UNIVERSIDAD NACIONAL

DEL CALLAO
Escuela profesional de Ingenieria de
Alimentos
Curso:

Laboratorio de Bioquimica General

Tema: Efecto de pH y Temperatura sobre la

Actividad de la Catalasa
Alumnos:
AZABACHE GLANDEZ MANUEL
CAMARGO LEON SERGIO
MILLA LUYO OLIVER
SANTOYO LUCAS JEFFERSON

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa2

I.

INTRODUCCIN

Las enzimas son el producto de expresin de genes; por tanto, su actividad

puede verse modulada por el genotipo del individuo.
El estudio de la actividad enzimtica tiene gran importancia en ciencia
bsica, bioqumica y biotecnologa. Asimismo, la presencia de
distintas isoenzimas y su actividad enzimtica diferencial puede ser
empleada como marcador bioqumico de normalidad o anormalidad
(diagnostico de enfermedades). Las enzimas con protenas (con la
excepcin de los RNA catalticos) producidos por los seres vivos que
catalizan con gran eficacia las reacciones biolgicas, actuando de
forma especfica y regulada. Las anteriores propiedades hacen que
las enzimas se puedan aplicar, de forma muy eficaz, a procesos
industriales tales como la obtencin de frmacos, procesado de
alimentos y en analtica. La cintica enzimtica es la parte de la
enzimologa que estudia la velocidad de las reacciones catalizadas
enzimticamente y el efecto que diferentes factores fsicoqumicos sobre dicha velocidad.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa3

II. OBJETIVOS

Determinar la intensidad de reaccin de la enzima catalasa de origen animal y

vegetal.
Determinar el efecto de temperatura, pH y concentracin de sales sobre la
actividad cataltica de la catalasa.
Calcular la velocidad mxima de reaccin peroxidasa.
Determinar la concentracin de sustrato necesario para alcanzar de la
velocidad mxima.
Preparar el extracto enzimtico de distintos medios biolgicos y comprobar su
actividad.
Emplear un mtodo continuo para medir la velocidad enzimtica.
Evaluar el efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica.

III. MARCO TERICO

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa4

CATALASA
La catalasa en una enzima que la podemos encontrar en muchos organismos vivos, y cataliza
la reaccin de descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno.

El perxido de hidrgeno es uno de los productos del metabolismo celular en diversos

organismos, pero dada su potencial toxicidad, es transformado enseguida por la enzima catalasa.
En la industria, se tambin se utiliza la enzima catalasa, para diferentes fines. Por ejemplo,
se usa en la industria textil, para eliminar residuos de perxido de hidrgeno.
Adems, la catalasa cumple una funcin protectora contra determinados microorganismos
patgenos, sobre todo anaerobios. Las bacterias anaerobias, mueren al estar en contacto con
oxgeno, es por esta razn que el oxgeno producido por esta enzima tiene efecto bactericida
sobre estos microorganismos. Tanto es as, que la ausencia de dicha enzima por defectos
genticos, llamada acatalasemia o enfermedad de Takahara, causa importantes infecciones en la
mucosa bucal, pudiendo llegar a causar la prdida de dientes y graves lesiones en los maxilares y
tejidos blandos de la cavidad bucal.
La reaccin catalizada por esta enzima, ocurre
en dos etapas, en las cuales interviene el hierro
del grupo hemo de la hemoglobina como cofactor.

La presencia de la enzima catalasa en los

tejidos de los organismos, se puede demostrar en
un sencillo experimento de laboratorio. Tomamos un trocito de hgado, y lo colocamos en el
fondo de un tubo de ensayo. Luego aadimos 5 ml de agua oxigenada (que es lo mismo que
perxido de hidrgeno). Inmediatamente observaremos un intenso burbujeo, que se debe al
desprendimiento de oxgeno de la reaccin catalizada por la enzima catalasa.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa5

Este sencillo experimento puede repetirse con distintos tejidos animales y vegetales, en
los cuales encontraremos diferentes intensidades de burbujeo, dependiendo de la cantidad de
catalasa presente en el tejido.

Todas las enzimas son protenas. Por lo tanto, todas las enzimas sufren desnaturalizacin
frente al calor. Esto quiere decir que cuando la temperatura es muy elevada, la enzima pierde
su estructura terciaria, por lo tanto su sitio activo tambin se desnaturaliza, y ya no puede
cumplir su funcin. Este hecho se puede demostrar repitiendo el experimento anterior, pero
habiendo hervido previamente los trocitos de hgado. Cuando aadimos el agua oxigenada, no se
observa el burbujeo.

La determinacin de presencia o ausencia de catalasa resulta til en el rea de

bacteriologa, para diferenciar colonias de estreptococos, que son catalasa negativos, de
estafilococos o micrococos, que son bacterias que contienen catalasa.
Tambin se utiliza para diferenciar los gneros Bacillus (catalasa positivo) de Clostridium
(catalasa negativo).
Para realizar la prueba de la catalasa, se toma una colonia aislada del cultivo bacteriano y
se coloca sobre un portaobjetos. Sobre ella se deja caer una gota de perxido de hidrgeno. Si
el resultado es positivo, se observar la formacin de burbujas.
Si el cultivo bacteriano fue realizado en agar sangre, hay que tener precaucin de no llevar
un trozo de agar con el asa cuando se levanta la colonia, porque de esta manera se pueden dar
resultados falso positivos.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa6

PEROXIDASA
La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidacin de ciertos compuestos dadores de
hidrgeno, como fenoles y aminas aromticas (o-fenilendiamina) por medio de perxidos (

).

La peroxidasa presenta como grupo prosttico un grupo Hem, cuyo tomo central de hierro
forma complejos con diferentes compuestos, como los cianuros y la hidroxilamina, inhibindose
su actividad enzimtica.
La actividad enzimtica depende del vegetal (los rbanos picantes son especialmente
activos), del substrato oxidable que se emplea como reactivo y del pH y temperatura a que se
trabaja.
Como la mayora de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una
de las que precisan mayor temperatura y ms tiempo para su inactivacin. Posee, adems, la
propiedad peculiar de la regeneracin enzimtica. Este fenmeno consiste en que al inactivarla
por medio del calor recupera parcialmente su actividad despus de un cierto tiempo. Esto ha
sido explicado, aduciendo que la fraccin proteica de la enzima sufre una desnaturalizacin slo
parcial, con prdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto,
producindose luego una reversin de la protena a su estado normal por recombinacin de sus
grupos hidrgenos o sulfhidrlicos.
Este efecto del calor sobre la actividad peroxidsica es muy, importante en la industria de
alimentos y la regeneracin enzimtica de la peroxidasa puede causar serios problemas en los
caracteres organolpticos. Se ha demostrado en el laboratorio que esta actividad enzimtica
puede detenerse totalmente, si el calentamiento es suficientemente largo, de manera que sobre
30" la regeneracin es muy dbil generalmente.
La investigacin de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado o
blanqueo de verduras y tambin en el control de pasteurizacin de la leche. As, a la
temperatura de pasteurizacin, la lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en cambio, si
la leche es sobrecalentada (ms de 80-85C) la peroxidasa pierde su actividad en forma
definitiva.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa7

ACTIVIDAD ENZIMATICA
Todas las reacciones metablicas que ocurren en nuestro organismo se hayan mediados por
enzimas, estas en su mayora son de naturaleza proteica (hasta hace poco tiempo se consideraba
que todas las enzimas eran protenas, sin embargo, se ha comprobado la existencia de varias
molculas de RNA catalticas).
Puede definirse a las enzimas como catalizadores, capaces de acelerar las reacciones qumicas
en ambos sentidos, sin consumirse en ella, ni formar parte de los productos. La diferencia
fundamental es que tienen gran especificidad de reaccin o sea por el sustrato sobre el cual
actan.
Las enzimas reducen la energa de activacin necesaria para llevar a cabo una reaccin; es
decir, reducen la barrera de energa que hay que sobrepasar para que la reaccin se lleve a cabo.

En la clula las enzimas pueden encontrarse en el lquido celular (citosol) o bien pueden estar
fijadas a determinadas organelas (ej. Adheridas a las mitocondrias).

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa8

Ciertas enzimas requieren de ciertos compuestos
orgnicos, termoestables para poder cumplir con su
funcin

cataltica,

estas

molculas

se

denominan

coenzimas, generalmente tiene bajo peso molecular y

suelen ser claves en el mecanismo cataltico. La
apoenzima unida a la coenzima constituye la holoenzima.
Estas

molculas

termoestables

generalmente

son

vitaminas o metales.

