2072

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS
CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA E EVOLUO
ESTUDOS DOS PROCESSOS DIGESTIVOS PROTEOLTICO E

AMILOHIDROLTICO DE JUVENIS DE PACU Piaractus mesopotamicus
(HOLMBERG, 1887), ALIMENTADOS COM NVEIS CRESCENTES DE
PROTENA
JOYCE VISENTAINEL
So Carlos SP
2008


AMILOHIDROLTICO DE JUVENIS DE PACU Piaractus mesopotamicus
(HOLMBERG, 1887), ALIMENTADOS COM NVEIS CRESCENTES DE
PROTENA
JOYCE VISENTAINEL
Dissertao apresentada ao Programa de
Ps-Graduao em Gentica e Evoluo
do Centro de Cincias Biolgicas e da
Sade da Universidade Federal de So
Carlos, como parte dos requisitos para
obteno do ttulo de Mestre em Gentica
e Evoluo.
So Carlos SP
2008
Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitria da UFSCar
V829ep
Visentainel, Joyce.
Estudos dos processos digestivos proteoltico e
amilohidroltico de juvenis de pacu Piaractus mesopotamicus
(Holmberg, 1887), alimentados com nveis crescentes de
protena / Joyce Visentainel. -- So Carlos : UFSCar, 2008.
64 f.
Dissertao (Mestrado) -- Universidade Federal de So
Carlos, 2008.
1. Enzimas digestivas. 2. Pacu (Peixe). 3. Nutrio de
peixes. 4. Bioqumica adaptativa. I. Ttulo.
CDD: 574.192 (20a)


AMILOHIDROLTICO DE JUVENIS DE PACU Piaracatus
mesopotamicus (HOLMBERG, 1887), ALIMENTADOS COM
NVEIS CRESCENTES DE PROTENA
Dissertao de Mestrado de Joyce Visentainel
Banca Examinadora
Prat. Or. Gilberto Maraes

Prata. Ora. Maria Teresa Marques Novo
,<.
Prat. Or. Jo's Fernanda Bibiana Meio
___________________________
Orientador
Prof. Dr. Gilberto Moraes
DEDICATRIA
Aos meus genitores, artfices da vida,

pela dedicao, renncia, doao e
confiana em meu sucesso.
AGRADECIMENTOS
Deus, supremo criador, pelo dom do Esprito Santo iluminando-me o entendimento;

Ao Prof. Dr. Gilberto Moraes, o guia incansvel nas horas de dvidas, pela orientao e
amizade;
CAPES pelo apoio financeiro concedido ao projeto;
Ao CAUNESP pela doao dos exemplares de pacu utilizados neste trabalho;
Juliana, meia-irm, companheira de quarto, de todas as horas, a amizade sincera;
Aos companheiros e amigos do laboratrio de Bioqumica Adaptativa, pelos momentos
agradveis de colaborao, descontrao e interessante troca de idias;
Claucia, Marcelo e Cleojos pela ajuda na formulao e confeco das dietas utilizadas
neste trabalho;
Regiane e Greisse pela disponibilidade crescente, pela pacincia inesgotvel em
solucionar problemas burocrticos;
Ao Sr. Toninho, alicerce inabalvel, ajuda presente indispensvel nos trabalhos rudes;
minha famlia, sempre presente no dia-a-dia incansvel, nas preocupaes, nas alegrias,
nas decepes, nos sucessos;
Ao Eduardo, pela compreenso nas ausncias, pelo apoio incondicional, pela firmeza de
sentimentos;
Sra. Lourdes Massari, pela reviso gramatical desta dissertao;
A todos que direta e indiretamente colaboraram para que este trabalho fosse realizado,
O meu reconhecimento sincero e eterno,
Muito Obrigada.
RESUMO
O conhecimento sobre as enzimas digestivas permite entender alguns aspectos da necessidade

nutricional dos animais e o efeito dos componentes da dieta sobre a atividade dessas enzimas.
Considerando-se a carncia de dados em relao s enzimas proteolticas e amilohidroltica na
parede versus quimo de P. mesopotamicus, surge o interesse pelo seu comportamento,
distribuio e dinmica de produo destas enzimas de forma associada. Inicialmente foi
proposta a investigao dos aspectos digestivos da parede e do quimo de juvenis de pacu em
diferentes intervalos (0,5; 2; 6; 12 e 24 horas) aps a ltima alimentao. Em um segundo
momento foram investigados os aspectos digestivos na parede e no quimo de juvenis de pacu
arraoados com quatro nveis de protena bruta (20, 26, 32 e 38 %). Foram analisadas enzimas
digestivas proteolticas inespecficas, tripsina, quimiotripsina e amilase de todas as sees do
trato digestrio (estmago, cecos pilricos, intestino anterior e posterior) tanto no primeiro
quanto no segundo experimento. Os resultados obtidos no primeiro experimento indicaram que o
pacu apresenta atividade enzimtica digestiva desde o perodo ps-prandial at 24 horas aps a
alimentao, tanto na parede quanto na luz. Porm, essa atividade enzimtica apresenta-se de
maneira diferenciada, quer para os diferentes tipos de enzimas quer nas diferentes sees do
trato. No segundo experimento os resultados indicaram que a amilase e as proteases digestivas
foram responsivas aos nveis de carboidrato e protena da dieta e que a secreo enzimtica pode
ser direta ou inversamente proporcionais ao teor do substrato especfico da dieta dependendo da
enzima e da seo do trato digestrio. Conclumos que a produo de protease prejudicada por
jejuns superiores a 12 horas e que o contedo de enzimas da parede de todo o trato no se esgota
em funo da alimentao sendo o teor de protease alcalina da luz proporcional ao teor da
parede. As enzimas digestivas de pacu so induzidas pela concentrao de protena e carboidrato
da dieta.
ABSTRACT
The knowledge on digestive enzymes allows understanding same aspects of animal nutritional
needs and dietary components effects on the activity of those enzymes. Considering the lack on
the information about proteolytic and enzymes from the gut wall versus digesta in P.
mesopotamicus, it is interesting to see the behavior, distribution and production dynamic of those
enzymes. Initially the investigation of digestive processes was proposed in the gut wall and
digesta of pacu juveniles over distinct time intervals (0,5; 2; 6; 12 and 24 hours) following the
last feeding. At a second time, the digestive aspects in the wall and digesta of pacu were
investigated in fish fed with four levels of crude protein (20, 26, 32 and 38%). The digestive,
unespecific-proteolytic enzymes, trypsin, chymotrypsin and amylase were assayed in all sections
of digestive tract (stomach, piloric cecae, foregut and hindgut) in the first and in the second
experiment. The results from the first experiment have shown that pacu presents digestive
enzyme activity from the post-prandial moment until 24 hours post-feeding, either in the gut wall
or in digesta. However, such enzymatic activity is much differentiated, either to different
enzymes types or to different gut sections. In the second experiment our results have shown that
digestive amylase and proteases were responsive to the levels of dietary carbohydrate and
protein. Moreover, the enzymatic secretion may be direct or conversally proportional to specific
substrat of diet and dependent on the enzyme and the gut section.
In conclusion the protein
production is impaired by fasting longer than 12 hours and the enzyme gut content from all gut is
not emptied in consequence of feeding. The alkaline protease content is proportional to its gut
wall content. The digestive enzyme of pacu are induced by dietary protein and carbohydrate
concentrations.
Lista de figuras
Figura 1. Perfil da atividade proteoltica inespecfica na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P.
mesopotamicus aps 15 dias de alimentao, determinada aps a interrupo da dieta em diferentes
intervalos de tempo. .................................................................................................................................. 30
Figura 2. Perfil da atividade da tripsina na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P. mesopotamicus aps
15 dias de alimentao, determinada aps a interrupo da dieta em diferentes intervalos de tempo. (*)
Atividade no detectada. ........................................................................................................................... 31
Figura 3. Perfil da atividade da quimiotripsina na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P.
mesopotamicus aps 15 dias de alimentao, determinada aps a interrupo da dieta em diferentes
intervalos de tempo. (*) Atividade no detectada. .................................................................................... 32
Figura 4. Perfil da atividade da amilase na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P. mesopotamicus aps
15 dias de alimentao, determinada aps a interrupo da dieta em diferentes intervalos de tempo. ..... 33
Figura 5. Perfil da atividade proteoltica inespecfica na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P.
mesopotamicus alimentados com nveis crescentes de protena bruta. ..................................................... 36
Figura 6. Perfil da atividade da tripsina na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P. mesopotamicus
alimentados com nveis crescentes de protena bruta. (*) Atividade no detectada. ................................. 37
Figura 7. Perfil da atividade da quimiotripsina na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P.
mesopotamicus alimentados com nveis crescentes de protena bruta. (*) Atividade no detectada. ....... 38
Figura 8. Perfil da atividade da amilase na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P. mesopotamicus
alimentados com nveis crescentes de protena bruta................................................................................ 39
Figura 9. Interseco das atividades da amilase da parede e do quimo do trato digestrio de P. mesopotamicus
alimentados com nveis crescentes de protena bruta................................................................................ 40
Lista de tabelas
Tabela 1. Frmula e composio das dietas experimentais....................................................................................... 23
Tabela 2. Atividade das enzimas digestivas da parede do trato digestrio de P. mesopotamicus aps a alimentao.
.....................................................................................................................................................................28
Tabela 3. Atividade das enzimas digestivas do quimo de P. mesopotamicus aps a alimentao............................ 29
Tabela 4. Atividade das enzimas digestivas da parede do trato digestrio de P. mesopotamicus alimentados com
nveis crescentes de protena. .................................................................................................................... 34
Tabela 5. Atividade das enzimas digestivas do quimo de P. mesopotamicus alimentados com nveis crescentes de
protena...................................................................................................................................................... 35
SUMRIO
1.
Introduo ............................................................................................................................................................ 10
1.1. Consideraes gerais .................................................................................................................................... 10
1.2. Nutrio em peixes ....................................................................................................................................... 11
1.3. Digesto e enzimas digestivas ...................................................................................................................... 13
1.4. A espcie Piaractus mesopotamicus............................................................................................................. 18
2.
Justificativa e objetivos........................................................................................................................................ 20
3.
Material e mtodos .............................................................................................................................................. 21

3.1. Desenho experimental .................................................................................................................................. 21
3.1.1. Experimento I ........................................................................................................................................ 21
3.1.2. Experimento II....................................................................................................................................... 22
3.2. Preparao dos extratos enzimticos ............................................................................................................ 24
3.2.1. Quimo .................................................................................................................................................... 24
3.2.2. Homogeneizados celulares .................................................................................................................... 24
3.3. Determinaes enzimticas........................................................................................................................... 24
3.3.1. Protease inespecfica.............................................................................................................................. 24
3.3.2. Tripsina.................................................................................................................................................. 25
3.3.3. Quimiotripsina....................................................................................................................................... 25
3.3.4. Amilase.................................................................................................................................................. 26
3.4. Protena total................................................................................................................................................. 27
3.5. Anlise estatstica ......................................................................................................................................... 27
4.
Resultados............................................................................................................................................................ 27
4.1. Experimento I ............................................................................................................................................... 27
4.2. Experimento II .............................................................................................................................................. 33
5.
Discusso ............................................................................................................................................................. 41
5.1. Experimento I ............................................................................................................................................... 41
5.2. Experimento II .............................................................................................................................................. 46
6.
Concluses........................................................................................................................................................... 52
6.1. Experimento I ............................................................................................................................................... 52
6.2. Experimento II .............................................................................................................................................. 52
Referncias bibliogrficas.............................................................................................................................................54
10
1. Introduo
1.1. Consideraes gerais
O Brasil um pas que apresenta uma riqueza incomparvel em espcies de peixes

(CRESCNIO, 2005). So encontradas espcies das mais variadas formas e tamanhos, muitas
promissoras piscicultura, tanto para produo comercial ou ornamental quanto para pesca
esportiva. Como conseqncia, a produo aqcola brasileira uma atividade em
crescimento e a piscicultura vem apresentando aumento contnuo nos ltimos anos, sendo
que, em treze anos (1992-2005), apresentou aumento de 650 % (CRESCNIO, 2005). Porm
o potencial para a expanso dessa atividade pouco aproveitado. Isso se deve, entre outros
motivos, falta de uma poltica efetiva para organizar e promover o desenvolvimento da
aqicultura como produtora de alimentos (RESENDE, 2003) e, tambm, falta de
informaes sobre as espcies nativas (PRIETO et al., 2006). Entre as espcies com potencial
para produo, o pacu se destaca por apresentar facilidade de adaptao aos sistemas de
aqicultura, boas taxas de crescimento e uma tima aceitao no mercado consumidor devido
qualidade de sua carne. Porm muitos so os entraves no sistema de produo do pacu,
havendo demanda por tcnicas de produo (JOMORI et al., 2003; JOMORI et al., 2005),
principalmente, na rea de manejo alimentar (SOUZA et al., 2003, DIAS-KOBERSTEIN et
al., 2005) uma vez que este um dos fatores mais onerosos no sistema de produo (TACON,
1989).
Os maiores gastos presentes na piscicultura dizem respeito alimentao, e uma
reduo nesses gastos pode ser alcanada com o uso de estratgias aplicadas na fabricao das
raes. Protena o ingrediente mais caro de uma dieta (KIM & LEE, 2005; LEE & KIM,
2005) e uma reduo desde macro nutriente em funo do aumento de macro nutrientes noproticos, como carboidratos e lipdeos, pode reduzir os custos e aumentar a lucratividade.
Muitos estudos tm sido realizados com o objetivo de conhecer as necessidades
nutricionais das espcies nativas com potencial zootcnico, visando otimizar as condies de
cultivo e aperfeioar o desempenho dos peixes com o emprego mnimo de protena na dieta
(FERNANDES et al., 2000; FERNANDES et al., 2001; IZIEL et al., 2004; ABIMORAD et
al., 2007). Porm s nos ltimos anos esto sendo apresentados dados a respeito da
composio da dieta versus adaptao das enzimas digestivas (CORRA et al., 2007) e
11
respostas satisfatrias esto sendo obtidas (MORAES & BIDINOTTO, 2000; LUNDSTEDT
et al., 2004; MELO, 2004; ALMEIDA et al., 2006; CORRA et al., 2007). Esta abordagem
est sendo usada como uma ferramenta para otimizar a composio dos nutrientes das dietas,
e tambm para desvendar a estratgia alimentar das diferentes espcies de peixes.
1.2. Nutrio em peixes
A nutrio um ramo da fisiologia que estuda todos os conjuntos de aes que

