PRUEBA DE LA REDUCTASA

PRUEBA DE LA REDUCCION DEL AZUL DE METILENO

(TRAM)

I. INTRODUCCION
La complejidad bioqumica de la leche en su composicin y su
elevada actividad de agua la convierte en una de los alimentos
naturales

donde

proliferan

fcilmente la

mayor

parte

de

los

microorganismos y bien se podra catalogar como un medio universal

de cultivo.
Los microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos
son beneficiosos por las transformaciones que producen y otros
perjudiciales y su control presenta aspectos sanitarios y comerciales,
el primero se refiere al riesgo que el alimento puede suponer para la
salud del consumidor cuando es portador de microorganismos
patgenos o de sus toxinas y el segundo a las caractersticas de
conservacin de la misma que viene determinada por la presencia de
un mayor o menor nmero de flora saprofitita, est en elevadas
concentraciones puede producir defectos y disminucin de las
propiedades nutritivas y organolpticas del producto.
Existen grupos de microorganismos (M.O) que son tomados como
indicadores en la Industria Lctea, pues su presencia permitir
comprobar el cumplimiento de la aplicacin de las buenas prcticas
higinicas.
M.O indicadores:

Bacterias aerbicas Mesfilas

Coliformes totales y fecales

Enterobacterias totales

Enterococos

El desarrollo de mtodos rpidos y/o automatizados en el diagnostico

de la calidad higinico sanitaria de la leche y sus productos constituye

en los ltimos aos una necesidad enfocada en lo fundamental en la

obtencin de la respuesta en el menor tiempo posible para tomar las
medidas correctivas sobre las posibles brechas en la higiene de
algunas de las fases de la cadena productiva antes de que el producto
sea liberado en el mercado.
Estos mtodos rpidos de diagnstico bacteriolgico en leche se han
clasificado atendiendo a diferentes puntos de vistas, no obstante, en
lo fundamental han tomado como base los aspectos siguientes:
Rapidez con que se obtienen las respuestas, la actividad metablica
de los microorganismos, posibilidades de automatizacin y principios
de medicin en que se basan las lecturas.
Teniendo en cuenta la diversidad de estas clasificaciones y para una
mayor inclusin de mtodos rpidos empleados en el diagnstico
microbiolgico de la leche, estn agrupados en tres grupos: mtodos
directos,

indirectos

en

mtodos

para

diagnstico

de

microorganismos especficos.
El mtodo usado en esta prctica es un mtodo indirecto, el mtodo
de reduccin de colorantes (Reductasa), usando azul de metileno.
En el procedimiento se utilizan patrones de azul de metileno o
Resazurina y se observa el proceso de reduccin del colorante (de
azul a blanco para el azul de metileno; de azul apizarrado a rosa o
blanco para la Resazurina). El tiempo necesario para que se produzca
la reduccin del colorante est relacionado con el nmero de
microorganismos de la muestra.
Teniendo en cuenta que los mtodos de reduccin no funcionan
eficazmente en leches refrigeradas, se ha sugerido la sustitucin de
estas por otras tcnicas rpidas.
II. OBJETIVO

Conocer y aplicar el mtodo de TRAM en la leche fresca

Interpretar los resultados

Determinar la calidad de las leches frescas por mtodos

rpidos y sencillos.
Analizar la importancia del control de la calidad de la leche

cruda como materia prima de la Industria lctea.

Determinar la calidad de la leche para comprobar si es apta o
es apta para el consumo humano.

III .MARCO TEORICO

Determinacin de la Calidad Microbiolgica en la Leche
Cruda
1.

Sedimento: el sedimento obtenido por el mtodo de

lactofiltracin mide la calidad sanitaria. La presencia de abundante

partculas de sucio y su tipo (heces, insectos, tierra, restos

de

alimentos), puede indicar el cuidado que se ha tenido durante

el ordeo y almacenamiento de la leche cruda.
2.