Segn el tipo de reaccin que catalizan las enzimas

se dividen en 6 clases o grupos:
1)

Oxidorreductasas
Catalizan reacciones de oxidacin-reduccin. Entre
las

subclases

deshidrogenasas,

de

este

oxidasas,

peroxidasase hidrolasas.
2)
Transferasas
Catalizan reacciones

grupo

se

encuentran

oxigenasas,

reductasas,

en

las

que

hay

una

transferencia de grupos de una molcula a otra. Entre los ejemplos de estos grupos estn amino,
carboxilo, carbonilo, metilo, fosforilo y acilo (RC=O).
Los nombres comunes triviales suelen incluir el prefijo trans. Entre los ejemplos estn
transcarboxilasas, transmetilasas y transaminasas.
3)
Hidrolasas
Catalizan reacciones en las que se produce la rotura de enlaces por la adicin de agua. Entre
las hidrolasas estn esterasas, fosfatasas y peptidasas
4)
Liasas
Catalizan reacciones en las que se elimina grupos (p.ej., H20, CO2 Y NH3) para formar un
doble enlace. Los ejemplos son liasas, descarboxilasas, hidratasas, deshidratasas, desaminasas y
sintasas.
5)
Isomerasas
Se trata de un grupo heterogneo de enzimas. Las Isomerasas catalizan varios tipos de
reordenamientos intramoleculares. Las epimerasas catalizan la inversin de tomos de carbono
asimtricos. Las mutasas catalizan la transferencia intramolecular de grupos funcionales
6)
Ligasas
Catalizan la formacin de un enlace entre dos molculas de sustrato. La energa para estas
reacciones la aporta siempre la hidrlisis del ATP. Los nombres de muchas Ligasas incluyen el
termino sintetasa. Otras Ligasas se denominan carboxilasas.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa9

Modelos de actuacin de las enzimas

Para explicar la actividad cataltica de las enzimas, se ha propuesto un mecanismo general, en
dos etapas:

En

la

primera etapa, la enzima (E) se une a la molcula de sustrato (S), para formar el complejo enzimasustrato (ES). En una segunda etapa, el complejo se fragmenta dando lugar al producto (P) y a la
enzima (E), que vuelve a estar disponible para reaccionar con otra molcula de sustrato.
Por lo general, la molcula de enzima es mucho mayor que la del sustrato por lo que slo una
pequea parte de la enzima est implicada en la formacin del complejo; esta regin que
interacciona con el sustrato y en la que tiene lugar la reaccin, se denomina sitio activo de la
enzima. El sitio activo es un dominio tridimensional de la enzima con una distribucin de los grupos
nica para posibilitar la unin a su sustrato especfico. Dichos grupos del enzima no tienen por qu
ser necesariamente consecutivos en la secuencia de la protena y reciben el nombre de centros
catalticos.
El modelo ms conocido sobre el mecanismo de reaccin de las enzimas es el de Fischer, quien
propuso que la molcula de sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo
hara una llave al encajar en una cerradura, es decir, que tienen una relacin estructural
complementaria (figura 2) . No obstante, esta hiptesis tiene ciertas limitaciones, as si el centro
activo posee una estructura prediseada para el sustrato, en caso de que sea un proceso
reversible, dicho sitio activo tambin debera estar perfectamente diseado para que encaje el
producto de la reaccin. De la misma forma, la teora de la llave-cerradura tampoco explica bien
algunos fenmenos de inhibicin enzimtica.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa10

Otra hiptesis ms aceptada actualmente es la del enzima flexible o de ajuste inducido

(modelo de Koshland), que sugiere que el sitio activo no necesita ser una cavidad
geomtricamente rgida y preexistente, sino que dicho sitio activo debe tener una disposicin
espacial, precisa y especfica, de ciertos grupos de la enzima que al interaccionar con el
sustrato se adaptan y ajustan a su estructura (Figura 3).

Independientemente del modelo, una vez formado el complejo enzima sustrato, mediante un
mecanismo de distorsin, se activan los enlaces que hay que romper y se aproximan los grupos
que hay que enlazar, favoreciendo la formacin del producto resultante de la reaccin
catalizada y quedando la enzima libre para comenzar de nuevo el proceso cataltico. Una visin
grfica de esta distorsin enzimtica puede observarse con claridad en la enzima hexoquinasa,

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa11

que cataliza la fosforilacin de la glucosa a glucosa-6-fosfato, durante la gluclisis. Como
muestra la Figura 4, la unin de la glucosa hace que dos dominios de la enzima se plieguen uno
hacia el otro, con lo que se cierra la hendidura del sitio activo al que se une la glucosa.

Muchos organismos pueden descomponer el perxido de hidrgeno (H2O2) por la accin de

las enzimas. Las enzimas son protenas globulares responsables de la mayor parte de la
actividad qumica de los organismos vivos. Actan como catalizadores, que son sustancias que
aceleran las reacciones qumicas sin ser destruidas o alteradas durante el proceso. Las enzimas
son extremadamente eficientes y se pueden utilizar una y otra vez repetidamente. Una enzima
puede catalizar miles de reacciones en cada segundo. Tanto los valores de pH como de la
temperatura a los que trabaja la enzima son extraordinariamente importantes. La mayora de
los organismos tienen un intervalo de temperatura preferente en el cual sobreviven y sus
enzimas funcionan mejor dentro de dicho intervalo de temperatura.

Si el ambiente donde se encuentra la enzima es demasiado cido o demasiado bsico, la

enzima puede desnaturalizarse de forma irreversible o transformarse de modo que su forma no
le permita ms realizar su funcionamiento apropiado.
El H2O2 es txico para la mayora de los organismos vivos. Muchos organismos son capaces
de destruir el H2O2 mediante la accin de enzimas antes de que pueda realizar mucho dao.
ElH2O2 se convierte en oxgeno y agua segn la siguiente reaccin:

2 H2O2 2 H2O + O2

Aunque esta reaccin ocurre espontneamente, las enzimas incrementan la velocidad de reaccin
de forma considerable. Se conoce que al menos dos enzimas diferentes catalizan esta reaccin:
a) Catalasa, que se encuentra en animales y protistas;
b) Peroxidasa, que se encuentra en las plantas.
Mucho se puede aprender sobre las enzimas mediante el estudio de la rapidez de reacciones
catalizadas por enzimas. La rapidez de una reaccin puede estudiarse de muy diversas formas
como:

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa12

Midiendo la presin de los productos que aparecen (en este caso, O2)
Midiendo la velocidad de desaparicin del substrato (en este caso, H2O2)
Midiendo la velocidad de aparicin del producto (en este caso, O2 que se desprende como gas)

EFECTOS

DELA

TEMPERATURA

DEL

Ph

SOBRE

LAS

REACCIONES CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS

TEMPERATURA
La temperatura afecta a todas las reacciones qumicas. Cuanto mayor es la
temperatura, mayor es la velocidad de reaccin. La velocidad de reaccin aumenta
debido a que hay ms molculas con la energa suficiente para entrar en el estado de
transicin.las velocidades de las reacciones catalizadas por las enzimas aumentan
tambin al incrementarse la temperatura. Sin embargo, las enzimas son protenas que se
desnaturalizan a temperaturas elevadas. Cada enzima tiene una temperatura ptima ala
que acta con su mxima eficacia. Debido a que las enzimas son protenas, los valores de
temperatura ptima dependen del pH y de la fuerza inica. Si la temperatura se
incrementa ms all de la temperatura ptima,la actividad enzimtica desciende
bruscamente. La temperatura ptima de una enzima normalmente esta cerca de la
temperatura normal del organismo del que procede. Por ejemplo, la temperatura ptima
de la mayora de las enzimas del ser humano est prxima a los 37C.
En general, las enzimas actan muy lentamente a temperaturas de congelacin y
aumenta su actividad cuando la temperatura asciende hasta aproximadamente 45C. La
mayora de los enzimas presentan actividad ptima en el intervalo de 30 a 40C y
comienza a desnaturalizarse por encima de 45C.
Aunque algunos enzimas se desnaturalizan a temperaturas de subcongelacin, la mayora
de ellos permanecen algo activos despus de la congelacin y descongelacin

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa13

pH
La concentracin de ion hidrgeno afecta a las enzimas de diversas formas.
En primer lugar, la actividad cataltica est relacionada con el estado inico del lugar
activo. Las variaciones de la concentracin de ion hidrgeno pueden afectar a la
ionizacin de los grupos del lugar activo. Por ejemplo, la actividad cataltica de una
determinada enzima requiere la forma protonada del grupo amino de una cadena lateral.
Si el pH

es lo suficiente alcalino para que el grupo pierda su protn, la actividad

enzimtica puede deprimirse. Adems, los sustratos pueden afectar tambin a la

actividad enzimtica. Si un sustrato contiene un grupo ionizable, un cambio del pH
puede alterar su capacidad para unirse al lugar activo. En segundo lugar, los cambios de
los grupos ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima.