assegurem o fornecimento dos nutrientes requeridos para os processos vitais de um organismo
(GUILLAUME et al., 2001). Essas aes incluem vrios estgios, como comportamento e
ingesto do alimento, digesto, absoro, metabolismo dos nutrientes e eliminao dos
resduos (GUILLAUME et al., 2001).
O interesse pela nutrio em peixes assunto recente no meio cientfico. At a metade
do sculo XX os estudos eram dirigidos em relao anatomia do trato digestivo e aspectos
fisiolgicos de animais em seu ambiente natural. Com o incio da criao de peixes em
sistemas de cultivo, o estudo dos requerimentos nutricionais em peixes tornou-se necessrio
(GUILLAUME et al., 2001). A seqncia bsica do processo nutricional consiste da ingesto
do alimento, digesto e assimilao dos produtos da digesto (MUNILLA-MORN &
SABORIDO-REY, 1996a). Os estudos voltados para a nutrio tm demonstrado que a dieta
que visa promover o crescimento precisa incluir uma fonte de energia, aminocidos
essenciais, vitaminas e minerais (ALMEIDA, 2006) e que o valor nutricional de uma dieta
depende no s de um balano adequado entre nutrientes como tambm da capacidade
digestiva do peixe, a qual afetada pela atividade das enzimas digestivas no trato digestivo
(EUSEBIO & COLOSO, 2002). Outros estudos nutricionais tm demonstrado que a dieta
influencia o comportamento, a integridade estrutural, a sade, as funes fisiolgicas, a
reproduo e o crescimento dos peixes (PEZZATO et al., 2004). Portanto esses autores
salientam que a determinao das necessidades qualitativas e quantitativas dos nutrientes
essenciais na dieta de fundamental importncia para a adequada formulao de raes para
peixes.
A protena, considerada o ingrediente mais caro de uma dieta, afeta no somente o
crescimento do peixe, mas tambm os custos da produo (KIM & LEE, 2005; LEE & KIM,
2005; LEE et al., 2006). Sua qualidade depende de sua digestibilidade e composio de
12
aminocidos (N.R.C., 1993). A exigncia protica em peixes pode apresentar variaes

quanto a suas fontes, digestibilidade, espcie e outros fatores como a temperatura e a taxa de
estocagem (MELO, 2004).
Para diferentes espcies de peixes comercialmente importantes, o requerimento
protico varia entre 30 55 % de protena bruta da dieta (N.R.C., 1993). Em um estudo
realizado com juvenis de Platichthys stellatus (LEE et al., 2006) e Pagrus pagrus
(SCHUCHARDT et al., 2008), observou-se um nvel timo de 50 % de protena bruta para
proporcionar um timo crescimento. Para juvenis de Piaractus mesopotamicus, este
requerimento protico para melhor desempenho est ao redor de 25 % de protena bruta
(ABIMORAD & CARNEIRO, 2007). Dietas para Brycon amazonicus devem conter pelo
menos 28 % de protena (IZIEL et al., 2004). Pseudobagrus fulvidraco exige 42 % de
protena (KIM & LEE, 2005).
Todavia um excesso deste macronutriente na dieta resulta em menor desempenho do
peixe (MOHANTA et al., 2008), aumento no custo da produo (KIM & LEE, 2005) e
deteriorao na qualidade da gua (BECHARA et al., 2005; S et al., 2008).
Carboidratos e lipdeos utilizados em nveis adequados como fonte de energia no
protica na dieta podem minimizar o uso de protena como fonte de energia (N.R.C., 1993),
direcionando a protena para o crescimento e diminuindo os custos da produo. Alm de
serem utilizados como uma fonte de energia barata, os carboidratos exibem propriedades
aglutinantes de importncia relevante na produo das dietas (KROGDAHL, et al., 2005).
As diferentes espcies de peixes diferem grandemente em sua habilidade de digerir
carboidratos. Esta variabilidade reflete as diferenas anatmicas e funcionais do trato
gastrintestinal e rgos associados (KROGDAHL et al., 2005), assim como a temperatura
(KUZMINA et al., 1996). De acordo com Wilson (1994) a capacidade de utilizao de
carboidratos pelos peixes de guas doce e quente seria muito maior que de peixes marinhos e
de gua fria, e que os primeiros utilizariam mais eficientemente carboidratos complexos como
amido e a dextrina enquanto os outros estariam mais adaptados a utilizar mono e
dissacardeos. Espcies onvoras ou herbvoras geralmente toleram maiores nveis de
carboidrato, usando-o com maior eficincia como fonte de energia do que espcies carnvoras
(HEMRE, et al., 2002; KROGDAHL et al., 2005). Do mesmo modo, peixes carnvoros
utilizam os lipdeos muito melhor que os carboidratos devido baixa atividade especfica de
enzimas para digeri-lo e s deficincias metablicas (HEMRE, et al., 2002). Porm foi
observado em Pseudoplatystoma corruscans, uma espcie carnvora, a habilidade de
13
aproveitar o amido, pois a atividade amilohidroltica mostrou-se indutiva neste peixe

(LUNDSTEDT et al., 2004).
Se os carboidratos no so fornecidos na dieta, outros componentes como protenas e
lipdeos so catabolisados para obteno de energia (KUMAR et al., 2006) e para a sntese de
vrios componentes biologicamente importantes. Porm um excesso deste macronutriente
pode ser estocado na forma de lipdeo corporal (ABIMORAD et al., 2007) alm de causar
reduo de sua prpria digestibilidade (WILSON, 1994). Este efeito foi observado em
Oncorhynchus
mykiss
(SPANNHOF
&
PLANTIKOW,
1983),
Sparus
aurata
(FOUNTOULAKI et al., 2005) e Hippoglossus hippoglossus (HATLEN et al., 2005). Assim,

importante fornecer uma concentrao apropriada de carboidratos na dieta de espcies de
peixes utilizadas na aqicultura (N.R.C., 1993; WILSON, 1994).
Os lipdeos so uma fonte importante de energia e de cidos graxos essenciais
necessrios para o crescimento e desenvolvimento (CHOU et al., 2001), alm de servirem
como vetores para vitaminas lipossolveis durante a absoro intestinal (N.R.C., 1993).
Adicionalmente, os lipdeos so altamente energticos e rapidamente metabolizados pelos
peixes, especialmente pelos carnvoros (N.R.C., 1993) servindo como uma fonte importante
de energia, principalmente, para espcies marinhas, as quais geralmente apresentam uma
capacidade limitada em utilizar carboidratos como energia (CHOU et al., 2001).
1.3. Digesto e enzimas digestivas
Os nutrientes dos alimentos, antes de serem utilizados metabolicamente, devem passar

por processos de digesto e absoro. Esses processos dependem da disponibilidade de
enzimas digestivas adequadas presentes em locais apropriados ao longo do trato
gastrintestinal (CHONG et al., 2002; JUN-SHENG et al., 2006; KUMAR et al., 2007).
Geralmente, a distribuio e intensidade da atividade destas enzimas ao longo do intestino
variam com o hbito alimentar e morfologia do intestino (HOFER & SCHIEMER, 1981;
SABAPATHY & TEO, 1993; TENGJAROENKUL et al., 2000). Assim, as enzimas
derivadas do estmago, pncreas e intestino, que so secretadas no lmen, e as enzimas que
esto anexas na borda em escova da mucosa intestinal trabalham juntas para completar a
hidrlise e absoro dos nutrientes ingeridos (JUN-SHENG et al., 2006).
14
Diferentes hbitos alimentares e preferncias por certos alimentos revelam o perfil

enzimtico do peixe e este fato traz importantes conseqncias, como por exemplo, o
potencial para o uso da dieta artificial e a necessidade de um ajuste do contedo de seus itens
para alcanar melhores resultados (SABAPATHY & TEO, 1993; HIDALGO et al., 1999;
MORAES & BIDINOTTO, 2000; DEGUARA, te al., 2003). At mesmo espcies com
hbitos alimentares iguais apresentam diferenas na habilidade em digerir o alimento,
trazendo implicaes para a formulao de dietas prticas (DIVAKARAN et al., 1999). Os
peixes herbvoros e onvoros so conhecidos por possurem altos nveis de carboidrases em
relao aos carnvoros, e os peixes carnvoros mostram maiores atividades proteolticas
(SABAPATHY & TEO, 1993; KUZMINA, 1996; HIDALGO et al., 1999; CHAN et al.,
2004) e lipolticas (CHAKRABARTI et al., 1995; TENGJAROENKUL et al., 2000) quando
comparados aos herbvoros e onvoros. Porm o comprimento relativo do trato digestivo
destes maior do que em carnvoros, o que permite que o alimento ingerido permanea maior
tempo em contato com o baixo nvel de proteases (HOFER & SCHIEMER, 1981). Essa
combinao do comprimento intestinal com a ampla distribuio das enzimas digestivas ao
longo do intestino aumenta a capacidade do peixe de utilizar os vrios componentes da dieta
(TENGJAROENKUL et al., 2000). De acordo com Fountoulaki et al. (2005), a capacidade
digestiva depende do nvel de enzimas digestivas bem como do tempo que os nutrientes esto
sujeitos ao das enzimas.
Glass et al. (1989) atestam que o conhecimento da quantidade e especificidade de cada
enzima presente em um sistema digestrio, bem como as condies em que ocorre a hidrlise,
uma ferramenta de grande importncia para prognosticar o processo digestivo em peixes,
assim como a digestibilidade de novos alimentos. Alm disso, esse conhecimento sobre as
enzimas digestivas permite entender a necessidade nutricional dos animais e o efeito dos
componentes da dieta sobre a atividade das enzimas (DIVAKARAN et al., 1999).
Os peixes apresentam a capacidade de modular seu perfil digestivo diante de
diferentes fontes, tipos e quantidades de nutrientes da dieta, e, segundo Reimer (1982) e
Moraes & Bidinotto (2000), esta uma caracterstica adaptativa para melhor aproveitamento
dos nutrientes das dietas. O aumento da ingesto de protena provoca aumento da atividade
proteoltica em Clarias batrachus (MUKHOPADHYAY et al., 1978), Lates calcarifer
(EUSEBIO & COLOSO, 2002), P. mesopotamicus (MORAES E BIDINOTTO, 2004), Labeo
rohita (DEBNATH et al., 2007) e Puntius gonionotus (MOHANTA et al., 2008). Brycon
melanopterus exibe atividade proteoltica aumentada no contedo gastrintestinal, quando
recebeu dieta com maior porcentagem de protena (REIMER, 1982).
15
O lipdeo diettico, principalmente na forma de triacilglicerol, hidrolisado em cidos

