicosilao, que muitas vezes necessria para o dobramento
correto das estruturas secundrias, tercirias ou quaternrias das protenas de
interesse (YIN et al., 2007; CUNHA, 2008; MADEIRA 2013).
Quando as protenas heterlogas no so modificadas corretamente elas acumulam
em E. coli na forma de corpos de incluso. Corpos de incluso so agregados
insolveis de protenas mal enroladas. O uso de chaperonas moleculares pode
aumentar a solubilidade das protenas e ajudar na dobragem correta da protena
recombinante. Segundo, Cardeal (2013) estas molculas reconhecem as superfcies
hidrofbicas dos polipptidos a fim de evitar a sua agregao, e de se ligarem a
protenas desconfiguradas, interagem seletivamente com algumas sequncias e
elementos estruturais proteicos e limita as possibilidades conformacionais e
favorecendo algumas conformaes particulares. As chaperonas mais importantes
na E. coli so GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, GrpE. Estas chaperonas podem ser
utilizadas isoladamente, ou em combinao para melhorar a solubilidade das
protenas em E. Coli (CARDEAL, 2013; BAESHEN, 2014).

Um sistema de expresso alternativo so as clulas de leveduras, o mais antigo

sistema de expresso eucarioto, a Saccharomyces cerevisiae apresenta um dos
maiores rendimentos de produo de protenas heterlogas, porm hiperglicosilam
as protenas recombinantes. Para suprir esta deficincia, a levedura Pishia pastoris
tem sido um hospedeiro frequentemente utilizado para a produo recombinante de
uma variedade de protenas procariticas e eucariticas, mais de 200 protenas a
partir de vrus, bactrias, fungos, animais, plantas e seres humanos foram expressos

29

com sucesso em P.pastoris (TWYMAN et al., 2003; YINYIN et al., 2007). A

expresso em clulas de leveduras carrega as vantagens de serem eucariotos e,
portanto, mais prximas evolutivamente dos seres humanos, aliado ao baixo custo
de cultivo, equivalente ao das clulas procariticas.
A utilizao de clulas de mamferos como veculos de expresso tem se mostrado
eficiente, estas tm capacidade de imitar a glicosilao humana o que faz com que
estas clulas sejam bons hospedeiros para a produo de protenas recombinantes
que so N-glicosiladas em seu estado nativo. Porm, um sistema com baixos
rendimentos e longo tempo de produo. Alm disso, necessita de condies
especiais de cultivo como meios de cultura complexos e a utilizao de sofisticados
reatores e tendo, portanto, custo elevado de produo (CUNHA, 2008; MADEIRA
2013).
Outra possibilidade de sistema de expresso so as clulas de insetos que
oferecem sistemas de modificaes ps-transcricionais e ps-traducionais de
eucariotos superiores. As clulas comportam-se da mesma maneira que as clulas
de mamferos, porm tem como vantagem a caracterstica de produzirem protenas
recombinantes com alto rendimento. Os vetores so baseados nos baculovrus, um
grupo de vrus comum em insetos e que no infectam vertebrados, porm as
protenas resultantes no so glicosiladas corretamente, o que faz com que esse
sistema no oferea vantagem em relao a S. cerevisae ou P. pastoris (BROWN,
2003; MADEIRA 2013).
Em animais transgnicos tambm pode ocorrer a expresso de protenas
teraputicas. Atravs da microinjeo do DNA recombinante em vulo fecundado o
gene clonado introduzido em todas as clulas do animal transgnico (BROWN,
2003).
Conforme Fonseca (2006), para que um animal possa atuar como um biorreator ele
deve obedecer algumas caracterstica como (i) capacidade de produzir a protena de
interesse em grandes quantidades sem comprometer o funcionamento normal de
suas clulas, (ii) capacidade de passar esta nova caracterstica para as prximas
geraes, (iii) capacidade de produzir a protena em um rgo especfico; (iv)

