Interferencias en la analtica hematolgica

lunes 03 de octubre del 2011, 13:13h

Una mala tcnica de extensin en porta, fijar con alcohol metlico antes de que la muestra est seca o la presencia de precipitaciones del colorante son fallos que
pueden inutilizar una muestra. Conozcamos los errores ms habituales en los anlisis hematolgicos para evitar cometerlos.
Rodrigo De Vivar Gonzlez
Santiago de la Puente Herriz
Centro de Investigacin y Anlisis Biolgicos. Madrid
Imgenes cedidas por los autores

Son varios los mtodos que se pueden utilizar para hacer un anlisis de la morfologa de las clulas de la sangre: un examen en fresco sin coloracin, una coloracin vital u
observar las clulas fijadas y teidas.

Anlisis de plasma

Para la correcta obtencin de datos hematolgicos

fiables, se requiere que la sangre conserve sus
caractersticas lo ms correctamente posible. Para
esto se han desarrollado diferentes anticoagulantes
que, adems de mantener la sangre en estado lquido,
han de producir el mnimo nmero de alteraciones o
artefactos en la muestra. Los utilizados
habitualmente son:
Citrato: es el anticoagulante ms utilizado para la
obtencin de plasma y se emplea sobre todo en las
pruebas de coagulacin. Acta sobre el calcio.
Heparina: es una sustancia anticoagulante que se
encuentra de forma natural en el organismo y su
mecanismo de accin se basa en la neutralizacin de
la trombina. Las extensiones realizadas con l
tienden a producir artefactos en la morfologa de las
clulas sanguneas, por lo que debemos evitar en la

medida de lo posible su utilizacin.

EDTA: el etilendiaminatretaactico es el mejor
anticoagulante para todos los fines hematolgicos y
se debe recomendar para su empleo rutinario. Esta
sustancia preserva las clulas adecuadamente, no
produce artefactos importantes en la sangre y la
muestra as tratada es apta para la preparacin de
extensiones varias horas despus de realizada la
extraccin. Adems, se evita en gran parte la
agregacin plaquetaria.

Interferencias ms comunes en la analtica

hematolgica
Hay que tener en cuenta que hay que llenar los
tubos con anticoagulante hasta la seal:
- Un exceso de anticoagulante puede provocar la
retraccin de los hemates, lo cual puede originar una
disminucin en los valores del HCT y VCM, lo que
implica un aumento del CHCM.
- Un exceso de sangre con respecto al anticoagulante
puede provocar una coagulacin insuficiente o
inadecuada, que dar origen a la formacin de
microcogulos que falsearn los recuentos de
plaquetas y leucocitos disminuyendo sus valores.

Los recuentos plaquetarios son bastante complicados

de realizar en los contadores hematolgicos, ante la
tendencia a la agregacin. Para evitar esta alteracin
se procede a la realizacin de extensiones para
contarlos.
Si la sangre obtenida no se va analizar antes de las
dos o tres horas despus de la extraccin, se debe
conservar la muestra refrigerada para evitar que los
glbulos rojos aumenten de tamao, lo que

provocara un incremento de los hemates. Esto, a su

vez, dara lugar a un aumento del HCT y del VCM y
a una disminucin del CHCM. Este mismo efecto lo
pueden producir fuertes leucocitosis.
La lipemia es origen de la aparicin de artefactos en
los resultados hematolgicos. Aparece despus de la
ingestin y, debido a ella, los hemates se vuelven
ms frgiles y tienden a fragmentarse de manera que
se origina una diminucin de la CHCM por el
aumento de la densidad ptica.
La hemolisis artificial debida a la lisis de las clulas
provoca un descenso en el valor del HCT y del VCM
y esto implica un aumento del CHCM.

Preparacin de la extensin
El examen de la sangre teida es lo ms habitual y, para ello, se hace una extensin de sangre -o frotis- en porta y se tie para observar al microscopio. Principalmente se utiliza
para hacer recuentos de los diferentes tipos de leucocitos.

Mtodo del portaobjetos

Se coloca una gota de sangre pequea aproximadamente a 1 cm del borde de uno de los portaobjetos. Se apoya el otro, por delante de la gota, con un ngulo entre ambos
portaobjetos de 30 a 40. Luego se hace retroceder el portaobjetos hasta que toque la gota de sangre y se la extiende por la superficie de contacto entre los portas de manera
rpida y uniforme.