graxos livres e 2-acilglicerol por lpases, enzimas estas secretadas no lmen intestinal pelo
hepatopncreas (ZAMBONINO INFANTE & CAHU, 2007). Os cidos graxos e glicerol so
absorvidos e usados para processos biossintticos de vrios componentes celulares ou ento,
catabolizados para obteno de energia.
Os carboidratos so digeridos por uma srie de enzimas, e entre elas se destaca a amilase. Esta enzima, produzida pelo pncreas excrino, ataca as ligaes glicosdicas 1-4,
produzindo a partir do amido uma variedade de oligossacardeos (KROGDAHL et al., 2005).
Segundo alguns autores, a produo da -amilase independente da dieta (HOFER, 1979;
CHAN et al., 2004). Porm Fernndez et al. (2001), observaram que as diferenas na amilase
entre cinco espcies de Sparids est associada principalmente com seus hbitos alimentares,
ou seja, atividade especfica relativamente maior em herbvoros quando comparados aos
carnvoros. O aumento de amido na dieta em B. melanopterus (REIMER, 1982), P.
mesopotamicus (MORAES & BIDINOTTO, 2000) e Colossoma macropomum (CORRA et
al., 2007), resulta em aumento da atividade da -amilase, revelando a capacidade de
modulao desta enzima por essas espcies. Em contraste, o aumento do nvel de amido
diettico ocasiona reduo da atividade da -amilase no quimo de O. mykiss (SPANNHOF &
PLANTIKOW, 1983). Esses autores sugerem que a reduo da amilase devida inibio da
enzima pela adsoro s molculas de amido.
A digesto das protenas envolve a ao de muitas e diferentes proteases, cada qual
com sua ao especfica nas diferentes partes da cadeia polipeptdica (GUILLAUME &
CHOUBERT, 2001). A utilizao das protenas pelos peixes depende da atividade das
proteases digestivas presentes em seus rgos digestivos (NATALIA et al. 2004). Hsu & Wu
(1979) destacam que a pepsina, a tripsina e a quimiotripsina so as trs enzimas proteolticas
mais importantes do trato gastrintestinal de peixes, e que o produto de reao destas enzimas,
os oligopeptdeos, podem ser digeridos pelas vrias endo e exo-peptidases a aminocidos
aproveitveis. As exo-peptidases clivam ligaes peptdicas no lado amino terminal
(aminopeptidases) ou carboxi terminal (carboxipeptidase), e as endo-peptidases, clivam
ligaes internas em uma cadeia polipeptdica. Entre essas ltimas encontra-se a pepsina,
tripsina e quimiotripsina.
A pepsina apresenta sua atividade em pH cido, o qual encontrado na poro
gstrica. Esta enzima responsvel pela hidrlise inicial e parcial de protenas no estmago,
com a ajuda do cido clordrico secretado (NATALIA et al., 2004) e subseqentemente, este
processo completado pela ao combinada da tripsina e quimiotripsina no intestino. Sua
16
forma inativa, o pepsinognio, ativada quando entra em contato com o suco gstrico,
mostrando preferncia pela clivagem em stios aromticos e hidrofbicos da protena
(WALSH, 1979) os quais se tornam resduos aminoterminais (NELSON & COX, 2005). De
acordo com Zambonino Infante e Cahu (2007), os nveis de atividade da pepsina parecem
pouco influenciados pela protena da dieta, e considerando que algumas espcies de peixes
no apresentam estmago, a presena desta enzima no parece determinante para a digesto
da protena. Porm outros resultados mostram que para algumas espcies, a atividade
proteoltica do estmago importante para a digesto de protenas. Em P. corruscans, mesmo
no sendo responsiva aos nveis crescentes de protena bruta da dieta, a protease cida
apresenta altas atividades, o que certamente est associado com o hbito alimentar da espcie
(LUNDSTEDT et al., 2004). Por outro lado o onvoro C. macropomum apresenta carter
indutivo desta protease no estmago e os autores argumentam que este trao adaptativo parece
estar relacionado a um par de fatores, ou seja, diminuio da protena da dieta ou ao
aumento de lipdeo (ALMEIDA et al., 2006). Da mesma forma, Rhamdia quelen tambm
apresenta carter indutivo da protease cida no estmago (MELO, 2004).
Em vista da grande importncia da protena na nutrio de peixes, uma srie de
estudos tm sido focados no papel da tripsina como um indicador nutricional por ser
considerada um enzima chave no processo da digesto (CARA et al., 2007). A forma
precursora da tripsina, o tripsinognio, ativada por uma enteropeptidase, uma enzima
proteoltica secretada por clulas intestinais (NELSON & COX, 2005), assim como pela
prpria tripsina ativa. Alm disso, esta enzima ativa as formas precursoras de outras
proteases, incluindo a quimiotripsina (SUNDE et al., 2001; SUNDE et al., 2004). Em meio
alcalino, a tripsina cliva as ligaes peptdicas internas de uma protena, com especificidade
para os resduos de arginina ou lisina, os quais se tornam os resduos carboxiterminais de
fragmentos de peptdeos (WALSH, 1979). A secreo desta enzima no lmen intestinal est
relacionada entrada do alimento nesta poro do trato (EINARSSON et al., 1996). A tripsina
mostra-se responsiva, no intestino de B. amazonicos, adio de aminocidos essenciais
livres na dieta (CAMILO, 2007), assim como no trato digestrio de R. quelen frente a teores
crescentes de protena (MELO, 2004).
A quimiotripsina ativada quando o quimiotripsinognio secretado no lmen e entra
em contato com a tripsina. Esta enzima tem a habilidade de clivar ligaes onde o resduo de
aminocido do lado carboxlico (NELSON & COX, 2005) da protena aromtico. Assim, ela
cliva em fenilalanina, tirosina e triptofano (WALSH, 1979). Para a espcie carnvora P.
corruscans foi sugerido que estas duas enzimas (tripsina e quimiotripsina) so constitutivas
17
por apresentarem pouca mudana na atividade frente aos diferentes nveis de protena da dieta
(LUNDSTEDT et al., 2004). Diferentemente, R. quelen apresenta responsividade dessas
mesmas enzimas frente a variaes nos nveis de protena das dietas experimentais (MELO,
2004).
O estudo das enzimas digestivas em peixes pode elucidar algumas caractersticas da
fisiologia da nutrio desses animais (SUNDE et al., 2004; PAPOUTSOGLOU & LYNDON,
2006) e tambm ajudar a resolver alguns problemas na alimentao, tais como a vantagem de
uma dieta artificial e a capacidade nutritiva dos peixes (HIDALGO et al., 1999). Todavia
estes estudos revelam a atividade enzimtica digestiva presente no trato gastrintestinal
desprovido de seu contedo (FISH, 1960; GARCA-CARREO et al., 2002; LUNDSTEDT
et al., 2004; KUMAR et al., 2006) e isto pode ocultar parte do processo qumico da digesto
(JUN-SHENG et al., 2006). Em vista disso, alguns trabalhos apresentam a atividade
enzimtica digestiva presente no contedo intestinal. Uys et al. (1987), aps analisarem o
contedo intestinal de Clarias gariepinus em diferentes intervalos aps a alimentao,
concluem que a atividade das enzimas digestivas induzida pela ingesto do alimento. Seixas
Filho et al. (1999) analisaram a atividade amilohidroltica no contedo intestinal de trs
espcies tropicais dos telesteos de gua doce Brycon orbignyanus, Leporinus friderici e P.
corruscans e concluram que a diferena de atividade entre B. orbignyanus e L. friderici est
relacionada morfometria dos intestinos e que a atividade presente em P. corruscans sugeriu
a possibilidade de utilizao de dieta artificial em sua alimentao. Chiu & Pan (2002),
observaram atividade proteoltica no tecido e contedo intestinal de Anguilla japonica
aumentada at 11 horas aps a alimentao. S. aurata apresenta atividade amilohidroltica e
proteoltica em seu contedo intestinal em diferentes intervalos de tempo aps a alimentao
(FOUNTOULAKI et al., 2005). Jun-sheng et al. (2006) observaram a atividade digestiva
proteoltica, amilohidroltica e lipoltica no trato intestinal, provido de seu contedo, do
hbrido Oreochromis niloticus x Oreochromis aureus em diferentes estgios de crescimento.
Em vista disso, no presente estudo, alm das enzimas digestivas presentes na parede do trato
gastrintestinal, foi analisado tambm a atividade destas enzimas no lmen de cada poro do
trato.
18
1.4. A espcie Piaractus mesopotamicus
O pacu, P. mesopotamicus, tambm conhecido como pacu do pantanal, pacu-guau,

pacu-caranha ou somente caranha, uma espcie neotropical natural das bacias dos rios
Paran, Paraguai e Uruguai, ocupando a seguinte posio sistemtica:
Classe Osteichthyes
Subclasse Actinopterygii
Superordem Ostariophysi
Ordem Characiforme
Famlia Characidae
Subfamlia Myleinae
Gnero Piaractus
Espcie Piaractus mesopotamicus
A superordem Ostariophysi inclui os peixes de maior valor comercial na pesca e na
piscicultura brasileiras. A ordem Characiformes um grupo dominante entre os peixes de
gua doce da Amrica do Sul e compreende formas herbvoras, onvoras, ilifagas e
carnvoras, algumas das quais muito especializadas. A famlia Characidae apresenta o maior
nmero de espcies descritas dentro da ordem e a mais complexa, com grande nmero de
subfamlias. A subfamlia Myleinae, a qual inclui o pacu, est representada por peixes
herbvoros, preferencialmente frugvoros (URBINATI & GONALVES, 2005).
Entre as espcies com potencial para a criao comercial, o pacu destaca-se em termos
de rusticidade ao manejo, boas taxas de crescimento e aprovao no mercado consumidor
devido carne de boa qualidade. No ambiente natural, o pacu tem uma dieta muito
diversificada, variando em funo da sazonalidade e, conseqentemente, da disponibilidade
de alimento. Seu ciclo de vida est estreitamente relacionado a perodos de alta ingesto de
carboidratos. De acordo com Silva (1985), o pacu tem uma dentio especializada para
fragmentar e triturar os alimentos duros e o tipo de alimento encontrado no estmago do pacu
constitudo principalmente de folhas, frutos, sementes, assim como de restos e esqueletos de
peixes e ou moluscos ou crustceos, podendo ser caracterizado como uma espcie onvora.
O pacu hoje a espcie nativa da bacia do Paran mais cultivada no Brasil
(CRESCNIO, 2005). Embora as exigncias nutricionais do pacu no estejam totalmente
estabelecidas, referncias protena (FERNANDES et al, 2000; FERNANDES et al 2001),
carboidratos (MORAES E BIDINOTTO, 2000; MUOZ-RAMREZ, 2005), lipdeos
19
(ABIMORAD et al, 2007), bem como a digestibilidade de alguns ingredientes (ABIMORAD

& CARNEIRO, 2004; ABIMORAD & CARNEIRO, 2007), encontram-se disponveis na
literatura. Contudo estudos a respeito de suas exigncias nutricionais e capacidade digestiva
frente a variedades de ingredientes da dieta ainda permanecem escassos. Abimorad et al.,
2007, concluram que o pacu utiliza lipdeos to eficientemente quanto carboidratos para a
maximizao do uso de protenas. As exigncias nutricionais quanto ao requerimento
protico, desempenho e composio corporal j foram reportadas para alevinos e juvenis
(FERNANDES et al., 2000; FERNANDES et al., 2001), como tambm sua habilidade de
modular seu perfil amilohidroltico (MORAES & BIDINOTTO, 2000). Considerando a
carncia de dados em relao s enzimas proteolticas na parede versus quimo desta espcie,
surge o interesse pelo seu comportamento, distribuio e dinmica destas enzimas de forma
associada.
20
2. Justificativa e objetivos
H um crescente interesse cientfico sobre a atividade digestiva enzimtica em

diferentes espcies de peixes tanto de ambientes marinhos como de gua doce, principalmente
aquelas de importncia na aqicultura. Ultimamente, temos proposto o ajuste de teores
proticos, lipdicos e de carboidratos nas raes de peixes atravs da ferramenta bioqumica
que consiste na anlise da variao adaptativa do perfil enzimtico digestivo. Esta ferramenta
vem se mostrando eficiente em algumas espcies j estudadas por nosso grupo de pesquisas
(LUNDSTEDT et al., 2004; MELO, 2004; ALMEIDA, 2006; CAMILO, 2007; CORRA et
al., 2007). Em vista disso, da carncia desses dados em P. mesopotamicus e da importncia
comercial desta espcie, propomos o presente estudo. Alm disso, uma nova avaliao foi
proposta. O fato de termos uma resposta adaptativa do trato digestrio, com a induo de
enzimas digestivas, no o suficiente para que possamos afirmar que os teores de enzima
liberados para a luz do trato sejam diferentes, por isso propomos a avaliao da atividade
enzimtica digestiva tambm no suco digestivo.
O presente trabalho teve por objetivo o estudo de proteases digestivas e da amilase da
parede e do suco digestivo no trato gastrintestinal de P. mesopotamicus. As estratgias
empregadas para se alcanar esse objetivo foram: 1) determinao da dinmica do processo
digestivo, na parede e quimo, em diferentes intervalos aps a alimentao; 2) determinao do
nvel de protena capaz de maximizar a induo de proteases no trato digestrio de pacu
alimentado com dietas isoenergticas; 3) determinao das atividades proteolticas e
amilohidroltica na luz do trato digestrio de pacu durante o processo digestivo nas condies
de mxima induo; 4) comparao das atividades proteolticas e amilohidrolticas da luz do
trato digestrio de pacu com as atividades da parede nas condies de mxima induo.
21
3. Material e mtodos
Exemplares de juvenis de pacu, fornecidos pelo Centro de Aqicultura da Unesp

(CAUNESP), Campus de Jaboticabal, foram aclimatados nas instalaes do Laboratrio de
Bioqumica Adaptativa do Departamento de Gentica e Evoluo na Universidade Federal de
So Carlos, em tanques de 2000 L, por um perodo de 30 dias, recebendo rao comercial
contendo 36 % de protena bruta. Esses tanques tiveram circulao de gua, aerao e
temperatura controladas, e os parmetros fsico-qumicos da gua foram mantidos constantes
(temperatura 27,25 1,32 C; oxignio dissolvido 6,20 0,27 mg/L; pH 7,33 0,05; amnia
0,17 0,08 mg/L; alcalinidade 9,24 0,62 mg/L (como CaCO3) e dureza 30,51 1,06 mg/L
(como CaCO3). Aps este perodo, os peixes foram distribudos em tanques de 250 L, de
acordo com os desenhos experimentais pertinentes. Esses tanques apresentavam as mesmas
condies dos tanques de aclimatao.
3.1. Desenho experimental
3.1.1. Experimento I
O objetivo desse experimento foi avaliar o perfil de atividades enzimticas digestivas

na parede do trato digestrio e no quimo de P. mesopotamicus ao longo de 24 horas psalimentao. Assim, 36 peixes, com peso inicial de 183,3 7,3 gramas, foram distribudos
igualmente em seis caixas de 250 L para realizao do seguinte desenho experimental: uma
caixa, escolhida aleatoriamente, onde os peixes foram mantidos em jejum; cinco caixas onde
os peixes foram alimentados com rao comercial contendo 36 % de protena bruta. O perodo
experimental foi de 15 dias. Decorrido este perodo, as caixas foram aleatoriamente
escolhidas para os tempos de coleta correspondentes a 0,5; 2; 6; 12 e 24 horas aps a ltima
alimentao. Decorridos os intervalos de tempo pr-estabelecidos, os peixes foram coletados,
anestesiados em soluo de eugenol 40 mg/L (INOUE et al., 2003) e abatidos por seco
medular. O trato digestrio foi extrado sobre superfcie gelada e dividido em estmago, cecos
pilricos, intestino anterior e intestino posterior. Cada poro teve seu contedo extrado com
22
2 mL de salina gelada para a retirada do contedo digestivo, exceto nos peixes em jejum em
que a luz do tubo estava totalmente limpa. O contedo digestivo foi centrifugado a 4000 x g
por 15 minutos e os sobrenadantes foram congelados imediatamente em nitrognio lquido e
armazenados a -80 C para posteriores ensaios enzimticos. Os tecidos coletados foram
igualmente congelados e armazenados a -80 C para os ensaios enzimticos.
3.1.2. Experimento II
Os objetivos deste experimento foram: determinar o nvel de protena bruta na dieta