30

capacidade de secreo da protena em fluidos, como o leite, que facilitem a

purificao da mesma e no comprometam a sobrevida do animal; (v) aceitabilidade
do organismo do animal quanto insero do transgene e (vi) a garantia de
recuperao considervel da protena com o grau de pureza exigido.
A utilizao de plantas transgnicas para a expresso de protenas vem sendo uma
estratgia atrativa para a produo de biofrmacos. Quanto maior o conhecimento
do genoma das espcies agronmicas, maior a possibilidade de aplicao das
plantas pela manipulao gentica. As clulas vegetais compartilham algumas
semelhanas arquitetnicas e funcionais com clulas animais e constituem um timo
sistema para expressar protenas heterlogas que requerem modificaes pstraducionais complexas, tais como a formao de glicoprotenas. A capacidade das
plantas em promover o processamento ps-traducional representa uma grande
vantagem em relao aos sistemas de expresso estabelecidos em bactrias. As
plantas, alm de permitirem a produo de protenas com estrutura similar das
protenas nativas, apresentam baixo custo de produo quando comparados com
outros sistemas de expresso eucariticos, como cultura de clulas de insetos e de
mamferos, ou ainda animais transgnicos, pois necessitam apenas de solo, gua e
luz para crescimento e produo (YIN et al., 2007, MEDEIROS, 2008 e CUNHA,
2012).
Alm disso, muitas plantas so excelentes acumuladoras de protenas e se
constituem em fonte de biomassa abundante e de baixo custo. Adicionalmente, o
controle adequado das condies de cultivo pode maximizar a produo. Cunha
(2012) ressalta diversas outras vantagens sobre estes sistemas de expresso como
(i) cadeia produtora j bem estabelecida para certos cultivares como a soja; (ii)
rgos especializados no armazenamento de protenas, como sementes, tubrculos
e rizomas; (iii) tempo de gerao mais curto que o de animais transgnicos e (iv)
ausncia de patgenos comuns para plantas e seres humanos. Este mesmo autor
destaca que o desafio em utilizar este tipo de sistema de expresso est no
aumento de rendimento na expresso heterloga, bem como a preservao da
integridade da protena recombinante no organismo vegetal. Para resolver esta
questo, o autor reala a possibilidade de utilizao de promotores tecido
especficos, principalmente para as sementes, bem como de sequncias

31

sinalizadoras

que

direcionem

protena

heterloga

para

vacolos

de

armazenamento no interior da clula, retirando a protena das possveis condies

adversas do citoplasma. Alm disso, interessante a integrao do transgene ao
genoma do hospedeiro para que haja sntese contnua da protena como
caracterstica fenotpica estvel e herdvel (CUNHA, 2012).
De maneira ideal, para a escolha do sistema de expresso de biofrmacos deve-se
levar em conta (i) o custo de produo e de purificao; (ii) a capacidade de
controlar o produto final, incluindo o seu processamento ps-traduo; (iii) a
quantidade de tempo necessria para produzir a protena purificada a partir do gene
e (iv) as exigncias das agncias de aprovao regulatria. Alm disso, quando se
pensa em expresso heterloga, espera-se que a protena de interesse seja estvel,
no txica, solvel e expressa em grandes quantidades (CARUSO, 2007; YIN et al.,
2007). A Tabela 2 traz uma comparao entre os diversos sistemas de expresso
utilizados na produo de biofrmacos.

32

Tabela 2 - Comparao entre os sistemas de expresso utilizados na produo de

biofrmacos (Adaptado de DA ROCHA e MARTIN, 2011).
SISTEMAS

Bactrias

Leveduras

VANTAGENS

DESVANTAGENS

APLICAES

Regulamentao
definida; gentica
conhecida; manipulao
fcil e de baixo custo

Protenas no so
secretadas usualmente;
podem produzir
endotoxinas; no
ocorrem modificaes
ps-traducionais
Glicosilao excessiva
pode prejudicar a
bioatividade; pode
conter imunognicos e
antgenos

Insulina (E. coli - Ely

Lilly), hormnio de
crescimento
(Genentech), fatores
de crescimento,
interferon
Vacinas
recombinantes para
hepatite B viral;
insulina humana