Temperatura: la determinacin de la temperatura en la

recepcin muestra el cuidado que se haya podido tener durante el

trasporte y almacenamiento de la leche. Sin embargo una leche
que se encuentre la temperatura ptima de refrigeracin (4-5 C)
no confirma que sea de buena calidad, ya que es posible que
durante las fases que estn desde el sitio de produccin hasta la
industria la misma haya sufrido fluctuaciones de temperaturas que
hayan permitido la multiplicacin microbiana.

3.

Lactofermentacin: esta prueba permite observar las

caractersticas del coagulo obtenido de la fermentacin de una

muestra de leche incubada a temperatura ambiente (35-37 C) por
24 horas. Segn las caractersticas observadas se puede presumir
acerca del tipo de bacterias predominantes, ya que un coagulo
homogneo sin o con pequeas burbujas de gas, indicara predominio
de bacterias lcticas homofermentativas, por el contrario un coagulo
grumoso con abundante gas puede indicar la presencia de bacterias
coliformes.

Gua General para la Clasificacin de la Leche segn su Sabor

Clasificac

Puntaje

Descripcin del sabor especifico

Excelente

40 - 45

Sin criticismo

Buena

38 - 39, Sabor

in

ligeramente

astringente

salado,

carente de frescura, sabor ligero o definido a

cocido, a pienso o sin sabor.

Regular

36
37,5

- Sabor ligeramente a "establo" y oxidado;

definitivamente astringente y salado carente
totalmente de frescura, pronunciado sabor a
cocido o sin sabor.

Pobre

35,5
menos

o Sabor ligero o definido a cido, rancio

sucio;

ligero,

definido

pronunciado

y
a

"establo", amargo, extrao, a ajo/ cebolla, a

malta, metlico; definido o pronunciado a
establo y oxidado; pronunciado astringente, a
pienso y salado.
Insalubre

Sin

Sabor pronunciado cido, rancio y a sucio.

Puntaje
Tomado de Nelson and Trout (1964): p 96. Se estima normal
un Puntaje de 31 - 40.

4.

Acidez Titulable y pH: ya se ha estudiado estas dos

propiedades de

la leche en el tema de fsico qumico. Esta claro

que la fermentacin microbiana modifica estos valores, aumentando

la acidez y reduciendo el pH. Sin embargo hay que tener en cuenta
que

ciertos

coagulacin

microorganismos
dulce

de

la

proteolticos

leche, es

pueden

decir,

sin

causar

acidez

la

o con

alcalinizacin de la leche.
5. Reduccin de Colorantes: estas pruebas se fundamentan en
como por el metabolismo microbiano hace variar el potencial de
xido reduccin de la leche. Para ello se utilizan como indicador el
azul de metileno y la Resazurina, los cuales van variando su
coloracin a medida que se van reduciendo.
PRUEBA DE LA REDUCTASA O REDUCCIN DEL AZUL
DE METILENO
El mtodo de reduccin del azul de metileno es un mtodo
indirecto para calcular el contenido total de bacterias de la leche.
De manera que en lugar de contar las bacterias se establece una
correlacin entre el tiempo que se necesita para reducir el
colorante de Azul de Metileno en la leche a una forma incolora y la
probable poblacin bacteriana de la muestra.
Por lo general, el tiempo que se necesita para la reduccin del
colorante, es inversamente oro al nmero de bacterias presentes
en a leche.
Este mtodo puede adaptarse para el examen de gran nmero de
muestras en un tiempo corto, pero sin embargo, si la poblacin
bacteriana es alta, ste mtodo no nos da informacin de la
probable fuente de contaminacin.
No hay necesidad de que los utensilios de vidrio utilizados para esta
prueba sean estriles, pero su contaminacin puede reducirse al
mnimo

tratndolos

con agua hirviente

o vapor que circule

libremente.