capaz de maximizar a sntese das enzimas digestivas na parede do trato digestrio para
comparar, nessa situao, as atividades enzimticas da parede do trato com as atividades do
quimo no intervalo de tempo ps-alimentao j previamente estabelecido no experimento I.
Isso permitiria avaliar se o teor de enzimas liberadas no lmen proporcional aos teores de
enzimas presentes na parede. Para isso, 120 exemplares de P. mesopotamicus, com peso
inicial de 97,9 5,7 gramas, foram igualmente distribudos em 15 caixas de 250 L. Os peixes
foram alimentados at a saciedade por um perodo de 24 dias com dietas isoenergticas (4000
Kcal/Kg) com quatro nveis de protena bruta (PB): 20 %; 26 %; 32 % e 38 % (Tabela 1).
Cada tratamento foi realizado em triplicata, alm da triplicata mantida em jejum. Decorrido o
perodo experimental de 24 dias, trs peixes de cada caixa, totalizando nove por tratamento,
foram amostrados aleatoriamente 6 horas aps a ltima alimentao (tempo pr-estabelecido a
partir do experimento I, onde os peixes ainda apresentavam contedo na luz do trato). Os
peixes foram anestesiados em soluo de eugenol 40 mg/L (INOUE et al., 2003) e
posteriormente abatidos por seco medular. O trato digestrio foi extrado sobre superfcie
gelada e dividido em estmago, cecos pilricos, intestino anterior e intestino posterior. Assim
como descrito no experimento I, cada poro teve seu contedo extrado com 2 mL de salina
gelada, com exceo do jejum. Esse contedo passou pelos procedimentos descritos no
experimento I, e o sobrenadante e tecidos foram congelados e armazenados a -80 C para
posteriores anlises das atividades das enzimas digestivas.
23
Tabela 1. Formulao e composio das dietas experimentais

Dietas experimentais
Protena
20 %
26 %
32 %
38 %
Milho
58
50,5
36,7
22,4
Q. arroz
F. soja
10
17,5
26
35
F. peixe (60,9%PB)
16,4
21,3
26,3
31,2
leo de soja
2,4
2,2
1,8
7,2
2,5
3,6
100%
100%
100%
100%
Matria seca
89,08
88,96
89,25
89,65
Matria mineral
4,74
6,10
7,44
8,81
Protena bruta
20,20
26,16
32,05
38,15
Protena digestvel 3
16,92
21,62
26,21
30,95
Fibra bruta
8,83
4,55
5,17
5,91
Extrato etreo
6,38
6,56
6,54
6,51
Extrativo no nitrogenado1
48,9
45,58
38,03
30,25
Amido2
40,08
36,56
29,35
21,92
Ingredientes
Mistura vitamnica e mineral*

Celulose microfina**
Total
Composio Calculada
Energia bruta (Kcal/Kg)
3832,28 4033,53 4008,65 4019,29
Energia digestvel (Kcal/Kg)3
3210,71 3299,69 3252,89 3090,68
*ROVIMIX PEIXE - Roches (Homan La Roche, Switzerland) (ingredientes/kg suplementado): vitaminas:

A 55.000.000IU, D35 200.000IU, E 55.000IU, K35 1.000,0mg, B1 (tiamina) 51.500,0mg, B2 (ribofavina)
51.500,0mg, B6 (piridoxina) 51.500,0mg, B1 254.000,0mcg, C5 15.000,0mg, cido flico 5.500,0mg, cido
pantotnico 54.000,0mg, BHT5 12.25 g, biotin 550.0mg, inositol 51.000,0mg, nicotinamida 57.000,0mg,
colina 540.0mg, cobalto 510.0mg, cobre 5.500,0mg, ferro 55.000,0mg, iodo 550.0mg, mangans
51.500,0mg, selnio 510.0mg, zinco 55.000,0mg, veculo q.s.p 51.000,0g. **RHOSTER Indstria e
Comrcio LTDA. (Vargem Grande Paulista, SP, Brasil).
1
ENN = MS (protena bruta lipdeo fibra bruta matria mineral).
2
Amido segundo Rostagno et al., 2000.
3
Digestibilidade dos ingredientes para o pacu de acordo com Abmorad & Carneiro 2004.
24
3.2. Preparao dos extratos enzimticos
3.2.1. Quimo
O contedo de cada poro do trato gastrintestinal foi tratado como descrito no item
3.1.1 para depois ser utilizado direto como fonte de enzima. A alquota de extrato utilizada
nos ensaios enzimticos foi padronizada previamente.
3.2.2. Homogeneizados celulares
Os tecidos utilizados como fonte de enzima foram previamente triturados em

nitrognio lquido e 50 mg foi homogeneizado em 1 mL de tampo de homogeneizao
composto por fosfato de sdio 10 mM e glicerina 50 % (v/v) pH 7,0. A homogeneizao era
realizada em um homogeneizador rotativo por 30 segundos em banho de gelo. Aps este
processo os extratos brutos eram centrifugados a 13000 x g por 10 minutos a 4 C e o
sobrenadante utilizado como fonte enzimtica.
3.3. Determinaes enzimticas
3.3.1. Protease inespecfica
A atividade proteoltica inespecfica foi ensaiada segundo o mtodo da hidrlise

enzimtica da casena adaptado de Walter (1984). Os valores adequados de pH timo para
cada segmento do trato digestrio foram previamente determinados. A mistura de reao era
composta por: 500 L de tampo Glicina/HCl 0,2 M pH 2,0 para estmago e Tris/HCl 0,2 M
pH 8,0 para as outras pores do trato; 500 L de casena 1 % como substrato de reao e
uma alquota previamente padronizada de homogeneizado de tecido como fonte de enzima.
25
Aps 45 minutos de incubao a 25 C, a reao era interrompida com 500 L de cido

tricloroactico (TCA) 20 %. O precipitado protico era removido por centrifugao a 14.400 x
g por 3 minutos e o teor de tirosina (produto de reao) era determinado no sobrenadante
atravs da leitura de absorbncia a 280 nm. Os mesmos procedimentos, exceto o tempo de
incubao que era de 60 minutos, foram realizados para os ensaios das atividades proteolticas
do contedo gastrintestinal (quimo) das diferentes pores do trato. Todas as determinaes
foram realizadas em duplicata e, paralelamente, dois brancos, um de enzima (em que a fonte
de enzima foi substituda por tampo de homogeneizao) e outro de substrato (em que o
substrato foi substitudo por tampo de homogeneizao), passaram pelos mesmos
procedimentos dos tubos de reao. Uma soluo padro de tirosina foi utilizada como
referncia. A atividade especfica foi expressa em mol de tirosina por minuto (U) por mg de
protena (U/mg protena = UI) para os tecidos e em U/mL de quimo para o contedo
gastrintestinal.
3.3.2. Tripsina
A atividade da tripsina foi determinada cineticamente segundo Hummel (1959)

adaptado. Como substrato de reao foi utilizado N -p-tosil-L-arginina metil ester (TAME )
em um meio de reao contendo: 1,04 mM de TAME; tampo Tris/HCl 0,2 M pH 8,1;
CaCl2.H2O 0,01 M e uma alquota previamente padronizada de homogeneizado celular, como
fonte enzimtica, para um volume final de 2,0 mL. A reao era acompanhada em uma
densidade ptica de 247 nm e registrada por 1 minuto a 25 C. A atividade especfica da
tripsina nos tecidos foi expressa em mol de arginina por minuto (U) por mg de protena
(U/mg protena = UI). No contedo gastrointestinal (quimo) a atividade especfica foi
expressa como U/mL de quimo.
3.3.3. Quimiotripsina
A atividade da quimiotripsina foi ensaiada segundo mtodo proposto por Hummel

(1959) modificado. Foi utilizado como substrato N-benzoil-L-tyrosine etil ester (BTEE) em
26
um meio de reao contendo: 1 mM de BTEE em metanol: gua 2:3 (v:v); tampo Tris/HCl
0,1 M pH 7,8; CaCl2.H2O 0,1 M e uma alquota previamente padronizada de homogeneizado
celular como fonte de enzima, para um volume final de 2,0 mL. A reao era acompanhada
em uma densidade ptica de 256 nm e registrada por 1 minuto a 25 C. A atividade especfica
da quimiotripsina dos tecidos foi expressa em mol de tirosina formada por minuto (U) por
mg de protena (U/mg protena = UI). No contedo gastrintestinal (quimo) a atividade
especfica foi expressa em U/mL de quimo.
3.3.4. Amilase
A atividade amilohidroltica foi ensaiada de acordo com a metodologia proposta por

Bernfeld (1955) modificada. Como substrato de reao foi utilizado amido de milho altamente
purificado e sem resduos de hidrlise em um meio de reao contendo: 500 L de soluo de
amido 5 %; 500 L de tampo citrato/fosfato 0,2 M pH 7,0 e 125 L de soluo de NaCl 0,5
% como co-fator enzimtico e alquota previamente padronizada de homogeneizado celular
para um volume final de 1,375 mL. A reao era incubada a 25 C por 30 minutos e
interrompida com a adio de 125 L de soluo de ZnSO4 5 % e 125 L de Ba(OH)2 0,3 N.
Posteriormente, a mistura era centrifugada a 3500 x g por 3 minutos e no sobrenadante era
determinada a concentrao de acares redutores a 690 nm pelo mtodo colorimtrico de
Park & Johnson (1949). Esse mtodo consiste na incubao a 100 C por 15 minutos de uma
alquota previamente padronizada da reao descrita acima em meio contendo 500 L de
ferricianeto de potssio 0,05 % e 500 L de carbonato de sdio 0,53 %. Aps a incubao
eram adicionados 2,5 mL de sulfato frrico de amnio 0,15 % em soluo cida com Dupanol
sdico. O mesmo procedimento foi realizado para o contedo gastrintestinal (quimo). Uma
soluo padro de glicose 1 mM foi utilizada como referncia. A atividade especfica dos
tecidos foi expressa em mol de acares redutores totais por minuto (U) por mg de protena
(U/mg protena = UI). A atividade do contedo gastrointestinal (quimo) foi expressa em
U/mL de quimo.
27
3.4. Protena total
O teor de protena total foi determinado nos homogeneizados utilizados nas

determinaes enzimticas e o resultado foi utilizado no clculo das atividades especficas das
enzimas. A quantificao foi feita pelo mtodo descrito por Bradford et al. (1976). Depois de
feitas as diluies apropriadas para cada tecido, 10 l de cada amostra foram colocados em
duplicata numa microplaca e 200 l do reagente de Bradford foram adicionados aos poos. As
concentraes de protena foram estimadas contra uma soluo padro de albumina e a leitura
das amostras era feita em leitor de micro-placas (Molecular Devices) a 620 nm.
3.5. Anlise estatstica
Depois de avaliada a parametricidade dos dados, os valores mdios obtidos para as

diferentes enzimas ensaiadas, nas diferentes condies experimentais, foram comparados pelo
teste no paramtrico de Mann-Whitney observando-se um nvel de significncia de P<0,05.
Todos os valores esto apresentados como mdia DP (desvio padro).
4. Resultados
4.1. Experimento I
As atividades enzimticas digestivas de P. mesopotamicus em jejum foram menores

em relao aos peixes alimentados, na maioria dos casos (Tabela 2). As atividades
amilohidroltica e proteolticas do trato gastrintestinal (Tabela 2) e do quimo (Tabela 3) de P.
mesopotamicus foram maiores entre seis e 12 horas aps a alimentao, apresentando reduo
significativa aps 24 horas.
28
Tabela 2. Atividade das enzimas digestivas da parede do trato digestrio de P. mesopotamicus aps a alimentao
Enzima
Seo
Perodo ps-alimentao (horas)

Jejum
0,5
12
24
Protease inespecfica
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
0,130,018d
0,0590,022d
-
0,230,063b
0,3240,11b
0,1340,045b
0,0380,015c
0,230,04b
0,3610,044b
0,0690,009c
0,0960,02b
0,270,025b
0,3550,093b
0,3090,046a
0,1860,071a
0,420,086a
0,6840,108a
0,290,057a
0,1480,038a
0,240,065b
0,2800,082b
0,0030,001d
Tripsina
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
0,240,09c
0,150,035b
0,370,11c
0,10,01c
0,520,07b
0,160,05b
0,820,19a
0,2270,066a
0,290,09a
0,60,12ab
0,1940,033a
0,220,06ab
0,340,05c
0,0710,01c
Quimiotripsina
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
0,7470,072ab
0,630,02d
0,4160,031d
0,440,03c
1,150,12b
0,3160,037e
0,940,17ad
0,860,05c
0,6620,082b
0,870,09a
1,160,03b
1,1540,084a
0,620,05b
1,340,11a
0,6450,12bc
0,730,1bd
0,950,13c
0,5150,088c
Amilase
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
1,460,12b
11,222,36b
6,851,22a
2,930,5a
1,070,19c
11,212,19b
2,950,36b
1,30,21d
1,390,29bc
11,41,94b
4,021,14b
1,970,5bc
1,720,51a
6,661,54c
3,250,8b
1,960,5bc
1,60,62b
15,182,73a
6,880,88a
2,550,58ac
1,710,43a
11,92,5ab
2,030,77c
1,960,44b
As mdias (DP) das atividades enzimticas para n=6 esto expressas em U/mg de protena. Letras diferentes na mesma linha significam diferenas estatsticas (p<0,05).
29
Tabela 3. Atividade das enzimas digestivas do quimo de P. mesopotamicus aps a alimentao
Enzima
Seo
Perodo ps-alimentao (h)