Regulamentao
incompleta;
crescimento lento; meio
de cultura caro;
infeco por
baculovirus (etapa
extra de purificao);
vrus humanos podem
infectar estas clulas
Mtodo caro;
crescimento lento; pode
conter alergnicos e
contaminantes,
purificao complicada

Mtodo
relativamente novo:
Novavax produz
partculas virais
aplicadas na
produo de vacinas

Pouca experincia em
regulamentao;
potencial para
contaminao viral

Hormnio de
crescimento
(cabras - Genzyme);
fator VIII (gado e
sunos - PPL
Therapeutics)
Vacina clera
(tabaco - Chorogen,
Inc.); lpase gstrica
(milho - Meristem);
vacina para hepatite
B (batatas - Boyce
Thompson)

Conhecido como
seguro; bom histrico de
uso; crescimento rpido;
baixo custo de
manipulao;
modificaes pstraducionais
Modificaes pstraducionais; alto
rendimento

Clulas de
inseto

Clulas de
mamferos

Animais
transgnicos

Plantas
transgnicas

Modificaes ps
traducionais; bom
histrico de
regulamentao; boa
opo no caso de
protenas grandes e
complexas
Processamento de
protenas complexas;
excelentes nveis de
expresso

Ciclos de
desenvolvimento
pequenos; fcil
armazenagem das
sementes; no existe
conhecimento do vrus
de planta que tenha
contaminado humanos

Apresenta potencial
para novos
contaminantes (fungos
do solo, bactrias e
pesticidas);
possibilidade de conter
alergnicos

Ativador
plasmognico de
tecido; fator VIII;
anticorpos
monoclonais
(Hercepin)

33

3.5 - Estudos de Caso

Diversos distrbios metablicos so causados pela deficincia na produo de
certas protenas e o tratamento destas doenas, muitas vezes, implica na reposio
da protena deficiente. Dessa forma, a produo em larga escala e com custo
reduzido de diversas protenas humanas pode aumentar a acessibilidade destes
biofrmacos, melhorando a qualidade de vida de muitas pessoas (AMB e
INTERFARMA, 2013).
Nesta seo sero apresentados alguns exemplos de estudos de expresso
heterloga de protenas recombinantes utilizadas na prtica clnica.

3.5.1 - Citocinas
Citocinas so molculas proteicas produzidas por clulas do sistema imunolgico e
utilizadas na comunicao intercelular, so glicosiladas ou no e enviam diversos
sinais estimulatrios para diferentes clulas, apresentando papel fundamental na
regulao da resposta imune e inflamatria (DE OLIVEIRA, 2011). As mais
importantes so: os interferons, o fator de crescimento de granulcitos e as
interleucinas. O interferon- foi um dos primeiros biofrmacos a ser produzido pela
tcnica de DNA recombinante, indicado para o tratamento das Hepatites B e C, no
carcinoma renal e certas formas de leucemia (PFIZER, 2015). Na hepatite C O IFN-
age diretamente contra o vrus e tambm aumenta a resposta imune. Quando a
clula infectada pelo vrus, esse vrus fica alojado dentro dela. O interferon
estimula a exposio dos antgenos virais na superfcie das clulas infectadas,
reconhecendo esses antgenos, o sistema de defesa do organismo passa a atacar
essas clulas. Nesse caso, o interferon age especificamente contra o antgeno viral
que estiver na clula (CAMPOS, 2003).