Observaciones al mtodo
En una extensin de sangre realizada correctamente se observar una parte ms gruesa en donde estaba la gota de sangre; despus, una zona uniforme y, al final, una de menor
espesor y deshilachada (cabeza, cuerpo y cola de la extensin). La extensin de sangre no ha de llegar al borde del porta ni tener estras ni vacuolas y los bordes de la extensin no
deben tocar la parte final del porta.

El espesor de la extensin depende del ngulo entre los portaobjetos, del tamao de la gota y de la rapidez con que se realiza. Si el espesor es muy grueso, las clulas aparecen
amontonadas y se identifican con dificultad.

Una buena preparacin para contar leucocitos es aquella en la que los glbulos rojos aparecen algo amontonados y con los leucocitos unos cerca de otros pero no superpuestos
entre s.

Es fundamental tener en cuenta que hay que utilizar portas perfectamente limpios y desengrasados.

Defectos ms frecuentes en la preparacin de una extensin

En ocasiones, por una mala tcnica se obtienen extensiones de mala calidad. Por ejemplo:
En las que se ha puesto una gota muy gruesa se suele llegar al final del portaobjetos, por lo cual la gota de sangre no se extiende bien y no se forma la zona de flecos.
Si el porta se levanta antes de acabar de hacer la extensin, aparecen zonas no homogneas en la capa de clulas.
La presencia de estras en la gota de sangre dificulta la lectura de las clulas.

Figura 1. Extensin no homognea por la presencia de grasa.

Figura 2. Extensin corta, no homognea, por la presencia de grasa.

Figura 3. Extensin corta, no homognea, debido a la deshidratacin.

Figura 4. Extensin corta, por levantar el portaobjetos antes de tiempo.

Fijacin
Una vez secas las extensiones el paso siguiente ser su fijacin, que se realiza con alcohol metlico. As se facilita la conservacin y la fijacin de las clulas, que se adhieren al
porta, para que no se desprendan en el momento de la tincin.

Antes de fijar en alcohol metlico el porta, debemos comprobar que la extensin est completamente seca, para as evitar que se rompa la pelcula de tincin tras el paso del primer
colorante y al lavar el exceso de ste. Ello originara una extensin inadecuada con zonas sin teir y con los hemates perforados, que son el resultado de la humedad que dificulta
el contacto entre las clulas y el colorante.

Tinciones
En los estudios hematolgicos se usan mucho los colorantes formados por mezclas de lquidos cidos y bsicos, por lo que las tinciones son polcromas: las partes cidas
(basfilas) de las clulas se teirn con los lquidos bsicos (color rosa) y las bsicas (acidfilas), con los lquidos cidos (color azul).

Para las tinciones de sangre se utilizan varios tipos de colorantes: Romanowsky, Wright, Giemsa y Diff-Quik.

La que nosotros utilizamos con mayor frecuencia es la coloracin de Diff-Quik por su rapidez y facilidad en la preparacin, mantenimiento y conservacin. Esta tcnica tie de
manera excelente los orgnulos el citoplasma de las clulas y el ncleo y los nuclolos.

Figura 5. A. Extensin bien hecha.

B. Tamao de la gota adecuado.
C. Evitar gotas de sangre con burbujas.

Caractersticas de una buena tincin

Una muestra bien teida no debe tener precipitaciones del colorante ni artefactos de coloracin. La presencia de un precipitado sobre la extensin se puede deber al uso de
portaobjetos sucios, al secado durante el periodo de tincin, al lavado inadecuado del porta al final de dicho periodo -en especial si ste se mantiene en horizontal-, a la filtracin
inadecuada del colorante o al depsito de polvo sobre el porta o la extensin.

En una extensin bien realizada se deben diferenciar correctamente los eritrocitos con su color anaranjado claro u oscuro, segn su nivel de hemoglobina. Se deben ver bien las
granulaciones de los neutrfilos, de los eosinfilos (con su color rosa ntido) y los linfocitos (de azul oscuro).

Si el colorante es muy cido, los eritrocitos se vern de color rojo brillante y los ncleos de los leucocitos de color azul plido o, a veces, incoloros. Si la coloracin se ve muy rosada
es debido a una tincin insuficiente o a un tiempo de lavado prolongado. Si el colorante es demasiado bsico, los eritrocitos se vern de color azul pizarra.

Las extensiones ya teidas se tienen que secar al aire poniendo el porta inclinado, casi en posicin vertical para que el agua sobrante del lavado escurra por efecto de la gravedad.
Nunca se debe agitar el porta con sacudidas violentas, ya que el agua que queda puede modificar el punto exacto de tincin y la nitidez de la preparacin.