0,5
12
24
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
0,470,08a
9,021,64cd
11,481,6b
1,60,3ab
11,541,61bd
13,820,8a
2,020,23a
0,2840,054b
13,380,58ab
14,190,3a
1,860,13ab
0,1770,043c
13,990,23a
13,670,66a
1,540,26b
0,1960,055c
7,571,75c
1,470,82c
0,370,07c
Tripsina
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
5,260,33a
20,272,98d
30,833,57d
3,040,4b
2,440,38b
44,960,75b
161,0214,71b
27,890,9a
6,130,82a
53,315,33a
230,335,4a
26,043,14a
0,730,13c
33,635,96c
89,3613,09c
27,046,55a
0,610,14c
10,201,38e
0,0970,034e
-
Quimiotripsina
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
12,351,97bc
15,012,71c
-
13,822,44bd
38,443,87b
-
16,92,1ad
49,891,61a
-
19,192,36a
36,421,8b
-
10,241,35c
4,31,06d
-
Amilase
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
43,488,61a
164,843,6c
132,2724,1c
-
34,772,69a
329,323,1ab
227,145,6b
152,475,1a
2,060,87d
308,739,14b
341,627,3a
142,4916,94a
17,117,49c
376,637,5a
318,936,9a
77,410,6b
32,640,035a
202,823,5c
79,3322,29d
29,496,23c
As mdias (DP) das atividades enzimticas para n=6 esto expressas em U/mL de quimo. Letras diferentes na mesma linha significam diferenas estatsticas (p<0,05).
30
A atividade proteoltica inespecfica foi observada em toda parede e quimo do trato

digestrio. Na parede do estmago, essa atividade foi menor de 0,5 at 6 horas aps a
alimentao apresentando um aumento significativo aps as 12 horas, enquanto que no
quimo, a maior atividade foi observada 0,5 horas aps a alimentao seguida de uma
diminuio nos horrios subseqentes. A no deteco de atividade enzimtica 2 horas aps a
alimentao no quimo est, provavelmente, relacionada a erros na coleta. As maiores
atividades proteolticas inespecficas no perodo ps-alimentao foram observadas nos cecos
pilricos (Tabelas 2 e 3). Nesta poro do trato digestrio, observou-se uma correlao
fortemente positiva (P= 0,72) entre as atividades enzimticas da parede e do quimo. As
atividades enzimticas das paredes dos cecos pilricos, intestino anterior e posterior
apresentaram um perfil muito semelhante (Figura 1a). As atividades enzimticas do quimo
destas pores apresentaram um perfil semelhante ao observado nas respectivas paredes
(Figura 1b).
(a)
Jejum
0,5 hora
2 horas
6 horas
12 horas
24 horas
0,8
0,7
(U/mg protena)
0,6
0,5
0,4
bbb
0,3
0,2
(b)
b
b
aa
a
a
d
d
0,1
0,0
Estmago
Cecos pilricos
b
c
Intestino anterior Intestino posterior
Figura 1. Perfil da atividade proteoltica inespecfica na parede (a) e no quimo (b) do trato
digestrio de P. mesopotamicus aps 15 dias de alimentao, determinada aps a
interrupo da dieta em diferentes intervalos de tempo.
31
Exceto a parede do estmago, a atividade trptica foi observada em todas as pores

do trato digestrio e no quimo (Tabelas 2 e 3). As atividades trptica dos cecos pilricos e do
intestino anterior apresentaram o mesmo perfil tanto na parede do trato digestrio quanto no
quimo, embora no tenha sido detectada atividade na parede do intestino anterior at 2 horas
aps a alimentao e 24 horas aps (Figura 2). No intestino posterior a atividade trptica
mostrou-se discretamente maior na parede do trato 6 horas aps a alimentao, enquanto que
no quimo a atividade manteve-se constante das 2 at as 12 horas aps a alimentao. Os
menores valores da atividade da tripsina foram observados nesta poro do trato digestrio
(Tabelas 2 e 3). Foi encontrada nos cecos pilricos e intestino posterior uma alta correlao
entre as atividades da parede e do quimo.
(a)
a
1,0
0,8
Tripsina
(U/mg protena)
Jejum
0,5 hora
2 horas
6 horas
12 horas
24 horas
ab
(b)
0,6
c
0,4
a
a
a
0,2
*
0,0
Estmago
ab
b
Cecos pilricos
Figura 2. Perfil da atividade da tripsina na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P.
mesopotamicus aps 15 dias de alimentao, determinada aps a interrupo da
dieta em diferentes intervalos de tempo. (*) Atividade no detectada.
32
A atividade da quimiotripsina no foi observada no estmago e no quimo do intestino

posterior (Figura 3). As maiores atividades para esta enzima foram observadas na parede e no
quimo do intestino anterior (Tabelas 2 e 3). Na parede dos cecos pilricos, a atividade da
quimiotripsina foi maior em 2 e 6 horas aps a alimentao e no quimo entre 6 e 12 horas
(Tabelas 2 e 3). Na parede do intestino anterior, a quimiotripsina apresentou maior atividade
em 12 horas aps a alimentao, e no quimo, 6 horas aps a alimentao. No intestino
posterior a maior atividade foi observada na parede 6 horas aps a alimentao. A correlao
entre as atividades da parede e do quimo foi baixa.
Jejum
0,5 hora
2 horas
6 horas
12 horas
24 horas
(a)
1,6
a
1,4
0,6
0,4
b
b
40
35
bd
ab
0,8
45
c
a
1,0
bc
c
30
25
20
bd
bc
15
ad
a
c
c
10
0,2
0,0
*
Estmago
5
Cecos pilricos
0,5 hora
2 horas
6 horas
12 horas
24 horas
50
ad
55
Quimiotripsina
(U/mL quimo)
Quimiotripsina
(U/mg protena)
1,2
(b)
*
Estmago
Cecos pilricos
Figura 3. Perfil da atividade da quimiotripsina na parede (a) e no quimo (b) do trato

digestrio de P. mesopotamicus aps 15 dias de alimentao, determinada aps a
interrupo da dieta em diferentes intervalos de tempo. (*) Atividade no
detectada.
A atividade amilohidroltica foi observada em todo trato digestrio de P.

mesopotamicus. As maiores atividades registraram-se nos cecos e intestino anterior, tanto na
parede quanto no quimo (Tabelas 2 e 3). Na parede do estmago, a menor atividade foi
observada 0,5 e 2 horas aps a ltima alimentao, elevando seus valores a partir de 6 horas
(Tabela 2). No quimo do estmago as maiores atividades foram observadas aps 0,5 e 2 horas
(Tabela 3). Nos cecos pilricos, a parede apresentou maior atividade em 12 horas (Tabela 2).
No quimo dos cecos pilricos, a amilase manteve-se praticamente constante desde 2 at 12
33
horas aps a alimentao (Tabela 3). No intestino anterior, a atividade amilohidroltica

decresceu at 6 horas apresentando aumento aps 12 horas e retornando aos menores valores
aps 24 horas. No quimo desta poro do intestino, a atividade amilohidroltica aumentou at
6-12 horas decrescendo aos menores valores em 24 horas aps a ltima alimentao (Tabelas
2 e 3). O perfil de ambas as atividades (Figura 4) mostra uma correlao positiva de P = 0,7.
Na parede do intestino posterior, a atividade da amilase manteve-se constante de 2 a 12 horas,
decrescendo aps 24 horas. No quimo a amilase foi constante entre 2 e 6 horas, decrescendo
de 12 a 24 horas aps a alimentao (Tabelas 2 e 3).
Jejum
0,5 hora
2 horas
6 horas
12 horas
24 horas
(a)
20
18
16
b b
a
b
6
4
2
0
aba
b c bc
ab
350
b
c
a
d
ac
bcbc b
Cecos pilricos
b
c
200
150
100
50
250
Estmago
400
300
12
10
450
Amilase
(U/mL quimo)
Amilase
(U/mg protena)
14
ab
0,5 hora
2 horas
6 horas
12 horas
24 horas
(b)
a
d
Estmago
b
c
c a
Cecos pilricos
Figura 4. Perfil da atividade da amilase na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P.
mesopotamicus aps 15 dias de alimentao, determinada aps a interrupo da
dieta em diferentes intervalos de tempo.
4.2. Experimento II
As atividades das enzimas amilohidroltica e proteolticas na parede e no quimo do

trato gastrintestinal de P. mesopotamicus esto apresentadas nas tabelas 4 e 5. Os valores das
atividades enzimticas para os peixes que permaneceram em jejum esto apresentados na
tabela 4.
34
Tabela 4. Atividade das enzimas digestivas da parede do trato digestrio de P. mesopotamicus alimentados com nveis crescentes de protena
Enzima
Seo
Protena Bruta na dieta

Jejum
20 %
26 %
32 %
38 %
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
0,140,032c
-
0,1510,076b
0,130,058c
0,120,036c
0,0960,022c
0,1870,044b
0,310,058b
0,160,053c
0,150,029b
0,4060,099a
0,440,044a
0,40,068b
0,210,052a
0,4690,056a
0,40,054a
0,50,11a
0,0980,026c
Tripsina
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
0,340,052c
0,780,1b
0,540,061ad
0,320,086c
0,520,1c
0,410,035b
0,360,069bc
0,80,08b
0,610,055a
0,530,097a
0,950,1a
0,460,084bd
0,410,053b
0,830,09b
0,260,048c
Quimiotripsina
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
0,960,09a
1,20,14bc
1,160,13ab
0,710,09b
1,40,27ab
1,240,13a
0,530,07d
1,440,3a
0,880,15c
0,620,06c
1,420,15a
1,090,076b
0,40,06e
1,140,11c
0,920,14c
Amilase
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
0,490,09d
4,621,06c
4,251,33c
2,350,54c
5,032,42a
17,852,73a
18,412,82ab
11,022,09a
3,820,96a
17,941,41a
17,531,9b
10,561,74a
2,530,69b
17,312,73ab
16,970,9ab
10,21,87a
1,720,29c
15,541,9b
19,572,14a
8,371,49b
As mdias (DP) das atividades enzimticas para n=9 esto expressas em U/mg de protena. Letras diferentes na mesma linha significam
diferenas estatsticas (p<0,05).
35
Tabela 5. Atividade das enzimas digestivas do quimo de P. mesopotamicus alimentados com nveis crescentes de protena
Enzima
Seo
Protena Bruta na dieta

20 %
26 %
32 %
38 %
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
0,550,15a
4,841,53c
4,40,46c
2,40,69b
0,250,09b
7,780,8b
23,95,58b
5,70,96a
0,20,017b
8,191,5b
42,887,81a
6,281,03a
0,050,029c
12,922,79a
31,079,73b
6,940,77a
Tripsina
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
5,60,99b
14,21,29d
26,874,4c
2,20,69c
8,341,05a
17,072,43c
51,5214,68b
28,967,39a
7,740,92a
22,523,96b
116,8326,82a
14,761,93b
4,430,81b
33,666,42a
106,2028,20a
16,582,66b
Quimiotripsina
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
8,891,67b
23,54,95c
2,280,75c
9,772,07b
24,286,11c
13,032,13a
14,02,98a
47,726,53a
8,811,28b
14,952,00a
37,273,86b
9,422,17b
Amilase
Estmago
Cecos pilricos
Intestino anterior
Intestino posterior
0,990,13c
233,8126,54b
287,070,6b
127,2627,68c
1,20,27c
233,831,3b
324,962,7b
264,838,6a
2,770,96b
288,850,5a
506,670,2a
153,832,1b
4,20,41a
303,851,7a
332,449,3b
198,573,8ab
As mdias (DP) das atividades enzimticas para n=9 esto expressas em U/mL de quimo. Letras diferentes na mesma linha significam diferenas estatsticas (p<0,05).
36
As atividades de protease inespecfica foram mais altas nos nveis de 32 e 38 % de PB

em todas as sees do trato digestrio de P. mesopotamicus, com uma exceo no intestino
posterior para 38 % de PB. Essas atividades foram significativamente menores em animais
alimentados com 20 % de PB (Tabela 4). O perfil da atividade proteoltica inespecfica
mostrado na figura 5 e a correlao desta atividade no quimo com as atividades
correspondentes das paredes do trato digestrio apresentou-se positiva, exceo feita ao
estmago.
(a)
Jejum
20% PB
26% PB
32% PB
38% PB
0,7
(U/mg protena)
0,6
a a
0,5
0,4
(b)
0,3
b b
0,2
a
c c
c
c
b
c
0,1
0,0
Estmago
Cecos pilricos
Figura 5. Perfil da atividade proteoltica inespecfica na parede (a) e no quimo (b) do trato
digestrio de P. mesopotamicus alimentados com nveis crescentes de protena
bruta.
37
No foi detectada atividade trptica na parede de estmago de P. mesopotamicus,

entretanto o quimo desta poro apresentou esta atividade enzimtica com valores mximos
em 26 e 32 % de PB (Tabelas 4 e 5). Na parede dos cecos pilricos, a maior atividade trptica
foi observada em peixes alimentados com 32 % de PB. No quimo, essa atividade foi crescente
at o nvel 38 % PB. Na parede do intestino anterior a maior induo foi registrada em peixes
alimentados com nveis de 32 % de PB e a menor em animais alimentados com 20 % de PB.
No quimo, esta atividade foi crescente at 32 % de PB. Observou-se uma forte correlao
positiva de 0,9, entre parede e quimo, nesta poro do trato. No intestino posterior a atividade
da tripsina foi maior em peixes alimentados com 26 % de PB decrescendo aos menores
valores em 38 % de PB. No quimo a maior atividade foi observada em animais alimentados
com 26 % de PB e a menor atividade em 20 % de PB (Tabelas 4 e 5). A figura 6 mostra o
perfil de atividade da tripsina nas diferentes sees do trato digestrio.
1,1
1,0
0,9
(b)
Jejum
20% PB
26% PB
32% PB
38% PB
(a)
b
160
a
140
0,6
0,5
c
c c
0,4
100
ad
bd
b
c
0,3
0,2
Tripsina
(U/mL quimo)
Tripsina
(U/mg protena)
0,7
0,0
120
0,8
0,1
20% PB
26% PB
32% PB
38% PB
80
Estmago
40
20
60
b a a b
d c
Estmago
b b
c
0
Cecos pilricos
Cecos pilricos
Figura 6. Perfil da atividade da tripsina na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P.
mesopotamicus alimentados com nveis crescentes de protena bruta. (*) Atividade
no detectada.
38
Assim como a tripsina, a quimiotripsina no foi observada na parede e, diferentemente