34

3.5.1.1 - Interferon cIFN-

De acordo com Varellal (2001), o IFN- produzido por moncitos, macrfagos,
clulas linfoblsticas, fibroblastos e clulas infectadas por vrus. O IFN- e o IFN-
possuem semelhana na sequncia de aminocidos e apesar de agirem, nos
mesmos receptores, tm atividade biolgica diferenciada, se ligam a um receptor
comum composto por duas cadeias distintas IFNAR1 e IFNAR2 (receptor IFNAR)
(VILLELA, 2008; DE OLIVEIRA, 2011). O IFN-, produzido por leuccitos quando
so expostos a vrus, apresenta atividade antiviral e antiproliferativa em vrios tipos
de clulas. O cIFN- um interferon sinttico que tem sido utilizado no tratamento
de pacientes com hepatite C crnica que no respondem terapia com IFN-
convencional (VILLELA, 2008; EL-BAKY, 2015).
El-Baky (2015) utilizou o plasmdeo pET101/D-TOPO para expressar o IFN-
recombinante em Escherichia coli. A sequncia de codificao do gene de cIFN- foi
montada com base em PCR e o produto do gene cIFN- clonado no plamdeo para
se obter o novo vetor de expresso, pET-cIFN. O plasmdeo pET101/D-TOPO foi
desenhado para conter a sequncia, promotora de T7 na extremidade 5' do iniciador,
precedendo um cdon de iniciao ATG. Um cdon de parada (TAA) foi includo e o
plasmdeo resultante pET-cIFN foi transformado em clulas de E.coli BL21CodonPlus (DE3) para a expresso da protena regulada pelo promotor de T7. O
sistema pET possui, ainda, o indutor do operon lac. Neste trabalho, a E. coli foi um
sistema de expresso com alta produtividade, evitando o uso de indutores qumicos,
alm disso, mostrou-se um sistema facilmente escalonvel.

3.5.2 - Fatores de crescimento hematopoitico

Os fatores de crescimento hematopoiticos compem uma famlia de glicoprotenas
produzidas na medula ssea por clulas endoteliais, fibroblastos, macrfagos e
linfcitos. Essas protenas juntamente com os hormnios e os neurotransmissores,
desempenham uma importante funo na comunicao intercelular, regulam a
proliferao e diferenciao das clulas hematopoiticas e a funo das clulas
sanguneas maduras. Atuam localmente onde so produzidos ou entram na

35

circulao, os mais conhecidos so os hematopoiticos, que so essenciais para a

formao e diferenciao das clulas sanguneas (MELLADO e CASTILHO, 2008;
MADEIRA, 2013). A eritropoietina uma protena globular complexa de estrutura
glicosilada. utilizada para o tratamento de anemia associada a doenas crnicas
dos rins e estimula a produo de eritrcitos, alm de outras aplicaes no renais
(MELLADO e CASTILHO, 2008).

3.5.2.1 - Eritropoietina
A eritropoietina (EPO) um hormnio glicoprotico que regula a proliferao e a
diferenciao das clulas hematopoiticas, como os glbulos vermelhos. Ela
estimula as clulas tronco jovens da medula ssea, os eritroblastos, a aumentar sua
atividade mittica e se diferenciarem em eritrcitos. um hormnio produzido
naturalmente nos seres humanos e nos animais pelos rins e fgado. A eritropoietina
recombinante tem a mesma funo do hormnio natural. uma protena de grande
interesse comercial, devido ao seu amplo uso teraputico, como nas prevenes de
diversas formas de anemias, na insuficincia renal crnica, doenas hematolgicas,
cnceres, entre outras, porm precisa ser glicosilada corretamente para apresentar
atividade biolgica (FONSECA, 2006; MENDES, 2009).
A produo de EPO em culturas de clulas eucariticas um processo de alto custo
e baixo rendimento, alm disso, as modificaes ps-traducionais em culturas de
clulas no so adequadas, gerando uma protena recombinante com tempo de
meia vida curto, o que encarece o tratamento, por necessitar de mais aplicaes
dirias. Assim, a melhor alternativa a expresso desta protena em animais
transgnicos. Porm, diversas tentativas j foram realizadas em camundongos,
coelhos e sunos, mas diversos problemas com estes animais foram detectados
devido falta de especificidade das sequncias promotoras utilizadas para as
glndulas mamrias (MENDES, 2009). A glndula mamria escolhida como
biorreator, uma vez que as protenas do leite so expressas especificamente neste
local, sem escape para a circulao sangunea, e tambm apresentam altos nveis