Los cambios drsticos del pH frecuentemente conducen a la desnaturalizacin. Aunque

unas pocas enzimas toleran cambios importantes de pH, la mayora de las enzimas son
activas dentro de un intervalo estrecho de pH. Por esta razn, los seres vivos emplean
amortiguadores para regular estrechamente el pH. El valor del pH al que la actividad de
una enzima es mxima se denomina pH ptimo.
Los pH ptimos de las enzimas varan considerablemente. Por ejemplo, el pH ptimo dela
pepsina, una enzima proteoltica que se produce en el estmago, es aproximadamente
2.Para la quimo tripsina, que dirige las protenas en el intestino delgado, el pH ptimo es
de aproximadamente 8.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa14

INHIBICIN ALOSTRICA
De gran importancia en el fenmeno de la actividad enzimtica es el hecho de que, en las
protenas, pueden existir dos o cuando menos dos sitios diferentes desde el punto de vista
estreo - especfico y que, adems, estn en lugares distintos. Uno de estos sitios es el
centro activo, donde el sustrato es atacado para dar origen a los productos de la reaccin y
por lo tanto donde reside el aspecto funcional de la protena. El otro sitio denomina sitio
alostrico y en l puede acomodarse de manera complementaria - pero reversible - alguna
sustancia llamada efector alostrico; al efectuarse esta unin se produce una alteracin
discreta de la estructura de la protena, la transicin alostrica, que modifica la actividad
biolgica de la protena, porque altera la distancia, las propiedades del sitio activo.

Es muy importante que el efector alostrico normal no tiene relacin qumica o metablica
alguna con el sustrato de dicha enzima y que su accin tan especfica se debe a que altera
de tal modo la conformacin de la protena que modifica su centro activo. El efecto
alostrico se ha estudiado de manera especial en bacterias, pero ocurre tambin en
animales superiores. En un principio se reconoci como un efecto inhibidor que, por su
caractersticas, fue denominado "por retro- alimentacin" o "por producto final. La
inhibicin alostrica demuestra la alta especializacin de las enzimas que reconocen tanto
al sustrato como al inhibidor, siendo muy especficas para ambos.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa15

IV. MATERIALES, REACTIVOS, EQUIPOS Y MUESTRAS

A) MATERIALES

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa16

pipeta

10 tubos de ensayo

cuchillos

vaso de precipitado

vasos de casa

mortero y piln

termmetro

gradilla

colador

probeta

agua destilada

Pisceta

balanza electrnica

B) REACTIVOS
NaCl, Bicarbonato de Sodio (NaHCO3), Agua Oxigenada.
Cloruro de Cadmio, Cloruro de Calcio, Cloruro de Cobre.

C)
Hgado de res
Papa
Zanahoria
Semilla germinada

MUESTRAS

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa17

Agua destilada

V.

PARTE EXPERIMENTAL
PREPARACION DE LA MUESTRA

Realiza un macerado con la ayuda del mortero y piln con una cantidad
determinada de agua. Con el colador separe los extractos de las muestras de
origen animal y vegetal.

CONDICIONES ESTANDAR
1) Colocamos 5ml de cada muestra en los
tubos

y en otro tubo

destilada

5ml de

agua

que lo utilizaremos como tubo

patrn.
2) Para

comprobar

realizamos
agregndole
todas.
3) La concentracin de enzimas fue diferente
en las muestras. Unas reaccionaron ms
rpido y otras ms lento.

un

quien
barrido

contiene

ms

las

todas

enzimas
muestras

al mismo tiempo 2ml de perxido a

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa18

4) El Hgado fue el ms rpido e intenso

de las muestras de animal convirtiendo
inmediatamente el perxido en agua y
oxgeno.

EFECTO DE TEMPERATURA
1) Para esta prueba escogimos al
hgado como muestra.

HIGADO

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa19

3) En bao mara a 70C de temperatura colocaremos los

tubos de ensayo.

4) El 1er tubo ser retirado a los 30seg e inmediatamente

agregaremos 2ml de perxido. El mismo proceso repetiremos para
los siguientes tubos. Solo que cada tubo tendr diferente tiempo
de retiro como se observa en el cuadro.

1er tubo
2do tubo
3er tubo

1min
3min
6min

4to tubo

9min

5to tubo

12min
15min

6to tubo

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa20

Una vez ya retirado el tubo en el tiempo indicado se le agrega perxido.

Anotaremos las diferentes reacciones que se obtuvieron, la intensidad y el
tiempo.

1) Para esta prueba escogimos a la

zanahoria como muestra.

3) Colocamos 5ml de zanahoria en

cada tubo de ensayo

3) En bao mara a 70C de temperatura colocaremos los

tubos de ensayo.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa21

4) El 1er tubo ser retirado a los 30seg e inmediatamente

agregaremos 2ml de perxido. El mismo proceso repetiremos para
los siguientes tubos. Solo que cada tubo tendr diferente tiempo
de retiro como se observa en el cuadro.

1er tubo
2do tubo
3er tubo

1min
3min
6min

Una vez ya retirado el tubo en el tiempo indicado se le agrega

4to tubo

9min

Anotaremos las diferentes reacciones que se obtuvieron, la

5to tubo

12min
15min

intensidad y el tiempo

6to tubo

1er tubo
2do tubo
3er tubo
4to tubo
5to tubo
6to tubo

perxido.

Una vez ya retirado el tubo en el tiempo indicado se le agrega perxido.

Anotaremos las diferentes reacciones que se obtuvieron, la intensidad y
el tiempo.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa22

MUESTRA

TIEMPO

INTENSIDAD

Hgado

157

+++++

Semilla germinada

620

EFECTO DEL PH (Hgado)

1) Colocamos 5ml de hgado como muestra en cada

tubo de ensayo.

2) Medimos el PH del
hgado con unas tiras
indicadoras.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa23

VI. RESULTADOS
a) Representar los valores de velocidad enzimtica frente a la
cantidad de extracto enzimtico presente en las muestras.

b) Representar los valores de velocidad enzimtica frente a la

temperatura de ensayo. Indicar el valor de temperatura ptima.
Temperatura optima =70

EFECTO DE TEMPERATURA DEL HIGADO

TEMPERATURA

TiRx

INTENSIDAD

30

+++++

++++

+++

+++

10

++

12

19

++

15

28

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa24

c) Explique cmo actan los activadores y los venenos enzimticos

ACTIVADORES ENZIMATICOS
Varias enzimas slo pueden funcionar en presencia de uno o ms iones o de
determinadas molculas llamadas activadores enzimticos. Estas molculas no toman
parte directa en la accin, pero mantienen a la enzima, en un estado cataltico
activo. Entre los iones ms comunes encontramos al potasio (K +), el magnesio (Mg++),
el calcio (Ca++), el cobalto (Co++), el zinc (Zn++) y el aluminio (Al+++). A estas
molculas activadoras se les llama coenzimas y tambin pueden ser protenas.
Las coenzimas son pequeas molculas orgnicas no proteicas que transportan grupos
qumicos entre enzimas. A veces se denominan cosustratos. Estas molculas son
sustratos de las enzimas y no forman parte permanente de la estructura enzimtica.
Esto distingue a las coenzimas de los grupos prostticos, que son componentes no
proteicos que se enlazan estrechamente a las enzimas, tales como los centros hierroazufre, la flavina o los grupos hemo. Tanto coenzimas como grupos prostticos
pertenecen a un grupo ms amplio, los cofactores, que son molculas no proteicas (por lo
general, molculas orgnicas o iones metlicos) que requieren las enzimas para su
actividad.
En el metabolismo, las coenzimas estn involucradas en reacciones de transferencia de
grupos (como la coenzima A y la adenosina trifosfato (ATP)), y las reacciones redox
(como la coenzima Q10 y la nicotinamida adenina di nucletido (NAD+)). Las coenzimas se
consumen y se reciclan continuamente en el metabolismo; un conjunto de enzimas aade
un grupo qumico a la coenzima y otro conjunto de enzimas lo extrae. Por ejemplo, las
enzimas como la ATP sintasa fosforilan continuamente la adenosina difosfato (ADP),
convirtindola en ATP, mientras que enzimas como las quinasas desfosforilan el ATP y lo
convierten

de

nuevoenADP.

Las molculas de coenzima son a menudo vitaminas o se hacen a partir de vitaminas.

Muchas coenzimas contienen el nucletido adenosina como parte de su estructura, como
el ATP, la coenzima A y el NAD+. Esta estructura comn puede reflejarun origen

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa25

evolutivo como parte de los ribozimas en un antiguo mundo de ARN.

VII. DISCUSIONES
Con los resultados de la tabla y los experimentos realizados nos dimos cuenta que la
presencia de la catalasa solo se presenta en los tejidos animales y vegetales. El
motivo de ponerlas en un recipiente con agua a 70 C a 75 C con el afn de
desnaturalizarlas, los resultados fueron positivos.

VIII. CONCLUSIONES

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa26

La muestra animal (hgado) reacciona con mayor intensidad y en la
muestra vegetal la que reacciono con mayor intensidad fue la
semilla germinada pero usamos la zanahoria porque no se contaba
con mucha cantidad de la muestra.
Las muestras presentan mayor intensidad de reaccin a menor
estancia en temperaturas altas ya que se produce la
desnaturalizacin de sus enzimas.
A mayor cantidad de enzimas en una muestra de hgado, esta
reaccionara con mayor intensidad en un menor tiempo.

IX. RECOMENDACIONES
Evitar la desnaturalizacin de las enzimas, cuidando las temperaturas que
no excedan su rango.

X.