da tripsina, essa enzima no foi observada no quimo do estmago de P. mesopotamicus. A
atividade quimiotrptica da parede dos cecos pilrico foi maior nos peixes alimentados com
20 % de PB. Nestas condies, a atividade do quimo foi a menor (Figura 7). Na parede do
intestino anterior a atividade de quimiotripsina foi constante em peixes alimentados com at
32 % de PB apresentando reduo significativa em 38 %. No quimo a maior atividade de
quimiotripsina foi observada em peixes alimentados com 32 % de PB. Na parede do intestino
posterior a maior atividade de quimiotripsina foi observada em peixes alimentados com 20%
de PB e as menores atividades foram observadas em 26 % e 38 %. No quimo do intestino
posterior de P. mesopotamicus as maiores atividades da quimiotripsina foram observadas em
peixes alimentados com 26 % de PB e as menores com 20 % (Tabelas 4 e 5). Todas as
pores do trato apresentaram correlao negativa, entre parede e quimo, em relao a essa
enzima.
ab
1,6
bc
Quimiotripsina
(U/mg protena)
1,4
1,2
a
a
c
ab
0,6
c
e
0,0
35
30
20
a a
Estmago
5
Cecos pilricos
b b
10
25
15
0,4
0,2
45
40
0,8
50
a
c
1,0
20% PB
26% PB
32% PB
38% PB
55
Quimiotripsina
(U/mL quimo)
1,8
(b)
Jejum
20% PB
26% PB
32% PB
38% PB
(a)
*
Estmago
b b
c
Cecos pilricos
Figura 7. Perfil da atividade da quimiotripsina na parede (a) e no quimo (b) do trato

digestrio de P. mesopotamicus alimentados com nveis crescentes de protena
bruta. (*) Atividade no detectada.
No estmago de P. mesopotamicus, foram observadas as maiores atividades

amilohidrolticas nos animais alimentados com 20 % e 26 % de PB. No quimo desta poro
do trato digestrio, a maior atividade amilohidroltica foi observada em 38 % PB. Os cecos
pilricos e o intestino anterior foram as pores do trato digestrio mais relevantes na
produo de amilase, sendo essa atividade constante desde os nveis de 20 % at 32 % PB. No
39
quimo dos cecos pilricos a maior atividade da amilase foi detectada nos peixes alimentados
com 32 % e 38 % de PB. A amilase da parede do intestino anterior no mostrou diferenas
significativas entre os tratamentos. No quimo desta poro, a maior atividade foi observada
nos animais alimentados com nveis de 32 % de PB sem diferena significativa entre os
outros nveis. A atividade da amilase da parede do intestino posterior no foi
significativamente diferente entre os peixes alimentados com nveis de 20 %, 26 % e 32 % de
PB, apresentando reduo significativa apenas nos animais alimentados com 38 % de PB. No
quimo desta seo, a maior atividade registrou-se no nvel de 26 %. A figura 8 apresenta o
perfil amilohidroltico em cada seo do trato digestrio. Todas as pores do trato
apresentaram correlao negativa entre parede e quimo em relao atividade da amilase.
Porm, a interseco das atividades da amilase da parede e do quimo de todas as pores do
trato digestrio de P. mesopotamicus apontam para um timo de aproximadamente 32 % de
protena bruta (Figura 9).
(a)
Jejum
20% PB
26% PB
32% PB
38% PB
25
a
20
b
ab
b
Amilase
(U/mg protena)
ab
ab
(b)
15
a a
b
10
a
c
b
d
Estmago
c
c
c
Cecos pilricos
Figura 8. Perfil da atividade da amilase na parede (a) e no quimo (b) do trato digestrio de P.
mesopotamicus alimentados com nveis crescentes de protena bruta.
40
parede
quimo
100
Amilase %
80
60
40
20
20 26 32 38
Estmago
20 26 32 38
20 26 32 38
20 26 32 38
Cecos pilricos
Int. anterior
Int. posterior
Figura 9. Interseco das atividades da amilase da parede e do quimo do trato digestrio de

P. mesopotamicus alimentados com nveis crescentes de protena bruta.
41
5. Discusso
5.1. Experimento I
Vrios estudos sobre o processo digestivo em peixes comparam a atividade das

enzimas digestivas nas diferentes espcies (FISH, 1960; MUNILLA-MORN &
SABORIDO-REY, 1996ab; FURN et al., 2005; FURN et al., 2008), com o hbito
alimentar (JNS et al., 1983; SABAPATHY & TEO, 1993; CHAKRABARTI et al., 1995;
HIDALGO et al., 1999; CHAN et al., 2004), a idade (KUZMINA, 1996; CHIU & PAN,
2002) e o estgio de desenvolvimento (ZAMBONINO-INFANTE & CAHU, 1994; CAHU et
al., 2004; LO & WENG, 2006). Outros estudos esto voltados para a caracterizao das
enzimas digestivas em peixes (DAZ-LPEZ et al., 1998; CHONG et al., 2002; WANG et al.,
2006; KUMAR et al., 2007; LIU et al., 2008). Porm em relao atividade enzimtica do
contedo gastrintestinal, os dados so escassos em peixes. Em P. mesopotamicus pudemos
observar que desde o perodo ps-prandial at 24 horas aps alimentao existe atividade
enzimtica digestiva expressa tanto na parede do trato digestrio quanto na luz, ou seja, nas
secrees digestivas. Resultados semelhantes foram descritos para a parede e luz do trato
digestrio de Salmo salar (EINARSSON et al., 1996). O. mykiss apresenta atividade digestiva
no contedo intestinal at 72 horas aps a ltima alimentao (FALGE & SHPANNKHOF,
1976). Todavia esta atividade e secreo em P. mesopotamicus se do de maneira
diferenciada, quer para os diferentes tipos de enzimas, quer nas diferentes pores do trato.
No estmago de P. mesopotamicus, assim como observado em Tilapia mossambica
(FISH, 1960), S. aurata (DEGUARA et al., 2003), Symphysodon aequifasciata (CHONG et
al., 2002), P. corruscans (LUNDSTEDT et al., 2004) e C. macropomum (ALMEIDA et al.,
2006; CORRA et al., 2007), as atividades proteolticas esto basicamente restritas protease
cida. Apesar da no especificidade do mtodo de reao, esta atividade enzimtica, quer
devido ao local de origem quer ao pH de ao, deve-se em sua maior parte, provavelmente,
pepsina. Chong et al. (2002) tambm atribuem a atividade proteoltica cida inespecfica em
S. aequifasciata pepsina.
No primeiro ensaio, visamos obter a dinmica de secreo enzimtica para a luz do
rgo durante o perodo digestivo. Observou-se no estmago que, ao longo de 24 horas,
ocorreu uma reduo da atividade na luz enquanto que na parede pareceu ocorrer sntese da
42
enzima at 12 horas aps a ltima alimentao. A partir desse ponto observou-se uma reduo
da ordem de 50 % no contedo enzimtico da parede. Essa reduo pode ser devido a uma
diminuio da sntese enzimtica devido sada do alimento do estmago e/ou secreo
mnima e constante da enzima para a luz. Essa reduo provavelmente se acentuaria ao longo
do tempo, a julgar pelos valores mdios observados na condio de jejum.
A pergunta inicial pode ser parcialmente respondida frente a esse perfil de atividades.
A presena de alimento protico na luz do estmago no esgota seu contedo enzimtico,
mas, mais que isso, estimula a produo de protease cida. Essa produo, entretanto, no
deve ser devido necessidade de maior contedo enzimtico para os processos digestivos,
visto que a atividade na luz diminui na medida em que o contedo de enzimas da parede
aumenta. A partir de 12 horas aps a alimentao o teor de protease da luz do estmago
permanece pequeno e constante at as 24 horas. Este dado poderia explicar a reduo no
contedo de enzima observado na parede e sugere ainda uma secreo mnima e constante de
enzimas para a luz. Uma hora aps a alimentao a atividade pptica no contedo estomacal
de S. salar tambm aumenta seguido de reduo ao longo de 25 horas e o mesmo efeito
observado na parede do estmago (EINARSSON et al., 1996). Esses autores salientam que a
ingesto do alimento estimula a sntese e secreo do pepsinognio at uma hora aps a
alimentao o que causa aumento da atividade na parede e na luz do estmago. Na luz do
estmago de C. gariepinus, observa-se secreo de pepsina at 2,5 horas aps a alimentao,
e aps 4 horas a atividade decresce gradualmente aos nveis pr-alimentares at 10 horas
(UYS et al., 1987). Para estes autores isto indica que pouca ou nenhuma enzima est sendo
secretada no estmago e que as enzimas so parcialmente inativadas, possivelmente por
desnaturao ou devido ligao irreversvel com o substrato.
O perfil do contedo de enzimas de atividade alcalina na parede dos cecos pilricos de
P. mesopotamicus similar ao observado para as proteases cidas do estmago. Fato tambm
observado em C. gariepinus (UYS et al., 1987). Alm disso, altas atividades foram
observadas na parede dessa poro do trato. Essa alta atividade observada nos cecos pilricos
pode estar relacionada presena do pncreas difuso presente nesta regio do intestino, sendo,
portanto, muito importante no processo digestivo (CHESLEY, 1934). Essa atividade
proteoltica observada em P. mesopotamicus deve-se, provavelmente, a um conjunto de
enzimas cujos principais componentes devem ser tripsina e quimiotripsina. Essas enzimas
foram observadas nos cecos pilricos de outras espcies tais como Siganus canaliculatus e L.
calcarifer (SABAPATHY & TEO, 1993), B. amazonicus (CAMILO, 2007) e C.
macropomum (CORRA et al., 2007).
43
O intervalo de 12 horas ps-alimentao parece crtico para esse conjunto de enzimas.

A partir desse ponto, a atividade enzimtica da parede reduzida em mais de 50 %,
permanecendo, entretanto, em valores 80 % acima dos valores atingidos pelo estado de jejum
(15 dias). Essa reduo faz supor que ao longo dos perodos de jejum haja uma diminuio
dos teores desse conjunto de enzimas, provavelmente por secreo constante, tal como
suposto para as enzimas cidas do estmago. Para B. amazonicus foi sugerido que a presena
do alimento no intestino importante para a secreo das enzimas, j que h uma reduo da
atividade enzimtica digestiva nos peixes em jejum, quando comparada com a atividade de
peixes alimentados (CAMILO, 2007). Einarsson et al. (1996) tambm observaram reduo da
atividade enzimtica digestiva em S. salar em jejum.
A poro anterior e a posterior do intestino apresentaram atividades proteolticas
alcalinas menores que as observadas na poro pilrica do trato digestrio. O jejum causou
diminuio de, praticamente, toda a atividade das proteases alcalinas e este perodo j foi
marcante 24 horas aps a ltima alimentao. Tengjaroenkul et al. (2000) afirmam que as
baixas atividades enzimticas observadas no intestino posterior esto relacionadas
reabsoro nesta poro do trato, sugerindo a um papel secundrio na produo de enzimas.
Tal como relatado para B. amazonicus (VIEIRA, 2002), B. orbignyanus (VIEIRA,
2002) e C. macropomum (CORRA et al., 2007), no foi observada atividade trptica na
parede do estmago de P. mesopotamicus. Porm em algumas espcies de peixes tem sido
relatada a presena de tripsina e quimiotripsina na parede do estmago (CHAKRABARTI et
al., 1995; LUNDSTEDT et al., 2004; MELO, 2004). Apesar de no ser observada atividade
trptica na parede do estmago, a luz desta poro apresentou considervel atividade quando
comparada s observadas na luz dos cecos pilricos e intestino. Essas observaes poderiam
ser explicadas por um refluxo do contedo pilrico para a luz do estmago. Entretanto o
significado efetivo desta atividade trptica dependeria dos valores de pH que possam ser
registrados nesta poro, visto que a tripsina no apresentaria atividade em pHs cidos, tal
como esperado no estmago. Em A. japonica, por exemplo, no observada atividade de
tripsina e quimiotripsina em pH abaixo de 2 (CHIU & PAN, 2002).
O aumento da atividade trptica at 6 horas aps a ltima alimentao, decaindo em 24
horas a valores prximos dos observados em jejum, na parede dos cecos pilricos,
acompanhado pelo perfil observado na luz dos cecos. Este quadro corrobora a hiptese
levantada anteriormente na anlise do perfil de protease inespecfica alcalina, ou seja, a
secreo enzimtica para a luz deve ser constante ao longo do tempo. Entretanto o perfil
trptico revela uma necessidade mais rigorosa de intermitncia na alimentao. Enquanto a
44
avaliao do perfil proteoltico alcalino inespecfico sugere um perodo de realimentao de