Tal como existe en la ubre, la leche posee un potencial de

oxidacin-reduccin

suficientemente

bajo

para

reducir

inmediatamente el azul de metileno. La incorporacin de oxgeno

durante el ordeo, enfriamiento, trasvase, etc. eleva el potencial
Redox aproximadamente de + 0.06 a 0.01 voltios.
Se cree que en el mecanismo de la reduccin del colorante durante
la prueba, intervengan varios factores relacionadas entre s, pero
lo que si es seguro que el proceso respiratorio de las bacterias,
elimina oxgeno de la leche, provocando un cambio en el potencial
de Oxido-Reduccin, puesto que, por lo general, el oxgeno
mantiene un potencial positivo, y que, a medida que el potencial
va cayendo, el hidrgeno pasa de los elementos constitutivos
de la leche y de los metabolitos a1 azul de metileno, causando su
reduccin.
La prueba del azul de metileno, por su sencillez y la rapidez con
que se obtienen los datos, es fcil, prctica y econmica, sin
embargo, este mtodo tiene sus limitaciones y son las siguientes:
La temperatura de incubacin de 37C (98.6F) no es favorable
para el metabolismo de todas las bacterias contenidas en la leche.
Las distintas bacterias tienen capacidades diferentes en lo que
respecta a rebajar el potencial de Oxido- reduccin de la leche.
Por las siguientes razones:
Las

bacterias

termodricas

permanecen

inactivas

durante

la

prueba, y esta es la objecin ms importante ya que estas bacterias

son las que constituyen el mayor problema para el elaborador.

Las bacterias sicrfilas y termfilas tendrn muy poca o

ninguna actividad durante la prueba.

Los materiales inhibidores de la leche impedirn tambin la

proliferacin de muchas bacterias

y harn

que la prueba

d indicacin de una calidad ms alta que la realmente

existente.
IV. MATERIALES
Muestras

de

leche

sin

conservantes
Tubos de ensayo

Azul de metileno
Alcohol
Agua destilada
Pipetas

V. PARTE EXPERIMENTAL
Prueba de la reduccin del azul de metileno
-

Se pipete 10 mL de leche contenida en un tubo de ensayo

estril y se le agreg 1 mL de la solucin de azul de
metileno.

Agitamos para mezclar bien e incubar a37 C en la estufa

Luego, rotulamos los dos tubos,

Revisar cada 30 min.

Para determinar la calidad de la leche tenemos q tomar en

cuenta lo siguiente

> 8 horas
< 8 horas
< 6 horas

Leche excelente: No se decolora en ocho

horas.
Contiene
menos
de
20000
microorganismos/ml.
Leche buena: Se decolora en menos de ocho
horas, pero no en menos de 6 horas. Contiene
menos de 10000 microorganismos/ml.
Leche regular: Se decolora en menos de seis
horas pero no en menos de dos horas.
Contiene unos 3000.000 microorganismos/ml.
Leche mala: Se decolora en menos de dos
horas,
contiene
ms
de
3000.000
microorganismos/ml. Si el color desaparece en
pocos minutos, la leche contiene unos
100.000.000 microorganismos/ml.

< de 20000

Excelente

microorganismos/ml
< de 10000

(A)
Buena (B)

microorganismos/ml
3000.000

Regular (C)

microorganismos/ml.
>de3000.000
microorganismos/ml Si

< 2 horas.

desaparece el color contiene

Mala (D)

100.000.000
microorganismos/ml.

Importante

1. El colorante azul de metileno el cual es un indicador de

oxido-reduccin, es azul cuando est oxidado e incoloro
cuando est reducido.
2.

Varias especies
pueden contaminar

de bacterias,

no todas las que

la leche, tienen la capacidad de

secuestrar el oxgeno presente en el medio y por lo

tanto generar la reduccin del azul de metileno con la
consecuente prdida del tono azul.
3. Bsicamente la velocidad con la cual se reduce el azul

de metileno depende del nmero de microorganismos

que tienen el efecto reductor, es decir que a mayor
nmero de bacterias con esa propiedad, menor ser
el tiempo necesario para que se produzca el cambio de
color en el tubo. Esto es lo que comnmente se describe
en bacteriologa como un recuento metablico indirecto.
Internacionalmente la tabla de interpretacin del
TRAM se relaciona con las siguientes recuentos de
bacterias /mL.