CUESTIONARIO

1. Explique los procesos de separacin y purificacin de enzimas.

Microfiltracion, Cromatografa de gel y diafiltracion.
PROCESO DE SEPARACION
MICROFILTRACION
ste procesos est basado en la separacin fsica. Y al igual que el proceso de
nano filtracin y ultrafiltracin, funciona a base de membranas. La porosidad
de la membrana determina el grado de eliminacin de los slidos disueltos en
el agua, as como la turbidez en la misma. Durante de Microfiltracin las
sustancias que presentan un mayor volumen son ms fciles de retener,
mientras que las sustancias ms pequeas son retenidas de manera parcial. En
realidad el grado de filtracin depende de la manera en la que est
construida la capa de rechazo en la membrana.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa27

Las membranas presentan una textura porosa, y pueden ser

utilizadas ms de una vez. El material de algunas
membranas puede ser: cermica, sustratos porosos
metlicos as como fibra de carbono.

Tipos de membrana
smosis inversa
Tamao de

Nanofiltracin

Ultrafiltraci

Microfiltra

cin

<0.002 m

<0.002 m

0.2-0.02 m

4-0.02 m

Componentes de

Componentes de

Macromolcul

Partculas,

alto y bajo peso

alto peso

as, protenas,

bacteria,

molecular. (sales,

molecular.

polisacridos,

barro

glucosa,

(oligosacridos ,

virus

aminocidos)

glucosa,

poro
Rechazo

aminocidos)
Presin de

15-150 bar

5-35 bar

1-10 bar

<2 bar

operacin

Las membranas constituyen una especie de barrera fsica en donde se impide el

paso de ciertos materiales tales como: bacterias, virus y sal. Las membranas de
Microfiltracin tienen la capacidad de retener cualquier bacteria. De igual forma la
contaminacin viral es atrapada durante el proceso, no obstante que los virus tiene
un tamao inferior al poro de las membranas de Microfiltracin.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa28

Aplicaciones

El proceso de Microfiltracin es til para lograr esterilizacin por frio en

bebidas, as como en productos farmacuticos. Frecuentemente se recurre a
la Microfiltracin para aclarar zumos, vinos e incluso cerveza.
De igual manera, se recurre a la Microfiltracin cuando es necesario separar
bacterias del agua.

Dentro de la industria farmacutica frecuentemente se recurre a ste

proceso. Ya que a lo largo del tiempo se ha logrado confirmar que el proceso
de Microfiltracin es verdaderamente eficaz cuando se busca separar
catalizadores, enzimas y levaduras, as como para la clarificacin y
extraccin de los lquidos.
Dentro de la industria alimentaria se recurre a la Microfiltracin para lograr
eliminar agentes patgenos presentes en alimentos. Durante el proceso de

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa29

Microfiltracin en huevo y leche, es posible hacer una correccin de las
deficiencias que se presentan durante el proceso de pasterizacin. Es a
travs de la tecnologa llamada CMF Separacin por Membrana de Micro
filtracin de flujo cruzado.

Ambos procesos (pasteurizacin y CMF) resultan eficientes cuando se

combinan, ya que se logra una eliminacin de patgenos superior a la que se
pudiera lograr si se recurriera a la pasterizacin por s sola. Sin duda; la
Microfiltracin es un proceso que permite un grado de efectividad 100%
til, siempre que se persigue una eliminacin de patgenos exhaustiva.
PURIFICACIN DE ENZIMAS
CROMATOGRAFA FILTRACIN EN GEL O DE EXCLUSIN
MOLECULAR.
ste tipo de separacin se basa en el tamao molecular. La fase estacionaria
est formada por bolas porosas rodeadas de una fase solvente mvil. Cuando
se aade la muestra, las molculas de la mezcla se reparten entre los poros
del gel del solvente. Las molculas de tamao, incapaces de atravesar los
poros, pasan a travs de los espacios intersticiales y eluyen en primer lugar.

Las molculas ms pequeas que pueden pasar a travs de los poros, se

eluyen posteriormente, en orden decreciente de tamao.
La fase estacionaria est constituida por partculas de polmeros de
diferente porosidad. La separacin se basa en el tamao de las partculas.
Las protenas ms grandes que no pueden penetrar en los poros de las
partculas de la matriz de filtracin son eluidas con ms rapidez que las

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa30

protenas ms pequeas que penetran por los poros de las partculas y siguen
un camino ms tortuoso y ms largo. El tamao de los poros internos depende
de la naturaleza del polmero en cuestin, y permite la entrada a protenas
por debajo de un determinado peso molecular.

DIAFILTRACION
La ultrafiltracin consiste en un proceso de filtracin a travs de una membrana
que por su pequeo tamao de poro, no permite el pasaje de protenas en solucin y,
por lo tanto, las concentra.
Las tcnicas actuales de purificacin emplean la ultrafiltracin como un paso de
concentracin de la enzima. La diafiltracin es un modo operativo de la
ultrafiltracin que permite eliminar las sales de una solucin de protena. Se estudia
la diafiltracin para purificar glucosa oxidasa. Tambin se evala el riesgo de
inactivacin enzimtica debido al esfuerzo de corte del equipo de bombeo inherente
a la ultrafiltracin.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa31

La protena purificada desempea un rol central en los mecanismos de defensa
contra las infecciones del intestino.
2. Explique los mtodos de Determinacin y caracterizacin de las
actividades enzimticas en microorganismos.
Aislamientos bacterianos de tractos digestivos y pupas de A. zugana: Los
aislamientos utilizados en este trabajo fueron obtenidos por Sittenfeld y
colaboradores (2002). Brevemente, se recolectaron larvas de tercer estadio del
lepidptero A. zugana en el ACG, en junio de 1999 (estacin lluviosa). El ACG est
localizado en Santa Rosa, entre el Golfo de Papagayo y la Carretera
Interamericana (104413-110037 N y 853448-855851 W). Los individuos
fueron criados individualmente y alimentados con diferentes plantas hospederas
(Annona purpurea, Cordia alliodora, Inga vera, Quercus oleoides, Paullinia cururu,
Cydista heterophylla, Trigonia rugosa y Calycophyllum candidissimum), para
determinar si el tipo de dieta ejerca alguna influencia sobre la microbiota
intestinal. Las larvas de quinto estadio fueron sacrificadas de uno a tres das antes
de entrar en la fase de pre-pupas. Sus tractos digestivos fueron disectados y
cultivados en diferentes medios, tanto selectivos como de enriquecimiento, en
aerobiosis. Los diferentes morfotipos coloniales obtenidos fueron identificados
mediante pruebas bioqumicas tradicionales (Sittenfeld et al. 2002).
Tambin se procesaron ocho individuos en fase de pupas, en cuyo caso el contenido
total de la pupa se trat de la misma manera que el intestino de las larvas. En total,
se determinaron las actividades enzimticas de 72 aislamientos bacterianos
provenientes de muestras de A. zugana. De ellos, 48 fueron obtenidos a partir de
33 muestras de intestinos, mientras 24 se aislaron del contenido de las pupas
procesadas.
Aislamientos bacterianos de tractos digestivos y pupas de R. lebeau: se
analizaron las actividades enzimticas de una coleccin de 81 aislamientos
provenientes de intestinos de orugas y del material de pupas de R. lebeau (Fontecha
2002). Dicha coleccin proviene de ejemplares recolectados en el ACG durante los
meses de junio a julio de 2001 (estacin lluviosa). Brevemente, se disectaron los
tractos digestivos de un total de 67 individuos de los cinco estadios larvales.
Adems, se proces el contenido de diez pupas. Se efectuaron diluciones del

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa32

material intestinal o del contenido de las pupas en solucin salina isotnica, las
cuales se sembraron en agar Luria-Bertani (LB) y se incubaron a 30 C durante 48 h
en aerobiosis. Los diferentes morfotipos coloniales seleccionados fueron
identificados mediante el sistema semiautomatizado BIOLOGA (Biolog, Inc.,
Hayward, California, EEUU), segn las instrucciones del fabricante. En total, se
analizaron 64 aislamientos provenientes de intestinos de orugas y 17 aislamientos
obtenidos de pupas.
Determinacin de actividades enzimticas: todos los aislamientos bacterianos
previamente identificados fueron sembrados en placas de agar nutritivo e
incubados a 30 C durante 24 h. Se realiz una tincin de Gram a las colonias
aisladas y con ellas se inocularon los medios de cultivo de los diferentes ensayos
enzimticos. Los ensayos fueron adaptados y modificados a partir de protocolos
previamente descritos (Rondon et al. 1999, 2000, S. Amato, com. pers.). Todos los
perodos de incubacin se efectuaron a 30 C. Cada prueba cont con los controles
correspondientes (positivo y negativo).

Actividad proteoltica/caseinoltica: se determin inoculando cada aislamiento

bacteriano en placas de agar Luria-Bertani (LB, Oxoid) suplementado con un
volumen de leche descremada lquida comercial, equivalente a un gramo de leche en
polvo por cada 100 ml de medio de cultivo (aproximadamente 8 ml de leche por cada
100 ml de medio LB). La prueba se consider positiva cuando se observ un halo
claro alrededor de la colonia a las 48 h de incubacin.