12 horas, o perfil trptico sugere um intervalo de 6 horas. Porm Murashita et al. (2005)
observaram em Seriola quinqueradiata que o tempo de restaurao da atividade trptica para
cecos pilricos nesta espcie de 48 horas, e ainda salientaram que a sntese da tripsina
acionada pela ingesto do alimento e secreo desta enzima. Em A. japonica, as atividades de
tripsina e quimiotripsina atingiram um mximo 11 horas aps a alimentao, tanto na parede
quanto no contedo intestinal (CHIU & PAN, 2002). Entretanto S. aurata exibiu nvel
mximo de atividade proteoltica no contedo intestinal 5 horas aps a alimentao
(FOUNTOULAKI et al., 2005). Os resultados obtidos com a parede do intestino anterior em
P. mesopotamicus no permitem concluses, entretanto, a luz desta poro do trato apresentou
altas atividades quando comparada s outras pores do trato. Seu perfil permite as mesmas
concluses anteriores sobre o intervalo de alimentao, ou seja, 6 horas. Os resultados obtidos
no intestino posterior so pouco conclusivos a no ser que, em face da relevante atividade da
luz dessa estrutura, sua participao na digesto de protenas no pode ser desconsiderada.
A atividade quimiotrptica em P. mesopotamicus, assim como em B. amazonicus
(VIEIRA, 2002), B. orbignyanus (VIEIRA, 2002) e C. macropomum (CORRA et al., 2007),
no foi observada no estmago. Curiosamente essa atividade enzimtica no foi detectada
nem mesmo na luz desta poro, tal como verificado com a tripsina. Considerando-se que o
refluxo deva ter sido o responsvel pela presena da atividade trptica observada no quimo do
estmago, primeira vista, a no deteco de quimiotripsina na luz deste rgo poderia ser
devido menor resistncia da estrutura enzimtica a condies adversas do estmago (pH),
levando a uma rpida desnaturao da enzima.
A parede do trato digestrio, exceto o estmago, sintetiza quimiotripsina igualmente
em toda sua extenso, fato tambm observado em C. macropomum (CORRA et al. 2007) e
L. calcarifer (SABAPATHY & TEO, 1993), o que nos faz pensar na importncia desta
enzima no processo digestivo de protenas em P. mesopotamicus. Observou-se uma tendncia
crescente de sntese de quimiotripsina na parede at as primeiras duas horas ps-alimentao
nas pores iniciais do intestino (cecos pilricos). Entretanto nas pores anterior e posterior
do intestino esse intervalo mais prolongado; cerca de 6 a 12 horas. A correspondncia
observada entre os perfis da parede e os respectivos perfis da luz da poro, sugere, tal como
discutido anteriormente, uma secreo enzimtica constante. A no deteco da atividade
quimiotrptica na luz da poro posterior do intestino pode ser devido a condies adversas do
meio, como por exemplo, pH ou outros fatores advindos de ao da flora bacteriana normal,
levando a uma desnaturao parcial e conseqente perda da atividade enzimtica ou a
45
processos de reabsoro enzimtica como j sugerido por outros autores (HOFER &
SCHIEMER, 1981; TENGJAROENKUL et al., 2000).
A julgar pelo momento de reduo da sntese de quimiotripsina na parede dos cecos
pilricos, poderamos sugerir que 6 horas seria o perodo mximo ps-alimentao a partir do
qual os peixes deveriam ser realimentados. Entretanto interessante observar que a reduo
da atividade quimiotrptica nos cecos pilricos ocorre antes das pores posteriores do trato
digestrio. Esse fato nos faz pensar que a induo de sntese na parede do trato digestrio seja
devido presena de fatores indutores, presentes no bolo alimentar, os quais se esgotariam
mais rapidamente nas pores proximais do trato, permanecendo por perodos maiores nas
pores terminais. Einarsson et al. (1996) observaram que o jejum ocasiona uma reduo
gradual da atividade de tripsina e quimiotripsina na luz intestinal de S. salar, argumentando
que a secreo altamente reduzida com a sada do alimento.
A atividade amilohidroltica em P. mesopotamicus foi observada em todo o trato
digestrio, registrando-se as mximas atividades nos cecos pilricos e as menores, no
estmago, confirmando os dados encontrados por Moraes & Bidinotto (2000) para esta
mesma espcie e corroborando os dados obtidos por Almeida et al. (2006) e Corra et al.
(2007) para C. macropomum. Segundo Camilo (2007), a presena da amilase no intestino de
B. amazonicus um indicador positivo da habilidade do peixe na utilizao de carboidratos.
Entretanto deve ser considerado que as determinaes das atividades desta enzima em P.
mesopotamicus deram-se em um meio de reao em pH neutro. Assim, a atividade da amilase
observada na parede do estmago deveria ser otimizada para verificao da possvel presena
de uma isozima com caractersticas e papel diferenciado nesta poro do trato digestrio. Fish
(1960) sugeriu que a presena da amilase no estmago de T. mossambica resultante da
adsoro da enzima intestinal na mucosa gstrica.
Com exceo dos dados obtidos na luz do estmago 6 horas aps a alimentao, cujos
valores no permitem qualquer concluso, e dos valores ps-jejum que no puderam ser
determinados em face da ausncia de material na luz, poder-se-ia admitir que a sntese e a
secreo de amilase no estmago parecem ser contnuas ao longo de 24 horas de perodo psprandial. interessante observar que, diferentemente das atividades proteolticas, a atividade
da amilase na parede de todo o trato digestrio no foi afetada por um jejum de 15 dias. C.
gariepinus em jejum apresentou altas atividades de amilase no intestino, mostrando que altos
nveis de atividade dessa enzima so mantidos apesar da ausncia do alimento no intestino
(UYS et al., 1987). Tambm diferentemente das atividades proteolticas, a amilase da parede
das pores do trato no apresentou o mesmo perfil observado na luz do trato. Isto sugere que
46
os processos de sntese e secreo de amilase no esto diretamente inter-relacionados. De

fato, o perfil da parede do trato digestrio no parece apresentar um padro definido,
sugerindo muito mais uma invariabilidade nos teores enzimticos do que uma resposta a
qualquer sinalizao. Falam a favor disso os altos valores de amilase encontrados aps jejum
de 15 dias. Entretanto a luz dos cecos pilricos e do intestino anterior mostraram um perfil de
amilase aparentemente responsivo a alguma sinalizao. O perfil da luz dos cecos pilricos
pareceu responder antes do intestino anterior, aps meia hora, atingindo o mximo valor aps
2 horas e permanecendo com valores altos at 12 horas. O intestino anterior iniciou sua
resposta aps 2 horas, atingindo o mximo aps 6 horas e permanecendo assim at 12 horas.
S. aurata atinge um nvel mximo de atividade de amilase no contedo intestinal 5 horas
depois da alimentao (FOUNTOULAKI et al., 2005). Considerando-se o caminho do bolo
alimentar, provvel que seus produtos de digesto, particularmente de carboidratos, sejam os
responsveis pela sinalizao de secreo da amilase em P. mesopotamicus.
5.2. Experimento II
Os estudos relacionados ao requerimento protico de peixes so de grande importncia

para a aqicultura (DEBNATH et al., 2007), principalmente aqueles voltados s enzimas
digestivas, os quais informam a capacidade de determinadas espcies de peixes em digerir e
utilizar os componentes da dieta (HIDALGO et al., 1999). A partir do experimento I,
estabelecemos que o melhor momento para se comparar as atividades da luz e da parede do
trato digestrio foi 6 horas aps a ltima alimentao, pois a partir deste intervalo nem todas
as pores do trato apresentavam contedo.
Apesar de iniciar a digesto qumica dos alimentos, a luz do estmago de P.
mesopotamicus no apresentou atividades proteolticas proporcionais aos teores de protena
da dieta, e um jejum de 24 dias esgotou a atividade proteoltica inespecfica nesta poro.
Como foi observado, teores crescentes de protena diminuram a atividade proteoltica da luz
do estmago. Paralelamente, aumentaram o contedo de protease da parede. O contedo
crescente de protease da parede do estmago em paralelo ao teor de protena da rao j havia
sido previamente descrito para esta espcie (MORAES & BIDINOTTO, 2004). Esses dados
permitem afirmar que, apesar de os teores crescentes de protena da dieta provocarem um
aumento do teor de protease na parede, a sua digesto no estmago pode estar limitada pela
47
reduo sensvel de sua secreo. O conjunto de dados atuais mostra a impossibilidade de se

estimar um teor timo de protenas da dieta a partir do perfil digestivo do estmago de P.
mesopotamicus, visto que os perfis enzimticos da luz e da parede so inversamente
proporcionais. Entretanto os contedos de enzima na luz e na parede se igualam para um teor
de protena prximo a 28 % com cerca de 40 % de carboidratos.
A responsividade proteoltica da parede do estmago, em funo da variao da
protena bruta da dieta, foi tambm observada em C. macropomum (ALMEIDA et al., 2006).
Esses autores ainda supem que o estmago deste peixe essencialmente proteoltico devido
a altas atividades enzimticas desta poro quando comparada ao resto do trato. A atividade
proteoltica cida inespecfica da parede estomacal aumenta de forma linear em R. quelen,
quando alimentados com nveis crescentes de protena (MELO, 2004). Este autor salienta que
esta resposta mostra um carter indutivo desta enzima e, portanto, a possibilidade de ajuste de
nutrientes para otimizao das dietas. P. corruscans, alimentados com diferentes nveis de
protena bruta na dieta, no apresentam induo proteoltica no estmago, porm, observa-se
uma alta atividade nesta poro (LUNDSTEDT et al., 2004).
O perfil proteoltico inespecfico alcalino da parede das pores intestinais de P.
mesopotamicus muito parecido com aquele observado no estmago. Apenas os cecos
pilricos dos peixes em jejum apresentaram atividade com valor de atividade prximo aos
peixes alimentados com 20 % de protena, sugerindo que esta porcentagem no suficiente
para uma alta induo. Notou-se que o aumento de protena da dieta induziu o aumento do
contedo de enzima da parede desta poro, fato j descrito anteriormente para esta espcie
(MORAES & BIDINOTTO 2004). Porm diferentemente do estmago, a secreo de
protease alcalina proporcional sntese enzimtica. Hofer (1979), estudando protease em
Rutilus rutilus e Scardinius erythrophthalmus, tambm encontrou relao entre o contedo
protico da dieta e a atividade de protease alcalina. Debnath el al. (2007), trabalhando com
nveis crescentes de protena bruta na dieta de L. rohita observaram responsividade das
enzimas digestivas s mudanas da composio da dieta. Os nveis acima de 25 % de protena
induziram a produo de proteases. A atividade proteoltica total em C. batrachus aumenta
com o aumento de protena da dieta (MUKHOPADHYAY et al., 1978). Apesar das
crescentes atividades enzimticas na luz do trato de P. mesopotamicus, o aumento tambm
observado nas atividades das paredes um claro indcio de que altos teores de protena na
dieta de P. mesopotamicus no foram capazes de causar um esgotamento do contedo
enzimtico da parede, sugerindo a capacidade de adaptao dessa espcie dieta oferecida. A
poro posterior do intestino de P. mesopotamicus apresentou atividade proteoltica alcalina,
48
porm, sua atividade de duas a sete vezes menor quando comparada atividade do intestino
anterior. De acordo com Jun-sheng et al. (2006) o declnio da atividade proteoltica do
intestino anterior ao posterior ocorre em funo do deslocamento do contedo intestinal ao
longo do intestino do hbrido O. niloticus x O. aureus. Segundo Hofer & Schiemer (1981), a
atividade proteoltica no contedo intestinal geralmente diminui do intestino anterior para o
posterior, considerando este fato um processo de reabsoro ativo das enzimas proteolticas
pela mucosa intestinal. Levando-se em considerao o trao adaptativo do P. mesopotamicus,
e em resposta pergunta do experimento II, podemos afirmar que essa espcie ajusta seu
perfil digestivo proteoltico do intestino frao protica da dieta para uma melhor utilizao
deste macro-nutriente, dentro de um intervalo de 20 a 38 %.
Os padres de tripsina seguem, com forte correlao positiva, os padres de protease
inespecfica alcalina dos cecos e do intestino anterior, o que sugere que os padres observados
para essa atividade proteoltica sejam em grande parte representados por aquela protease.
Assim, as implicaes e concluses tiradas dos resultados observados com a atividade
proteoltica inespecfica devem ser exatamente os mesmos, podendo-se agora atribu-los a
uma enzima especfica, a tripsina. Em B. amazonicus foi observada semelhana entre o perfil
da atividade da tripsina e da protease inespecfica nos cecos pilricos, sendo sugerido pelo
autor que esta enzima apresenta um papel chave na digesto da protena nesta poro do trato
(CAMILO, 2007). A induo da atividade da tripsina foi observada ao longo do trato
intestinal de R. quelen (MELO, 2004). O aumento de protena na dieta at 50 % induz a
atividade trptica no intestino de C. batrachus (MUKHOPADHYAY et al., 1978), e os
autores salientam que a variabilidade nas atividades proteolticas pode indicar o requerimento
protico para a espcie.
A atividade trptica do estmago, neste segundo ensaio, confirma os dados do primeiro
ensaio; a ausncia da atividade na parede e presena na luz. Porm a atividade observada na
luz do estmago no apresenta o mesmo perfil dos cecos. Uma vez admitida que a atividade
trptica observada na luz do estmago seja devido a refluxo, essa atividade estaria mais
diretamente ligada a um ritmo de movimentao do bolo alimentar do que aos teores
enzimticos da luz.
O intestino posterior apresentou um perfil de induo trptica na parede que
acompanhado pela luz. As atividades semelhantes de tripsina do intestino posterior e dos
cecos pilricos mostraram a relevncia desta poro do trato intestinal no processo digestivo.
Todavia o perfil desta poro exacerbou a tendncia que se observa nas outras pores; um
pico de mxima atividade com reduo nos teores maiores de protena diettica. Este padro
49
acompanhado pelas atividades da luz. Com os perfis observados para tripsina, pode-se
precisar os teores de protena diettica para um mximo de 32 %. A partir desses valores,
observa-se uma tendncia de reduo dos contedos de tripsina da parede acompanhada pelos
teores de enzima na luz, o que sugere o incio de um declnio no aproveitamento das protenas
dietticas. Fernandes et al. (2001), concluram que um nvel de 22 % de protena bruta atende
as exigncias e proporciona bom desempenho para juvenis de P. mesopotamicus com peso
inicial similar a este experimento, porm, somente parmetros zootcnicos foram avaliados.
Os perfis enzimticos da quimiotripsina no apresentaram qualquer correlao com as
atividades de protease inespecfica alcalina. Curiosamente, a somatria das atividades
relativas de quimiotripsina e tripsina no refletem a atividade relativa de protease inespecfica
total, o que faz pensar em outras possibilidades para entender esse perfil enzimtico. Por
exemplo, poderamos supor que, alm das atividades de quimiotripsina e tripsina, outras
enzimas de atividade alcalina estariam envolvidas no conjunto de proteases alcalinas
inespecficas. Outra possibilidade seria a de que o ensaio das diferentes enzimas em uma
nica condio de reao, a de protease inespecfica, no permita a realizao dessa somatria
de atividades que estariam sendo de fato realizadas em condies sub-timas para cada uma
delas.
Seis horas aps a alimentao, os teores de quimiotripsina da parede do trato
digestrio de P. mesopotamicus mostraram uma tendncia geral de reduo. Diferentemente
do que se pode concluir para as atividades de tripsina ou de proteases inespecficas, onde o
aumento de protena diettica resulta em aumento daquelas atividades na parede, esses dados
no permitem admitir que a quimiotripsina seja responsiva ao aumento dos teores de protena.
Lundstedt et al. (2004) estudando P. corruscans encontraram resultado semelhante e
argumentaram que essa resposta no permite assumir que esta enzima seja responsiva,
sugerindo que seja constitutiva. Entretanto teores crescentes de protena na dieta de P.
mesopotamicus demandam um aumento da secreo de quimiotripsina para a luz. Esta
demanda , certamente, a responsvel pela tendncia de reduo desta enzima, observada nas
paredes do trato digestrio. Este perfil enzimtico sugere que as taxas de sntese de
quimiotripsina em P. mesopotamicus no acompanham as taxas de secreo demandadas
pelos nveis de protena da dieta. Alm disso, ao longo de toda essa faixa experimentada de
teor protico diettico, observa-se uma tendncia de estabilizao das atividades de
quimiotripsina ao redor de 32 % de protena na dieta. Este dado sugere que at seis horas de
atividade ps-prandial esses teores de protena, apesar de reduzirem o contedo enzimtico da
parede, no prejudicam a digesto das protenas.
50
As atividades de amilase observadas nesse experimento corroboram aquelas do