36

de expresso de protenas. Alm disso, o leite facilmente colhido sem prejudicar o

animal (CLARK, 1998).
Elementos regulatrios dos genes para as protenas do leite (promotores) podem ser
usados para dirigir a expresso de genes exgenos no tecido mamrio, como os
promotores para as protenas -casena; S1-casena; -lactalbumina; BLG (lactoglobulina bovina) e WAP (whey acidic protein) (CLARK, 1998).
Segundo Mendes (2009), somente em sunos a EPO recombinante foi obtida com a
glicosilao necessria para a atividade biolgica. Alm disso, os promotores WAP
de coelhos ou de camundongos e o promotor de -casena de cabras no foram
capazes de dirigir a expresso somente para a glndula mamria, resultando em
alteraes nos animais transgnicos, como esplenomegalia, hepatomegalia,
alterao de hematcrito, oligospermia e reduo do nmero de filhotes e morte
prematura dos animais por exausto da medula ssea. Na tentativa de reverter esse
impasse a autora construiu vetores plasmidiais para expresso de EPO
recombinante no leite de camundongas transgnicas, com a finalidade de posterior
utilizao da tecnologia em bovinos. Foram construdos dois vetores utilizando o
promotor da -lactalbumina bovina e o promotor de BGL (-lactoglobulina bovina).
As regies promotoras e as regies codificadoras de ambas as protenas foram
amplificadas por PCR a partir de DNA extrado do sangue de fmeas bovinas e a
regio codificadoras para o gene da EPO humana foi amplificada, tambm por PCR,
a partir de DNA extrado de sangue humano. Posteriormente, foram montados dois
cassetes de expresso, aps repetidas digestes com enzimas de restrio: (i)
promotor -lactalbumina, seguido da regio codificadora para EPO humana, seguido
da regio codificadora para -lactalbumina e (ii) promotor BGL, seguido da regio
codificadora para EPO humana, seguido da regio codificadora para BGL. A autora,
ento, introduziu estes cassetes no vetor plasmidial pGEM-T-Easy (figura 1). O
vetor foi introduzido em clulas tronco por eletroporao e estas foram incubadas
com embries para formao de quimeras, estas quimeras foram transferidas para o
tero de camundongas receptoras. Neste estudo, a autora obteve xito na
construo do vetor de expresso, mas no foi possvel testar a hiptese de
produo de EPO recombinante exclusivamente na glndula mamria, pois os
animais transgnicos no foram gerados.

37

3.5.3 - Hormnios
Hormnios so substncias especficas produzidas pelo sistema endcrino ou por
neurnios e so responsveis pela regulao da produo de diversas molculas no
organismo. Os hormnios teraputicos mais conhecidos so a insulina, o glucagon,
o hormnio de crescimento e as gonadotrofinas. A insulina um agente que
combate o diabetes mellitus diminuindo o nvel de glicose no sangue (AMB e
INTERFARMA, 2013).

3.5.3.1 - Insulina
A insulina humana um hormnio proteico, constitudo por 51 aminocidos.
produzida nas clulas pancreticas e localizada nas Ilhotas de Langerhans,
considerada como principal regulador da homeostase metablica tem como funo a
reduo da glicemia (taxa de glicose no sangue). O processo se d atravs do
mecanismo de transduo de sinal que ativa os receptores de insulina presentes na
membrana plasmtica que estimula a expresso dos transportadores de glicose,
capazes de captar molculas para serem utilizadas como fonte de energia ou
estocadas como glicognio (DA CUNHA, 2008; BAESHEN, 2014). A insulina
utilizada no tratamento de um grupo de diferentes tipos de doenas do metabolismo
que levam ao aumento dos nveis de acar no sangue, como o diabetes mellitus
que caracterizado pela deficincia de secreo de insulina. A pr-insulina o
resultado da converso da pr-pr-insulina e diferente da insulina que composta
por dois peptdeos, a pr-insulina composta por trs peptdeos, a cadeia A, a
cadeia B e um peptdo C, alm da sequncia sinal para endereamento da protena
ao retculo endoplasmtico e posterior secreo (LOPES et al., 2012).
A pr-insulina foi expressa por Cunha (2012) em plantas transgnicas de soja. Este
autor construiu um vetor plasmidial com sequncias regulatrias que direcionassem
a pr-insulina heterloga para a semente da soja e que a mesma fosse armazenada
em vacolos no interior das clulas, impedindo a degradao da mesma por
proteases presentes no citoplasma. Para alcanar este objetivo o autor construiu um