Actividad lipoltica: los aislamientos bacterianos se inocularon en caldo nutritivo y

se incubaron por 24 h, luego 20 l de cada cultivo se inocularon en una solucin con
Tween 80 al 0.5 % (Sigma) y rojo neutro 0.1 m/v al 2 % (ICN Biomedicals) disueltos
en buffer de fosfatos 0.067 M, pH 7.0. La prueba se consider positiva si antes de
cinco das la solucin adquiri color rojo.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa33

Actividad proteoltica/gelatinoltica: se evalu inoculando los aislamientos
bacterianos en tubos de gelatina nutritiva (Oxoid) e incubndolos por 96 h. Los
aislamientos activos hidrolizan la gelatina, impidiendo la solidificacin del medio
luego de 15 min a 4 C.Actividad amilsica: se detect inoculando los aislamientos
bacterianos en placas de agar LB suplementados con almidn al 1% (ICN
Biomedicals). Luego de 48 h de incubacin se agreg reactivo de lugol. El ensayo se
consider positivo al observarse un halo claro alrededor o bajo la colonia luego de
agregar el reactivo mencionado.
Construccin de rboles fenotpicos:para agrupar a los aislamientos bacterianos
evaluados de acuerdo con sus actividades enzimticas, se construyeron rboles
fenotpicos empleando el programa Treecon, versin 1.3b y la distancia fue
estimada utilizando el mtodo de Nei y Li (van de Peer y De Wachter 1994). El
rbol se construy por medio de una adaptacin del mtodo de Neighbor-Joining
(Hershkovitz y Leipe 1998), con un anlisis de re-muestreo (bootstrap) de 100
muestras. Para cada aislamiento bacteriano, se asign un valor de 0 1 a cada
prueba enzimtica realizada, segn esta produjese un resultado negativo o positivo,
respectivamente, y la matriz obtenida se proces en el paquete informtico
mencionado, eligiendo la opcin que corresponde al anlisis de patrones de RFLP.

Los rboles construidos se basan en caractersticas fenotpicas, por lo que no

reflejan relaciones filogenticas entre los organismos involucrados. En todos los
casos se utiliz como grupo externo el aislamiento A363 correspondiente a Bacillus
sp., el cual proviene del material de una pupa de A. zugana y posee un patrn
enzimtico nico: solamente presenta actividad xilanoltica.

3. Explique los mtodos de extraccin y ensayo de actividades enzimticas

en vegetales.
Las enzimas proteolticas aisladas de plantas de la familia Bromeliaceae se utilizan
ampliamente en la industria mdica, biotecnolgica y alimenticia. Los estudios
realizados en los ltimos aos sobre la actividad contra metstasis y tumores de las
cisteno-proteasas hacen que se incremente el inters por explorar nuevas fuentes

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa34

naturales de obtencin de fitoproteasas. En el presente trabajo se evalu la
actividad proteoltica de extractos enzimticos obtenidos a partir de diferentes
rganos de plantas de la familia Bromeliaceae. Se colectaron y clasificaron cinco
grupos. Las plantas que se colectaron pertenecen a 3 gneros de la mencionada
familia: 3 grupos son del gnero Tillandsia, 1 es del gnero Guzmania y otro del
gnero Hohenbergia. Los mayores ndices de actividad especfica (3,3 U/mg de
protenas) se obtuvieron en los preparados obtenidos a partir de diferentes
rganos de Hohenbergia penduliflora Mez, de cuyos extractos obtenidos se evalu
la influencia del pH de extraccin y la actividad especfica fue superior al realizarla
a pH 3 a partir de sus tallos.

MTODOS
Colecta y clasificacin del material vegetal
Se colectaron cinco grupos de plantas de la familia Bromeliaceae en zonas aledaas
al poblado Modesto Reyes, Ciego de vila, Cuba. De cada grupo, se seleccion un
ejemplar adulto con flores y frutos en los casos posibles para su herborizacin. La
clasificacin del material vegetal se realiz en el herbario Julin Acua del Centro
de Estudios de Medio Ambiente y Educacin Ambiental (CEMAEA) de Camagey,
Cuba, siguiendo las claves dicotmicas establecidas para esta familia y con los
nmeros de vouchers
Variables evaluadas
Concentracin de protenas: Se cuantific por el mtodo de Bradford15 y se expres
en mg/mL o mg/kg de masa fresca, referidos a una curva patrn de albmina de
suero bovino.
Actividad enzimtica: Se determin por el mtodo de Anson16 y se expres en U/mL
o U/kg de masa fresca. Se emple como sustrato hemoglobina desnaturalizada al
2%, pH 6,8. Una unidad (U) es la cantidad de enzima que cataliza la formacin de 1
mol de tirosina por minutos a 37C y pH 6,8. La actividad especfica se calcul como
el cociente de la actividad enzimtica entre la concentracin de protenas.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa35

Caracterizacin de las preparaciones enzimticas crudas obtenidas de diferentes
rganos de plantas de la familia Bromeliaceae
Las extracciones se realizaron como establece el procedimiento patentado
por Hernndez y otros.4 El material vegetal colectado se lav y cort en pequeos
fragmentos. La molida se realiz en una batidora comercial WARING (2 L). Se
utiliz la solucin de extraccin a pH 3. La proporcin utilizada fue 1:1.5 para los
tallos, 1:4 para hojas y 1:1.5 para frutos (m/v). Al preparado enzimtico se le
determin la concentracin de protenas y la actividad enzimtica.
Influencia del pH de extraccin en la actividad proteoltica de extractos crudos
obtenidos a partir de diferentes rganos de H. penduliflora Mez.
Se repiti el procedimiento de extraccin a pH 3, pH 4 y pH 5, a fin de evaluar la
influencia de este indicador en la conservacin de la actividad funcional de la
enzima. Se procesaron 3 lotes de cada rgano. Se determin la concentracin de
protenas y la actividad enzimtica para cada extracto.
El tratamiento estadstico se realiz con el empleo del utilitario Statistical Package
for Social Sciences (SPSS, versin 8,0 para Windows). Se realizaron pruebas
paramtricas (ANOVA, Tuckey p < 0,05) y no paramtricas (KruskalWallis y Student-Newman-Keuls, p < 0,05). El mejor resultado de cada experimento
se tom de premisa para el siguiente.
Las polifenol oxidasas (PPOs) (EC 1.14.18.1 o EC 1.10.3.2) son enzimas ubicuas en
plantas que catalizan la reaccin dependiente de oxgeno que transforma odifenoles en o-quinonas. Estas quinonas son especies muy reactivas capaces de
modificar covalentemente un amplio abanico de especies nuclefilas del interior de
las clulas que conduce a la formacin de polmeros marrones o negros responsables
de importantes prdidas econmicas en el mercado de frutos y vegetales (Mayer y
Harel, 1979; Lee y Whitaker, 1995). Esta es la razn fundamental por la que el
contenido en fenoles y la actividad polifenol oxidasa se consideran determinantes
en la calidad de frutos y vegetales (Wrolstad y col., 1988; Lee y Whitaker, 1995).
La presencia de PPO se ha podido determinar y caracterizar utilizando hojas y
frutos de numerosas especies vegetales como fuente enzimtica (Mayer y Harel,
1979; Mayer, 1987). Los niveles de PPO varan dependiendo de la especie, cultivar,
estadio de maduracin y estadio fenolgico. (Amiot y col., 1995). En tejidos

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa36

vegetales intactos las PPOs y sus sustratos fenlicos permanecen en
compartimentos separados, cloroplastos y vacuolas respectivamente, por lo que no
tiene lugar ninguna reaccin. La desorganizacin de la integridad de las clulas
sucede de forma natural durante procesos de senescencia, pero tambin como
consecuencia de daos mecnicos, que provocan una ruptura celular y una puesta en
contacto de PPO y fenoles dando lugar a reacciones de pardeamiento enzimtico
observadas en frutos maduros, tejidos daados y/o procesados y tambin en
tejidos afectados por fisiopatas.
Los frutos de tomate no son proclives a la aparicin de fenmenos de pardeamiento
como consecuencia de procesos de senescencia o daos mecnicos, sin embargo, si
se han descrito pardeamiento de tejidos afectados por infecciones vricas,
bacterianas y fngicas, as como consecuencia de la aparicin de podredumbre
apical. La purificacin y caracterizacin de PPO es un paso fundamental en la
investigacin de esta enzima en los procesos descritos, particularmente en la
podredumbre apical. Aunque la enzima ha podido ser aislada y caracterizada en
numerosas fuentes vegetales, no existen trabajos similares que utilicen tomate
como fuente de partida. En este sentido, Czapski y Saniewski (1988) determinaron
la presencia de actividad PPO en extractos frutos de tomate y estudiaron la
influencia de la hormona metil jasmonato en los niveles de esta enzima. Por otra
parte, Hobson (1967) midi actividad fenolasa en preparaciones cetnicas de frutos
de tomate y estudi su evolucin durante el crecimiento y maduracin, as como la
variacin de los niveles de actividad en frutos afectados por podredumbre apical.
En contraste con la falta de informacin de la enzima PPO en frutos de tomate,
existe un profundo conocimiento de la expresin espacial y temporal de los genes
que codifican para esta enzima. Thipyapong y col., (1997) demostr que cada una de
las isoformas de PPO presentes en tomate presentan patrones de regulacin
diferentes en tejidos vegetativos y reproductivos durante el crecimiento y
diferenciacin celular en plantas de tomate. Tcnicas de inmunolocalizacin e
hibridacin in situ han mostrado la presencia de protena PPO madura y RNAm en
varios tejidos de frutos jvenes (hasta 7 das post-antesis), en concreto en
clulas.solitarias del parnquima denominadas idioblastos, que son capaces de
acumular niveles elevados de PPO (Thipyapong y Steffens, 1997). El estudio del
patrn de expresin temporal de PPO mostr una acumulacin de isoenzimas B y E/F
en vulos de frutos jvenes en desarrollo. El desconocimiento de la funcin de las