experimento anterior, ou seja, as menores atividades amilohidrolticas foram observadas no
estmago. A amilase da parede do estmago de P. mesopotamicus decresceu
proporcionalmente diminuio do teor de carboidratos da dieta. Em contrapartida, as
menores atividades da amilase detectadas na luz desta poro do trato digestrio foram
observadas nos peixes que receberam a dieta contendo os maiores teores de carboidratos.
Desta forma, quanto pergunta inicial do experimento II, pode-se inferir que teores crescentes
de carboidratos na dieta aumentam os teores de amilase da parede do estmago transferindo-a
para a luz de forma inversamente proporcional ao contedo de carboidratos da dieta. As
caractersticas indutivas da amilase em P. mesopotamicus j foram descritas anteriormente
(MORAES & BIDINOTTO, 2000). Esses autores observaram alta atividade amilohidroltica
nos cecos e baixas atividades no estmago desta espcie, assim como neste estudo. A
atividade da amilase do intestino de peixes parece estar diretamente associada ao nvel de
amido da dieta (CORRA et al., 1998; MORAES & BIDINOTTO, 2000; CORRA et al.,
2007). A composio da dieta modula a atividade da amilase em B. amazonicus (CAMILO,
2007). A atividade amilohidroltica do estmago de P. corruscans responsiva aos nveis de
amido da dieta, embora os maiores contedos de amido prejudiquem sua induo,
provavelmente pela intolerncia de espcies carnvoras ao amido (LUNDSTEDT et al., 2004).
A diminuio da atividade da amilase no quimo em funo do aumento do nvel de amido na
dieta foi observada em O. mykiss (SPANNHOF & PLANTIKOW, 1983), no qual os autores
consideraram essa reduo da atividade da amilase resultado de uma inibio da enzima
depois da adsoro s molculas de amido. O atual conjunto de dados no permite dizer qual
concentrao de carboidratos esgotaria o contedo de amilase da parede do estmago de P.
mesopotamicus, ou mesmo se isso viria ou no a ocorrer. Todavia pode-se dizer que a
interseco das atividades de amilase da parede e da luz do estmago aponta para um timo
aparente de aproximadamente 32 % de protena e 38 % de ENN. Porm como j dito no
primeiro experimento, as determinaes da atividade desta enzima deram-se em um meio de
reao em pH neutro. Assim, a atividade da amilase observada na parede do estmago deveria
ser otimizada para verificao da possvel presena de uma isozima com caractersticas e
papel diferenciado nesta poro do trato digestrio.
Diferentemente das proteases, cujas atividades no jejum foram prximas s atividades
dos peixes alimentados com 20 % de protena, a amilase apresentou valores de atividades
relativamente menores no jejum quando comparado com os peixes alimentados. Isso sugere
51
que um jejum de 24 dias afeta a sntese de amilase em todas as pores do trato digestrio de
P. mesopotamicus.
Os cecos apresentaram um perfil de atividade amilohidroltica muito semelhante ao
observado no estmago, ou seja, atividade crescente na parede, diretamente proporcional ao
contedo de carboidrato da dieta e atividade na luz inversamente proporcional ao contedo de
carboidratos. Assim, para essa poro do trato digestrio pode-se ter as mesmas inferncias
feitas no estmago inclusive quanto aos pontos de interseco entre as atividades observadas
na parede e na luz. Por outro lado, B. melanopterus exibe uma amilase induzida no contedo
intestinal com o aumento de carboidrato na dieta. Essa resposta deve-se correlao entre a
atividade enzimtica e a dieta (REIMER, 1982). Debnath et al. (2007) no encontraram
mudanas significativas na atividade da amilase em L. rohita alimentados com nveis
crescentes de protena e decrescentes de carboidrato. O contedo de carboidrato da dieta no
induziu ou reprimiu a atividade da amilase. Em C. macropomum os cecos pilricos
apresentam alta atividade amilohidroltica alm de uma caracterstica indutiva frente s
mudanas da composio da dieta (ALMEIDA et al., 2006; CORRA et al., 2007). R. quelen
apresenta atividade decrescente da amilase com o aumento do contedo de protena da dieta
em todos os segmentos do trato digestrio (MELO, 2004). Este autor explica este fato pela
reduo relativa dos teores de carboidrato nas dietas experimentais. A atividade da amilase
diminui significativamente no intestino de P. gonionotus devido ao aumento de protena e
diminuio do carboidrato na dieta (MOHANTA et al., 2008).
Esse mesmo perfil no foi verificado, todavia, para as outras pores do trato
digestrio de P. mesopotamicus, a no ser pela atividade observada na parede do intestino
posterior.
As pores anterior e posterior do intestino no apresentaram um padro definido que
permita uma clara interpretao. Entretanto considerando-se as variaes percentuais dos
teores de amilase da parede, pode-se afirmar que mesmo as maiores concentraes de
carboidrato na rao no reduzem os teores de amilase na luz abaixo de 50 %. Tal como
proposto anteriormente, essa manuteno dos teores enzimticos da parede pode ser devido a
uma constante sntese de amilase e a independncia entre os processos de sntese e secreo.
Alm disso, em resposta questo levantada para a realizao do experimento II, possvel
admitir que os teores de carboidrato da dieta no so capazes de esgotar o contedo de
amilase da parede. Portanto ao longo do intestino, o aproveitamento dos carboidratos da dieta
no estaria limitado pelo seu contedo.
52
6. Concluses
6.1. Experimento I
1) A produo de protease cida e alcalina prejudicada por jejuns superiores a 12

horas;
2) O contedo de enzimas da parede do estmago, cecos e intestino no se esgota em
funo da alimentao;
3) Parece haver uma secreo residual de atividade enzimtica para a luz do estmago,
a qual justificaria a reduo gradual do teor de protease cida na parede;
4) O contedo de enzimas da parede dos cecos e intestino parece ser estimulado pela
presena de alimento, durante o processo digestivo;
5) O teor de proteases alcalinas da luz dos cecos e intestinos proporcional ao teor das
paredes;
6) Parece haver uma secreo residual de atividade enzimtica tambm para a luz dos
cecos e intestinos, a qual justificaria a correlao entre paredes e a luz.
6.2. Experimento II
1) A protease cida e alcalina foram responsivas aos teores de protena da dieta;

2) A taxa de secreo da protease cida no proporcional sua taxa de sntese,
diferentemente da secreo alcalina;
3) Teores crescentes de protena na dieta implicam em aumento do teor de tripsina na
parede e na luz at um valor timo de 32 %;
4) Valores at 32 % de protena diettica no prejudicam a digesto quimiotrptica de
protenas em pacu, at seis horas ps-alimentao;
5) O aumento do teor de protena da rao sinaliza o aumento de secreo da
quimiotripsina;
6) A taxa de sntese de quimiotripsina parece no acompanhar a de secreo at seis
horas aps a alimentao;
53
7) A digesto de carboidratos mais efetiva no intestino, onde os teores de carboidrato

da dieta no limitam a secreo da amilase pelo esgotamento de seu contedo na parede;
8) A digesto de carboidratos nos cecos e no estmago est limitada a um teor mximo
de 38 % de ENN e 32 % de protena.
54
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE

ESTUDOS DOS PROCESSOS DIGESTIVOS PROTEOLTICO E

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

ESTUDOS DOS PROCESSOS DIGESTIVOS PROTEOLTICO E

Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

ESTUDOS DOS PROCESSOS DIGESTIVOS PROTEOLTICO E

Dissertao de Mestrado de Joyce Visentainel

Prat. Or. Gilberto Maraes

Aos meus genitores, artfices da vida,

Deus, supremo criador, pelo dom do Esprito Santo iluminando-me o entendimento;

O conhecimento sobre as enzimas digestivas permite entender alguns aspectos da necessidade

In conclusion the protein

Material e mtodos .............................................................................................................................................. 21

1.1. Consideraes gerais

O Brasil um pas que apresenta uma riqueza incomparvel em espcies de peixes

1.2. Nutrio em peixes

A nutrio um ramo da fisiologia que estuda todos os conjuntos de aes que

aminocidos (N.R.C., 1993). A exigncia protica em peixes pode apresentar variaes

aproveitar o amido, pois a atividade amilohidroltica mostrou-se indutiva neste peixe

(FOUNTOULAKI et al., 2005) e Hippoglossus hippoglossus (HATLEN et al., 2005). Assim,

1.3. Digesto e enzimas digestivas

Os nutrientes dos alimentos, antes de serem utilizados metabolicamente, devem passar

Diferentes hbitos alimentares e preferncias por certos alimentos revelam o perfil

O lipdeo diettico, principalmente na forma de triacilglicerol, hidrolisado em cidos

1.4. A espcie Piaractus mesopotamicus

O pacu, P. mesopotamicus, tambm conhecido como pacu do pantanal, pacu-guau,

(ABIMORAD et al, 2007), bem como a digestibilidade de alguns ingredientes (ABIMORAD

H um crescente interesse cientfico sobre a atividade digestiva enzimtica em

Exemplares de juvenis de pacu, fornecidos pelo Centro de Aqicultura da Unesp

3.1. Desenho experimental

O objetivo desse experimento foi avaliar o perfil de atividades enzimticas digestivas

Os objetivos deste experimento foram: determinar o nvel de protena bruta na dieta

Tabela 1. Formulao e composio das dietas experimentais

Mistura vitamnica e mineral*

Energia bruta (Kcal/Kg)

3832,28 4033,53 4008,65 4019,29

Energia digestvel (Kcal/Kg)3

3210,71 3299,69 3252,89 3090,68

*ROVIMIX PEIXE - Roches (Homan La Roche, Switzerland) (ingredientes/kg suplementado): vitaminas:

3.2. Preparao dos extratos enzimticos

3.2.2. Homogeneizados celulares

Os tecidos utilizados como fonte de enzima foram previamente triturados em

3.3. Determinaes enzimticas

3.3.1. Protease inespecfica

A atividade proteoltica inespecfica foi ensaiada segundo o mtodo da hidrlise

Aps 45 minutos de incubao a 25 C, a reao era interrompida com 500 L de cido

A atividade da tripsina foi determinada cineticamente segundo Hummel (1959)

A atividade da quimiotripsina foi ensaiada segundo mtodo proposto por Hummel

A atividade amilohidroltica foi ensaiada de acordo com a metodologia proposta por

3.4. Protena total

O teor de protena total foi determinado nos homogeneizados utilizados nas

3.5. Anlise estatstica

Depois de avaliada a parametricidade dos dados, os valores mdios obtidos para as

As atividades enzimticas digestivas de P. mesopotamicus em jejum foram menores

Perodo ps-alimentao (horas)

Perodo ps-alimentao (h)

A atividade proteoltica inespecfica foi observada em toda parede e quimo do trato

Intestino anterior Intestino posterior

Exceto a parede do estmago, a atividade trptica foi observada em todas as pores

Intestino anterior Intestino posterior

A atividade da quimiotripsina no foi observada no estmago e no quimo do intestino

Intestino anterior Intestino posterior