38

cassete de expresso composto pelo promotor -kafirina, promotor tecido especfico

para sementes de sorgo, por um peptdio sinal de -coixina, protena de reserva
energtica direcionada para vacolos de armazenamento nas sementes e o gene da
pr-insulina humana. O autor construiu o plasmdeo pRT-GK-PSC-PIh, este vetor foi
construdo com a insero de um fragmento contendo a sequncia codificante do
peptdeo sinal de -coixina retirado do vetor pRT-PSC-prINS e inserido no vetor
pRT-GK, que j continha a sequncia promotora de -kafirina, previamente digerido
com as enzimas Ncol e BamHI. As sementes foram preparadas por aplicao de
biobalstica nos eixos embrionrios. A seleo dos recombinantes foi feita por gene
de resistncia a herbicida. A confirmao da presena do gene foi feita por PCR
convencional, a confirmao da expresso heterloga foi feita por western blot e o
acmulo de protena nos vacolos foi comprovado por imunocitoqumica e
microscopia eletrnica de transmisso. A tcnica se mostrou promissora, pois a prinsulina foi ainda detectada nas prognies destas plantas mesmo aps sete anos de
cultivo.

3.5.4 - Fatores de coagulao sangunea

No processo de coagulao sangunea o complexo no qual o sangue forma
cogulos slidos constitudo por vrios fatores, como os fatores VII, VIII e IX. De
modo geral, os fatores de coagulao so protenas com sntese heptica circulando
sob forma inativa (RESENDE e SILVA, 2015). A desordem na coagulao pode
levar a hemorragia ou a trombose, sendo que a falta dessas protenas constitui a
doena gentica conhecida como hemofilia. Atualmente, estes fatores sanguneos
so tambm produzidos atravs da tecnologia de DNA recombinante (MELLADO e
CASTILHO, 2008).

39

3.5.4.1 - Fator IX da coagulao sangunea

O Fator IX desempenha papel essencial na coagulao sangunea. uma protena
complexa da classe das serino proteases, com cerca de 461 aminocidos e massa
molecular de aproximadamente 55 kDa, dependente de vitamina K. sintetizado e
armazenado no fgado para posteriormente ser secretado no sangue (DA CUNHA,
2008; LIU, 2014). A deficincia do Fator IX leva ao quadro conhecido como hemofilia
B, que um distrbio hemorrgico hereditrio. Essa deficincia congnita causada
por mutaes no gene F11, que controla a produo do Fator IX plasmtico que
resulta em sintomas hemorrgicos moderados, ocorrendo normalmente aps
traumatismo ou cirurgia (MELLADO e CASTILHO, 2008; LIU, 2014).
Segundo Carlos (2007), a coagulao sangunea acontece sempre que um vaso se
rompe e ocorre o sangramento, essa coagulao responsvel por diversas
reaes qumicas. uma srie complexa de interaes nas quais o sangue perde
suas caractersticas de fluido, formando um cogulo irreversvel, pela interao do
tecido lesado, plaquetas e fibrina. Existem dois mecanismos relacionados
intimamente que quando estimulados podem gerar fibrina. O mecanismo intrnseco
refere-se sequncia de reaes enzimticas que iniciam quando o sangue entra
em contato com a superfcie lesada. O mecanismo extrnseco refere-se sequncia
de reaes que ocorrem quando a leso de um vaso sanguneo resulta na liberao
de extratos teciduais. Estas duas vias convergem para a ativao do fator X na via
comum, o que leva, formao de fibrina. O Fator IX atua na via intrnseca e
quando ativado, em combinao com fator VIII tambm ativado, ativa o fator X que
converte protrombina trombina e ento a trombina converte fibrinognio em fibrina
formando o cogulo.
O tratamento da hemofilia B consiste no fornecimento de fator IX ao indivduo
deficiente. Esta protena produzida atravs do fgado de cadveres humanos ou
derivada do sangue de doadores saudveis. Apesar dos riscos associados
contaminao destas preparaes, esta ltima ainda predominantemente utilizada
em pases em desenvolvimento. O primeiro fator IX recombinante comercializado foi
produzido em culturas de clulas de mamferos. Animais transgnicos tambm tm