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa37

PPOs se puede atribuir a la ausencia de un protocolo de extraccin apropiado para
este tejido, al contrario de lo que ocurre en hojas y tricomas de plantas de tomate
(Newman y col., 1993).
En este captulo se aborda la laguna de conocimiento sobre las PPOs presentes en
frutos de tomate, estableciendo primero un protocolo reproducible de extraccin y
purificacin parcial, probado en diferentes variedades y en diferentes etapas de
desarrollo del fruto. La enzima se ha caracterizado cinticamente y se han
determinado sus niveles en frutos afectados por podredumbre apical en relacin
con frutos sanos. Los resultados apuntan a la existencia de, al menos, dos isoformas
en este rgano.

MTODOS:
Obtencin del material vegetal: Todas las variedades de tomate estudiadas han
sido germinadas a partir de semillas en recipientes adecuados (5cm 5cm 10
centmetros) con turba comercial (Humin substrate N3, H3-H5 y H6-H8), pH 5.56.5. Cuando las plntulas alcanzan una altura de veinte centmetros
aproximadamente, se trasplantan a recipientes con doble fondo y soporte de grava
de slice inerte (figura 2.1). Hemos utilizado la disolucin nutritiva propuesta por
Kaya y Higgs (2001) optimizada para tomate. En este trabajo hemos obtenido
resultados de extracciones enzimticas y medidas de actividad realizadas en ms de
sesenta variedades de tomate obtenidas de Dr. Charles Wyatt (Rosedale,
PURIFICACION Y CARACTERIZACION CINETICA DE POLIFENOL OXIDASA DE
TOMATE Juan Casado Vela Maryland, EEUU). Adems, tambin incluimos datos
obtenidos del procesamiento de seis variedades de tomate de importancia local en
la provincia de Alicante (Muchamiel, P12, P14, P8, Valentn, Richel y Conchita).
Condensacin del Triton X-114: El detergente Triton X-114 debe ser
acondicionado (condensado) utilizando tres lavados en el tampn apropiado
siguiendo el mtodo Bordier (1981). Para la extraccin de polifenol oxidasa hemos
utilizando tampn de extraccin. La condensacin del reactivo original consiste en
disolver 10 gramos de detergente y ocho miligramos de butil-hidroxitolueno en
tampn de extraccin a 4C hasta completa disolucin. A continuacin, la disolucin
de aspecto blanquecino se incuba a 37C durante 15 minutos.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa38

Este incremento en la temperatura hace que el tamao de las micelas formadas por
el Triton X-114 aumente, agregndose unas con otras hasta alcanzar un tamao tal
que ya no pueden mantenerse en disolucin, provocando la turbidez de la misma. La
temperatura a la que se produce este fenmeno se denomina punto de nube (cloud
point) y su valor depende del nmero de grupos polioxietileno del detergente noinico (generalmente abreviado como n). La ventaja de la utilizacin del Triton X114 frente a otros detergentes no inicos de la misma familia es que la temperatura
a la que se alcanza el punto de nube es sensiblemente inferior, siendo de 64C para
el Triton X-100 (n = 9-10) y de 23C para el Triton X-114 (n = 7-8). A continuacin
se introduce en un embudo de decantacin y se deja reposar durante ocho horas a
temperatura ambiente (20C aproximadamente).
Transcurrido dicho tiempo aparecen dos fases transparentes completamente
separadas; una mayoritaria en la parte superior, pobre en detergente y una
minoritaria, en la parte inferior, rica en detergente. La fase acuosa pobre en
detergente se desechada y se reemplaza por un volumen igual de tampn de
extraccin. Esta mezcla es sometida a condensacin y separacin de fases una
segunda vez, bajo las mismas condiciones. La fase rica en detergente se somete a
condensacin y separacin de fases por tercera vez, pero sin la adicin de
butilhidroxitolueno. La fase rica en detergente resultante de la tercera
condensacin tiene una riqueza aproximada del 24% (p/v) de Triton X-114. El
detergente obtenido de esta forma se utiliza como reactivo para todos los
experimentos descritos en este trabajo. PURIFICACIN Y CARACTERIZACION
CINETICA DE POLIFENOL OXIDASA DE TOMATE Juan Casado Vela
Mtodo de extraccin y purificacin de la enzima PPO: Frutos de tomate verdes
(aproximadamente 10 das de desarrollo post-antesis) obtenidos mediante cultivo
hidropnico son lavados en una solucin con detergente MA03 sin fosfatos -Merck2% v/v y secados a mano. Se homogenizan 100 gramos (peso fresco) de fruto de
tomate con 100 ml de tampn de extraccin durante 2 minutos utilizando una
batidora. El homogenizado se filtra a travs de ocho capas de gasa.
Al resultado de esta filtracin lo denominamos extracto crudo (EC). A
continuacin, se centrifuga a 20000 g durante 30 minutos y 4C. El sobrenadante
de esta centrifugacin contiene actividad polifenol oxidasa. El sobrenadante se
somete a precipitacin con sulfato de amonio en el rango 20-80% (p/v). El

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa39

precipitado con sulfato de amonio se re suspende en 5 ml de tampn de
conservacin y lo hemos denominado extracto enzimtico nmero uno (E1) . Por
otra parte, el precipitado de color verde obtenido en la centrifugacin a 20000 g
se resuspende en 40 ml de tampn fosfato 10mM, pH 7.0 y 1.5% (v/v) de Triton X114 y sometido a centrifugacin a 5000 g a temperatura ambiente tras incubar
10 minutos a 37C. El sobrenadante se somete a centrifugacin a 60000 g
durante 15 minutos. El sobrenadante de la centrifugacin anterior se recupera y se
suplementa con Triton X-114 hasta alcanzar una concentracin final del 4% (v/v) y
glicerol 10% (v/v). Tras mezclar en fro, se incuba a 37C y posteriormente se
centrifuga a 5000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para favorecer
la separacin de fases por efecto de la precipitacin del detergente. El
sobrenadante resultante se denomina extracto enzimtico nmero dos (E2). Ambas
preparaciones E1 y E2 contienen actividad polifenol oxidasa y se pueden almacenar
de forma estable a -20C durante un tiempo aproximado de dos meses sin prdida
apreciable de actividad.
Ensayo de actividad de PPO: El medio de reaccin contiene 200l del extracto
enzimtico (E1 o E2), 0.5 ml de tert-butil catecol (TBC) 30 mM y 2.5 ml de tampn
fosfato 50mM, pH 7.0. Todos los reactivos han sido termostatizada a 25C
previamente a su utilizacin. Estas han sido las condiciones de medida utilizadas
para todos los experimentos, exceptuando aquellos que requieren una variacin de
alguna de las variables (obtencin de perfiles de pH, temperatura ptima y termo
estabilidad). La determinacin de la actividad polifenol oxidasa se lleva a cabo
mediante el seguimiento espectrofotomtrico de la acumulacin del producto oquinona, que presenta una banda de absorcin aproximadamente a 400 nanmetros,
donde presenta un coeficiente de extincin molar () de 1300 M-1 cm-1.
Generalmente se ha utilizado como sustrato el tert-butil catecol (TBC) por la
estabilidad de su o-quinona correspondiente, excepto que expresamente se
especifique lo contrario. Una unidad enzimtica se define como la cantidad de
enzima PPO que produce 1 mol de o-quinona por minuto a la temperatura de
referencia (25C). Todas las medidas espectrofotomtricas fueron monitorizadas
con espectrofotmetro termostatizada JASCO V-530.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa40

Proceso de obtencin de plntulas obtenidas a partir de semillas de tomate de la

variedad Muchamiel. Desarrollo de plantas mediante cultivo hidropnico

EXTRACCIN Y PURIFICACIN ENZIMTICA:

Las reacciones de oxidacin que provocan el pardeamiento de frutos y vegetales son
esencialmente de origen enzimtico y estn catalizadas principalmente por la
enzima polifenol oxidasa (PPO), siendo su actividad particularmente alta en aquellos
frutos y vegetales que contienen altos niveles de compuestos polifenolicos (Amiot y
col., 1992). En el procesamiento de alimentos suele ser una actividad enzimtica
perniciosa, pues en presencia de oxgeno cataliza la oxidacin de los compuestos
fenolicos naturales a sus correspondientes quinonas, y stas evolucionan de forma

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa41

espontanea hacia diferentes pigmentos que producen el pardeamiento de los frutos,
provocando un aspecto desagradable frente al consumidor y considerables prdidas
econmicas. Esta es la razn fundamental por la que el contenido de fenoles y
polifenol oxidasa se consideran determinantes para determinar la calidad de frutos
y vegetales (Lee y Whitaker, 1995). La purificacin y caracterizacin de PPO de
diferentes fuentes vegetales es un paso fundamental para investigar la
participacin y mecanismo de actuacin de esta enzima en estos procesos. Aunque
existen trabajos que describen el aislamiento y caracterizacin de PPO de
diferentes vegetales, no hemos podido encontrar bibliografa que describa dicho
proceso utilizando frutos de tomate como fuente de enzima. Nos hemos apoyado en
los datos obtenidos por Czapski y Saniewski (1988) en los que se determina la
influencia de metil-jasmonato en la actividad PPO en extractos crudos de frutos de
tomate y el trabajo de Hobson (1967), que determin actividad fenolasa y su
relacin con la podredumbre apical a partir de preparaciones de protenas de frutos
de tomate con acetona.

La extraccin y purificacin de PPO de tejidos de plantas continua siendo un

problema debido a la confluencia de fenmenos de pardeamiento durante la
extraccin y formacin de quinonas que pueden interactuar e inhibir a la propia
enzima, a la localizacin de la PPO en las membranas tilacoidales y la existencia de
formas inactivas de PPO que dificultan la medida de su actividad por los mtodos
espectrofotomtricos o por mtodos basados en la medida del consumo de oxgeno
que se produce en las reacciones de oxidacin que catalizan. La carencia de
resultados de la protena PPO funcional en frutos de tomate se debe, en gran
medida, a la ausencia de protocolos adecuados para su extraccin a partir de este
tejido. Los protocolos de extraccin preparativa y estudios enzimticos de PPO
existentes para plantas de tomate utilizan hojas y tricomas como fuente de esta
enzima (Yu y col., 1992). En este trabajo de investigacin nosotros desarrollamos un
protocolo de extraccin enzimtica (que nos ha permitido medir actividad PPO en
diferentes fracciones una soluble, que denominaremos E1 y otra particular que se
representar como E2, de diferentes variedades de tomate.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa42

4. Defina: Residuos Catalticos, mutasas, Inmunoadsorbentes, constante de
disociacin, actividad molecular.

Especificidad de los enzimas.

Los enzimas son protenas catalticas. Casi todas las reacciones celulares estn
catalizadas. Alguna actividad cataltica no reside en las protenas sino en el RNA,
es el caso de la ribozima que tiene parte de RNA y parte proteica aunque la
catlisis la efecta el cido nucleico. Esto tiene una importancia evolutiva pues
demuestra que el RNA catalizaba antes que los enzimas que luego se especializaron.
El RNA es peor catalizador. La funcin de los enzimas ests relacionada con la unin
de un ligando que ser el sustrato. Se forma complejo enzima-sustrato, que luego
se convierte en producto:
enzima + sustrato enzima-sustrato enzima + producto
Como es un catalizador el enzima no se consume, acelerando la velocidad de
reaccin sin modificar la posicin de equilibrio. Las propiedades que tienen los
enzimas que los hacen efectivos como catalizadores son:
- Capaces de acelerar las reacciones en las condiciones suaves de la clula.
- Alto poder cataltico por su gran actividad molecular, aceleran las reacciones
hasta 1017 veces. Esto es porque se une al sustrato en relacin 1:1 y la reaccin que
ocurre en los confines de ste ve rebajada su energa de activacin como
consecuencia de esa unin.
- Son muy especficos respecto a:
a) Tipo de reaccin: ya que no son catalizadas reacciones de naturaleza distinta.
b) Respecto al sustrato: el enzima no puede unirse con cualquier sustrato. Hay
enzimas ms especficos que otros. La especificidad puede ser tan alta que se
distinga entre estere ismeros. Sin embargo los enzimas digestivos son poco
especficos porque si no haran falta demasiados. La ventaja de la especificidad

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa43

reside en que se pueden catalizar muchas reacciones a la vez sin reacciones
laterales ni que se acumulen los productos secundarios.
Centro activo.
El sitio de unin del ligando est muy bien definido. En l habr distintos residuos
que aporten los grupos funcionales necesarios para cada funcin:
- Residuos catalticos: son capaces de llevar a cabo la catlisis (Las reacciones
qumicas que ocurren en los sistemas vivientes son tan variadas como complejas)
- Residuos de unin: aportan soporte para unir el enzima a su sustrato y no a otro.
- Residuos que participan en la estructura tridimensional.
La protena al plegarse determina el centro activo que ser una cavidad hidrofbica
(ambiente especial). No habr agua si no participa en la reaccin. Se crea un
microambiente especial para que los grupos catalticos sean ms reactivos. <<la
unin del centro activo y el enzima es la base de la especificidad.

MUTASA: La enzima Mutasa pertenece a la clase Isomerasa.

Enzima que cataliza la transferencia intramolecular de un grupo funcional como el
fosforilo. La transferencia no tiene por qu ser directa sino que puede implicar un
enzima fosforilado intermedio.
Reacciones en las que participa (se indica la ruta metablica):

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa44

Precursor/es

Producto/s

Ciclo

Glucosa 1 - P

Enzima /
Proceso
Mutasa

Glucosa 6 - P

Ruta 19: Ciclo glucgeno,

glucosa y ribosa

3fosfoglicerato

Mutasa

2fosfoglicerato

Ruta 13: Ciclo

fosfogliceraldehdo - glicina

Glucosa 6 - P

En esta reaccin entra ATP.

Mutasa
Glucosa 1 - P

2fosfoglicerato

Mutasa

3
fosfoglicerato

Ruta 19: Ciclo glucgeno,

glucosa y ribosa
Ruta 13: Ciclo
fosfogliceraldehdo glicina

INMUNOADSORBENTES
Preparacin insoluble de antgenos o anticuerpos utilizada para fijar anticuerpos o
antgenos homlogos y retirarlos de una mezcla de sustancias.
Soporte insoluble para un ANTGENOS o ANTICUERPOS que se utiliza
en CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD para adsorber el anticuerpo o antgeno homlogo de
una mezcla. Se usan muchas sustancias diferentes, como la SEFAROSA,
GLUTARALDEHIDO, copolmeros de ANHDRIDOS, poliacrilamidas, etc.
Inmmunoensayo que utiliza un anticuerpo marcado con una enzima marcadora como es
la peroxidasa del rbano picante (horseradish peroxidase). Mientras la enzima o el
anticuerpo estn unidas a un sustrato inmunoadsorbente, ambas retienen su actividad
biolgica; el cambio en la actividad enzimtica como resultado de la reaccin enzimaanticuerpo-antgeno es proporcional a la concentracin del antgeno y puede ser medida
espectrofotomtrica o visualmente. Se han desarrollado muchas variantes del mtodo.

LA CONSTANTE DE DISOCIACIN o Kd es definida en termodinmica qumica como la

relacin matemtica que se establece a partir de las concentraciones de los compuestos
qumicos que se forman en una reaccin de disociacin al alcanzar su punto de equilibrio.
Si un compuesto de frmula AxBy se disocia segn la reaccin
la constante de disociacin Kd se expresa mediante la siguiente relacin de concentraciones
(en moles por litro):

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa45

A menudo, la constante de disociacin tambin se formula por pKd siendo

pKd = -log(Kd).

ACTIVIDAD MOLECULAR: La actividad de una enzima puede expresarse, a

sugerencia de la comisin de enzimas de la unin internacional de bioqumica, como
actividad molecular (nmero de recambio), y como actividad especfica.
La actividad molecular es el nmero de molculas de sustrato transformadas por
minuto por una sola molcula de enzima(o por un solo centro activo), cuando la
enzima es el factor limitante de la velocidad, se basa en la Vmax y tiene unidades
de recproco de tiempo (min.-1).
La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por miligramo de
protena (una unidad enzimtica se define como la cantidad de enzima que origina la
transformacin de un micro mol de sustrato por minuto a 250c en condiciones
ptimas de medida). La actividad especfica constituye una medida de la pureza de
la enzima, aumenta durante el proceso de su purificacin y llega a ser mxima y
constante cuando sta se halla en estado puro. La forma ms usada de expresin de
la actividad especfica es la de micro mol de producto formado por minuto por
miligramo de protena.