TRAM (minutos)

No Bacterias
/mL.

< 30 minutos

20 - 30
millones

30 min - 2 horas

4 - 20
millones

2 - 6 horas

0,5 - 4
millones

> 6 horas

< 500.000

Como se puede ver en la tabla las variaciones pueden ser de

nmero de bacterias para determinado rango de variacin es muy
variable, razn por la cual la prueba a nivel mundial ha perdido
aplicacin como elemento para medir el nmero de bacterias.
A lo anterior se suma el hecho de que un gran nmero de bacterias
que hacen parte de la contaminacin

de la leche durante

el

ordeo tienen poca actividad reductora del azul de metileno y

los nmeros de bacterias para un determinado TRAM se ven
incrementado en forma muy significativa, en aquellos ordeos
donde las practicas de higiene son deficientes.
Trabajos

realizados

para

comprobar

la

tabla

internacional

de

TRAM

dado

resultados

muy

diferentes en los pases de Latinoamrica como se

muestra en la siguiente tabla:
TRAM (minutos)
aerobios (UFC)
< 30 min

recto mesfilos
>

600

millones
30 min - 1 hora

100

600

25

100

millones
1 - 2 horas
millones
2 - 3 horas

10

25

10

millones
3 - 4 horas
millones
4 - 5 horas

millones
5 - 6 horas
millones
6 - 7 horas

1.5

millones
7 - 8 horas

1.5

millones
Como se puede observar mientras que en la tabla internacional, 6
horas de TRAM significan menos de 500.000, en nuestro medio ese
mismo tiempo corresponde aproximadamente a 2 millones de
bacterias. Estas grandes diferencias se originan en la diversidad de
fuentes de contaminacin a que se ve sometida la leche cuando
fallan las prcticas de higiene y se facilita la contaminacin con
microorganismos provenientes del intestino de los animales, que en
general tienen muy poca actividad reductora, comparativamente

con bacterias de los gneros Streptococcus y Lactobacillus que son

habitantes normales de la glndula mamaria y que a travs de ella
pueden llegar a la leche.
Basados

en

la

actividad

metablica

de

los

diferentes

microorganismos que pueden contaminar la leche, la prueba TRAM

puede castigar leches que tienen poca contaminacin ambiental
pero con presencia de bacterias con gran capacidad reductora,
como las mencionadas, y de otra parte favorecer a leches con
alto nmero de bacterias contaminantes ambientales producto de
ordeos antihiginicos pero que demoran mucho en reducir el azul
de metileno.
Otra razn para tener largo tiempo de TRAM frente a un alto nmero
de bacterias es, que la leche examinada contenga sustancias que
inhiban

el

crecimiento

bacteriano,

por

ejemplo,

preservantes

qumicos o antibiticos, compuestos que cuando se est haciendo

el Recuento en Placa, por el factor de dilucin a que se somete la
muestra, pierden actividad o capacidad inhibitoria.
El hecho de tener cortos tiempos de TRAM y Recuentos bajos de
bacterias,

es

posible

cuando

varias

clulas

bacterianas

se

encuentran agrupadas y una Colonia (UFC) es el resultado de uno

de estos grupos o de una sola clula. Por esto en los recuentos de
Bacterias Mesfilas se usa el trmino Unidades Formadoras de
Colonia (UFC). En la Prueba de TRAM el
hecho

de

que

las

bacterias

estn

agrupadas o separadas no influye porque

independientemente cada clula cumple
su accin metablica.