40

atrado ateno para a produo desta protena, mas ambas as plataformas de

expresso ainda possuem preos proibitivos para serem comercializadas em certos
pases. Dessa forma, sistemas de expresso que reduzam o custo de produo
esto sendo pesquisados (CUNHA, 2012).
Cunha (2012) prope a expresso de fator IX recombinante em sementes
transgnicas capazes de acumular o frmaco devido ao seu alto percentual protico.
O autor construiu um cassete de expresso contendo o promotor da subunidade
da -conglicina de soja, uma protena abundante nas sementes de soja, uma
sequncia para o peptdeo-sinal de -coixina, que direciona esta protena a vacolos
de reservas nas clulas da semente e a sequncia codificadora do fator IX
amplificada de uma biblioteca de cDNA de fgado humano. O autor preparou o DNA
recombinante a partir do vetor pcong3, contendo as sequncias promotoras e
terminadoras da subunidade da -conglicinina, por digesto com as enzimas NcoI
e BamHI. Estes mesmos stios de restrio foram inseridos nos primers que
amplificaram o cDNA para o fator IX e a sequncia do peptdeo-sinal de -coixina.
Assim, estes fragmentos foram inseridos no vetor, gerando o vetor de expresso
pcong3FIX. Este foi transformado por biobalstica nos eixos embrionrios retirados
das sementes de soja e a seleo dos recombinantes foi feita pela resistncia a
herbicida. Estes experimentos produziram protena com atividade biolgica
considervel e a protena foi encontrada nas sementes estocadas por seis anos e
tambm nas prognies da planta.

3.6 - Aspectos de mercado

O setor biofarmacutico baseado na inovao tecnolgica e na propriedade de
pesquisa e desenvolvimento de patentes. As grandes empresas farmacuticas e as
empresas de biotecnologia que surgiram nos ltimos anos concentram a produo
de biofrmacos (BENAVIDE, 2013). O mercado de biofrmacos vem ganhando
destaque devido aos grandes avanos cientficos e ao grande volume de
investimentos (FARDELONE, 2006). As empresas responsveis pela produo dos
biofrmacos e todo processo de pesquisa e desenvolvimento se concentram nos

41

pases desenvolvidos, sendo os Estados Unidos o maior produtor mundial, seguido

por Alemanha e Japo. Contudo, nos ltimos anos o Brasil desponta como uma das
maiores apostas do mercado mundial de biotecnologia (REIS et al., 2011).
Em 1998, o mercado mundial de protenas recombinantes teve uma taxa de
crescimento de 14% ao ano, enquanto a taxa mdia de crescimento de todo
mercado farmacutico foi de apenas 6% (PALOMARES et al., 2004). No ano 2000,
as vendas do setor de biofrmacos representavam 6,4% do total do mercado de
medicamentos (22,7 bilhes de dlares). J no perodo de 2001 a 2002 ocorreu um
crescimento superior a 19% ao ano (7,6% do total do mercado mundial). E em 2004,
j movimentava o mercado anual de cerca de 50 a 60 bilhes de dlares em todo o
mundo, ganhando cada vez mais espao (SOUSA, 2006). Segundo MADEIRA
(2013), o mercado mundial gastou cerca de 160 bilhes de dlares, sendo 10
bilhes de reais no Brasil, e cerca de 350 biofrmacos estavam em fase de testes
clnicos neste ano.
Atualmente, muitos produtos biofarmacuticos esto em ensaios clnicos e vrios
deles so esperados para chegar ao mercado dentro desta dcada (TANAKA, 2014).
Vale ressaltar que dentre os dez medicamentos mais vendidos no mundo, cinco so
biotecnolgicos. Segundo Reis et. al (2011), estima-se que os medicamentos
biotecnolgicos passem de cinco para sete entre os 10 produtos mais vendidos no
mundo. Entre eles, destacam-se os anticorpos monoclonais (Humira-adalimumabe,
Avastin-bevacizumabe, Rituxan-rituximabe, Herceptin-trastuzumabe, Remicadeinfliximabe), a protena teraputica Enbrel-etanercepte e a vacina antipneumoccica
Prevnar13 (SCHNIEKE et al., 1997; REIS et al., 2011).