5. Aplicacin de la Biotecnologa enzimtica y biocatalisis.

Biocatlisis y Tecnologia Enzimtica: Biotransformaciones

La produccin biotecnolgica de numerosos materiales y productos de uso cotidiano
se realiza a travs de procesos enzimticos, por lo que esta lnea est encaminada a
estudiar las enzimas como biocatalizadores y su aplicacin.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa46

En consecuencia, tambin se estudiaran los sistemas de produccin, mejora y
inmovilizacin de enzimas y de clulas con el objetivo de incrementar la eficacia en
los procesos de produccin en los que se utilizan.
reas de aplicacin:
Los aportes de la biotecnologa para apoyar los procesos productivos de
la industria alimentaria y agroalimentaria se enfocan a dos grandes lneas
prioritarias de investigacin:
1. tecnologa enzimtica y biocatlisis
2. alimentos genticamente modificados

1. tecnologa enzimtica y biocatlisis

El rea de tecnologa enzimtica y biocatlisis incluye el extenso campo de las
fermentaciones en procesamiento de alimentos, as como la mejora gentica de
microorganismos de aplicacin en tecnologa de alimentos y
la produccin de protenas y enzimas de uso alimentario.
Fermentaciones
la fermentacin es la transformacin de una sustancia orgnica (generalmente un
carbohidrato) en otra utilizable, producida mediante un proceso metablico por
microorganismos o por enzimas que provocan reacciones de oxidacin-reduccin, de
las cuales el organismo productor deriva la energa suficiente para su metabolismo.
Las fermentaciones pueden ser anaerbicas, si se producen fuera del contacto con
el aire, o aerbicas, que slo tienen lugar en presencia de oxgeno.
las fermentaciones ms comunes en la industria de alimentos son la del azcar, con
formacin de alcohol etlico, en la elaboracin de vino, cerveza, sidra; la del alcohol,
con formacin de cido actico, en la elaboracin del vinagre; y la fermentacin
lctica, en la elaboracin de quesos y yogures.
Actualmente en la industria fermentativa se utilizan tanques de fermentacin en
los que sta se realiza en condiciones controladas de temperatura y presin y que
permiten regular constantemente la entrada y salida de productos.
Los diversos tipos de fermentaciones en la industria de alimentos se pueden
clasificar de la siguiente manera:
- fermentaciones no alcohlicas

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa47

Panadera (fermentacin por levaduras de panadera)
vegetales fermentados (encurtidos en general)
ensilado (fermentacin de forraje)
- fermentaciones alcohlicas
vino (fermentacin alcohlica y malolctica)
cerveza
sidra
destilados
vinagre (transformacin de alcohol en cido actico por fermentacin con
acetobacter)
- fermentaciones crnicas
embutidos crudos curados (salame, chorizo espaol, etc.)
Jamn serrano (producto curado)
productos de pescado fermentado (fermentacin en filetes de pescado ahumado)
- fermentaciones lcticas
Leches fermentadas en general
yogur (fermentacin de leche con microorganismos acidificantes, como
lactobacillus)
quesos (fermentacin con determinados cultivos bacterianos inoculados)
bebidas lcticas alcohlicas (kefir)
- fermentaciones locales especiales
Salsa de soya
otros productos
Otras aplicaciones en tecnologa enzimtica y biocatlisis
- mejora gentica de microorganismos obtencin de cepas recombinantes de
microorganismos de utilidad en tecnologa de alimentos, mediante tcnicas
de ingeniera gentica. Se obtienen as microorganismos como levaduras industriales
que poseen una mayor adaptacin y eficacia en los procesos fermentativos,
o bacterias capaces de producir determinadas enzimas de utilidad en
procesamiento de alimentos.
- produccin de protenas y enzimas de uso alimentario produccin de enzimas con
una actividad enzimtica dada, a partir de clulas microbianas. Esta actividad se
vale de varias disciplinas, como la microbiologa, la ingeniera gentica, ingeniera de
protenas e ingeniera bioqumica. Se obtienen as enzimas que transforman el
azcar en polmeros, enzimas que hidrolizan la lactosa de la leche para hacerla ms
digerible, enzimas que se utilizan en enologa, etc.
- diseo de procesos enzimticos con los catalizadores disponibles o desarrollados,
enzimas o clulas, libres o inmovilizadas, se pueden llevar a cabo procesos
enzimticos o fermentativos en reactores de diversas caractersticas, las que se

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa48

determinarn para cada proceso especfico. as, se ha desarrollado, por ejemplo,
una lnea de procesos de extraccin enzimtica de principios activos vegetales para
la transformacin de materias primas. tal es el caso de un proceso biolgico para la
extraccin de aceite de coco, sin usar solventes ni extractores mecnicos.

Lneas de investigacin en tecnologa enzimtica y biocatlisis en la actualidad se

estn llevando a cabo diversos avances en los campos de investigacin referentes a
tecnologa enzimtica y biocatlisis, en particular el estudio del metabolismo y
mejoramiento gentico de levaduras industriales, as como la expresin de enzimas
especficas mediante cepas microbianas recombinantes.
Algunas de las lneas de investigacin en desarrollo actual son las que se describen a
continuacin:
- bacterias lcticas
Utilizacin de tcnicas y desarrollo de mtodos para la deteccin e identificacin
de bacterias lcticas, utilizadas como cultivos iniciadores de fermentaciones
alimentarias.
Estudios sobre el metabolismo de bacterias lcticas, incluyendo metabolismo de
azcares, regulacin de la gluclisis e incidencia en la produccin de voltiles y
la calidad de productos lcteos.
- biologa molecular de levaduras industriales
Estudio de mecanismos moleculares implicados en la fisiologa de levaduras
industriales durante los procesos fermentativos que llevan a cabo.
Estudio de los mecanismos moleculares de la respuesta a estrs osmtico en
levaduras industriales.
Modificacin gentica de cepas de levaduras industriales para conseguir una mayor
adaptacin y eficacia en los procesos fermentativos.
- enzimas y levaduras vnicas
Utilizacin de tcnicas de seleccin e identificacin de levaduras vnicas.
Estudios de la fisiologa de levaduras vnicas durante los procesos de
fermentacin.
Modificacin gentica de levaduras vnicas.
Estudios sobre la aplicacin de enzimas en enologa.
Produccin de enzimas de inters enolgico.
- estructura y funcin de enzimas
Estudios de la relacin entre estructura y funcin de protenas.
Produccin heterloga de enzimas por cepas microbianas.
- levaduras de panadera
Aislamiento y caracterizacin de microorganismos con aplicacin potencial en la
industria de panadera.

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa49

Estudios sobre el metabolismo de levaduras de panadera.
Expresin heterloga de genes que codifican enzimas de inters en los procesos
de panificacin.
- taxonoma molecular

2. Alimentos genticamente modificados

Qu son los alimentos genticamente modificados
La demanda de alimento global ha aumentado la necesidad de cultivos mejorados. La
biotecnologa ofrece la tecnologa necesaria para producir alimentos ms nutritivos
y de mejor sabor, rendimientos ms altos de cosecha y plantas que se protegen
naturalmente contra enfermedades, insectos y condiciones adversas.
La tecnologa de alimentos genticamente modificados (tambin llamados alimentos
transgnicos) permite efectuar la seleccin de un rasgo gentico especfico de un
organismo e introducir ese rasgo en el cdigo gentico del organismo fuente del
alimento, por medio de tcnicas de ingeniera gentica. Esto ha hecho posible que se
desarrollen cultivos para alimentacin con rasgos ventajosos especficos u otros sin
rasgos indeseables.
en lugar de pasar 10 o 12 aos desarrollando plantas a travs de mtodos de
hibridacin tradicional, mezclando millares de genes para mejorar un cultivo
determinado, la biotecnologa actual permite la transferencia de solamente uno o
pocos genes deseables, obteniendo cultivos con las caractersticas deseadas en
tiempos muy cortos.
Principales aplicaciones en alimentos genticamente modificados
Las ventajas ofrecidas por la biotecnologa de modificacin gentica se aplican
fundamentalmente en el mejoramiento de cultivos agrcolas.
Las principales aplicaciones se ven en cultivos con las siguientes caractersticas:
resistencia a enfermedades y plagas
resistencia a sequas y temperaturas extremas
aumentos en la fijacin de nitrgeno (permitiendo reducir el uso de fertilizantes)
resistencia a suelos cidos y/o salinos
resistencia a herbicidas (permitiendo eliminar malezas sin afectar el cultivo)
mejoramientos en la calidad nutricional
modificaciones para obtener cosechas ms tempranas

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa50

mejor manejo de pos cosecha.
Otras caractersticas de valor agregado.

XI. BIBLIOGRAFIA

http://es.scribd.com/doc/36563917/Purificacion-y-Extraccion-de-Proteinas
http://noticias.universia.com.ar/enportada/noticia/2009/12/04/359177/patentan-metodo-purificar-proteinasleche.html
http://www.med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/enzimas.pdf
http://highered.mcgraw
hill.com/sites/dl/free/8448605241/123780/CapituloMuestra.pdf
https://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r60942.PDF
http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/enzima-catalasa
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/
schmidth02/parte08/02.html

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa51

Efecto del pH y temperatura sobre la actividad de la catalasa52