VI RESULTADOS
LECHE DE VACA..TRAIDA DE HUNTER

Hora 2:30
PM

Hora 3:30 PM

H
ra 3:00 PM

Hora

4:00 PM

Hora 4:30 PM

Hora 5:00 PM

LECHE UHT
En la muestra pasteurizada (UHT) NO CAMBIA de color
porque se ha eliminado toda la flora microbiana.

Hora 2:00 PM No hay cambios

Hora 2:30 PM.. No hay

cambios

Hora 3:00 PM..

Presenta un precipitado azul

Hora 3:30 PM ..Presenta un precipitado azul

 Hora 4:00 PM ..Presenta un precipitado azul

Hora 4:30 PM ..Presenta un precipitado azul

Hora 5:00 PM ..Presenta un precipitado azul

 Debido al tiempo transcurrido en el cambio de viraje

podemos decir que nuestra muestra tenia un rango entre
3000.000 a 100.000.000 microorganismos /mL, lo cual la
leche lo clasificamos como NO APTA para el consumo.
A ms tiempo que demore en virar el color de la reaccin
con el azul de metileno; quiere decir que esa leche ESTA
en mejores condiciones de consumo.

DEBI DE COMER
MS

Tengo buena leche

VII. DISCUSIONES
tenerse en cuenta es que las clasificaciones dadas no
siempre son apropiadas ya que existen otros factores que
pueden afectar al tiempo de reduccin, entre ellos, el tipo
de microorganismos, el numero de leucocitos, el tiempo de
exposicin a la luz, la cantidad de oxigeno disuelto y la
tendencia de la leche a elevar los microorganismos hacia la
superficie a medida que se va separando la crema del tubo
de

prueba.

As

es

como

ciertos

microorganismos

( lactococcus lactis) son ms activos en su capacidad

reductoras que otros, mientras que existen especies que
son

menos

agalactiae,
termodricos)

activas
bacillus

en

ese

sentido

subtilis,

(streptococcus
microorganismos

VIII. CONCLUSIONES
La calidad higinica de la leche ocupa en estos momentos una
gran prioridad, para las industrias lcticas, es por eso los
productores deben de producir su producto con el ms cuidado.
La utilizacin del TRAM, tiempo de reduccin del Azul de
metileno, es un mtodo practico de los tantos existentes y que
nos facilitan para analizar la calidad microbiolgica de nuestra
leche.
Mediante nuestra prctica realizada para lograr una coloracin
cambio de color rpidamente del color azul al blanco, lo cual
esto nos da a conocer que nuestra leche analizada esta dentro
del rango NO PERMITIDO y lo cual NO est

APTO

para el

consumo humano.
Logramos

determinar

una

cantidad

aproximada

de

microorganismos existente en nuestra leche, lo cual nos

permite garantizar que nuestro producto NO est APTO para el
consumo humano.
IX. BIBLIOGRAFIA
http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/materialdeapoyopa
rapruebasdeplataforma_1693.pdf
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf
http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia
%20general/notas_de_microbiologia_de_los_al.htm
http://www.anmat.gov.ar/anmat/drvisapi.dll?
MIval=fna_show_monog&ID=AZUL_DE_METILENO
http://imb.usal.es/Practicas2/P2/Practicas2.pdf
http//:www.senasa.gob.pe/
FRAZIER. W. 1992. Microbiologa de los Alimentos. 4ta edicin.
Editorial Acribia. Zaragoza HARRIGAN, W. 1992. Mtodos de
Laboratorio en Microbiologa de los alimentos y productos.
Lcteos. 3ra Edicin. Editorial Acribia. Zaragoza.

CUESTIONARIO
2. CUALES SON LOS COMPONENTES DEL AGAR PLATE COUNT
La composicin del agar para recuento en placa puede variar,
pero por lo general contiene:
1. 0,5% de peptona
2. 0,25% de extracto de levadura
3. 0,1% de glucosa
4. 1,5% de agar
se ajust el pH a neutral al 25 C .
3. HAGA UNA LISTA DE LOS MICROORGANISMOS MESOFILOS
BENIFICOS

 PATOGENOS