Nos ltimos anos vrias agncias federais financiam projetos em bioprospeco,

que esto sendo desenvolvidos por grupos de pesquisa nas universidades
brasileiras e tambm empresas farmacuticas na fase de inovao. Muitas
molculas j identificadas foram levadas para as bancadas dos laboratrios nas
universidades e at mesmo na indstria, sendo alvos de testes toxicolgicos e de
atividade. Contudo, as dificuldades das instituies cientficas e tecnolgicas de

42

realizarem parcerias e atuarem na prestao de servios para a indstria acabam

tornando restrita a gerao de inovaes (ABDI & CGEE, 2008).
Ainda segundo Reis et al. (2011), as estimativas de vendas para os prximos anos
apontam destaque para os anticorpos monoclonais. Porm os biofrmacos de
primeira gerao, como insulina, interferons e hormnios do crescimento (hGH)
tambm continuaro liderando o mercado mundial. A figura 4 apresenta a diviso do
mercado de medicamentos biotecnolgicos por tipo de medicamento em 2009 (REIS
et al., 2011)

Figura 4: Participao no mercado de medicamentos biolgicos por tipo de medicamento

em 2009 (REIS et al., 2011).

Em vista do exposto, possvel afirmar que os medicamentos biotecnolgicos vem

ganhando cada vez mais espao no mercado mundial e podem ser considerados
como ponto central da estratgia de diversos pases e empresas na prestao de
servios de sade e na gerao de lucros. Alm disso, importante ressaltar que o
Brasil no est distante dessa discusso, pelo contrrio, muitos avanos em
pesquisa e desenvolvimento tm surgido no pas e, dessa forma, a possibilidade de
ampliao do arsenal teraputico disponvel para diversas doenas e das
oportunidades de tratamento para nossa populao evidente.

43

4. CONCLUSO
Nesta reviso foi possvel expor as caractersticas essenciais dos vetores e sistemas
de expresso utilizados em Engenharia Gentica, mostrando a importncia da
seleo destas molculas e clulas na produo de protenas recombinantes para
aplicao teraputica.
Os estudos de caso apresentados mostram que mesmo para biofrmacos j
consolidados no mercado ainda possvel buscar sistemas de expresso
alternativos que possam reduzir os custos de produo e tornar os mesmo mais
acessveis populao. Para isso, imperativo efetuar a construo do cassete de
expresso de modo aumentar os rendimentos de produo e selecionar o sistema
de expresso de modo a evitar perdas com a expresso de protenas sem funo
biolgica.
A determinao e caracterizao da estrutura de protenas comea a ganhar maior
ateno devido possibilidade de expresso e purificao em larga escala,
permitindo o lanamento de novas drogas e estratgias teraputicas. Alm do mais,
o mercado desses biofarmacos torna-se promissor frente busca contnua e
crescente por produes mais rentveis e otimizadas. Sendo necessrio um rgido
controle das etapas de processo, e purificao.

A tendncia de crescimento de

mercado das protenas, expostas neste trabalho, est relacionada aos excelentes
resultados obtidos em pesquisa e desenvolvimento. Assim, em um cenrio brasileiro
e mundial acredita-se que a indstria de biofrmacos continuar a ter um expansivo
crescimento.

44

5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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