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Tabla de Contenido

DETERMINACION DE HISTAMINA EN SALMON COHO POR


CROMATOGRAFIA HPLC

I. RESUMEN...................................................................................................
II. INTRODUCCIN........................................................................................
III. MARCO TERICO....................................................................................
IV. MATERIALES Y MTODOS......................................................................
4.1. MUESTRA..............................................................................................
4.2. MATERIALES..........................................................................................
4.3. METODOS..............................................................................................
V. RESULTADOS...........................................................................................
VI. DISCUSIN DE RESULTADOS..............................................................
6.1. VALIDACIN LIMITADA DE LA TCNICA HPLC......................................
6.2. CUANTIFICACIN DE HISTAMINA EN SALMN COHO...........................
VI. CONCLUSIN.........................................................................................
VII. BIBLIOGRAFA......................................................................................
VIII. ANEXOS...............................................................................................

[NOMBRE DEL AUTOR]

DETERMINACION DE HISTAMINA EN SALMON COHO POR CROMATOGRAFIA


HPLC
I. RESUMEN
En la presente investigacin se realiz un estudio acerca del
contenido de histamina en el salmn coho (Oncorhynchus kisutch)
como parmetro de control de calidad y salubridad en un ambiente
refrigerado (0C 2C) por un periodo de tiempo de 24 das. Se
evalu el desarrollo de la histamina en carne del pescado por medio
de controles a los 0, 3, 6, 10, 12, 17, 19 y 24 das de
almacenamiento utilizando para ello una mtodo analtico muy
difundido siendo este la cromatografa liquida de alta resolucin
(HPLC) la cual fue validada y aprobada para dicho propsito. Los
niveles de histidina presentes en la carne del salmn coho y otros
productos marinos son regulados por SERNAPESCA en donde de
determino que para un tiempo transcurrido de 24 dias los niveles de histamina
estaban por debajo del lmite mximo permitido, sin embargo, solo el algunos pocos
casos se encontraron niveles altos que hacen inconsumible a este producto.

II. INTRODUCCIN
La industria salmonera es uno de los casos insignes del crecimiento
industrial chileno, debido a que ha logrado una enorme expansin en
apenas una dcada. De registrar exportaciones mnimas en 1980, Chile ha
llegado a ser el segundo pas productor del mundo, despus de Noruega.
Las dos especies de salmones ms cultivados en Chile son: del Atlntico o
Salar y del Pacfico o Plateado, especficamente el Salmn coho (PUC,
2003). Entre los productos ms demandados en el exterior destacan el
salmn fresco refrigerado destinado a Estados Unidos y el salmn
congelado a Japn (Cideiber, 1999).
El msculo del pescado es altamente susceptible a contaminarse durante el
almacenamiento, debido principalmente al crecimiento y actividad de
microorganismos. Generalmente, la frescura del pescado es evaluada por
mtodos sensoriales, los cuales tienen la desventaja de ser inherentemente
subjetivos. Por esta razn es necesario utilizar mtodos qumicos para
evaluar la frescura del pescado, siendo uno de ellos la medicin de los
niveles de aminas voltiles (trimetilamina, dimetilamina) y aminas no
voltiles o aminas biognicas (Baixas-Nogueras y col., 2002).
Las aminas biognicas son un grupo de bases orgnicas de bajo peso
molecular presentes en todos los organismos. Son formadas y degradadas
[NOMBRE DEL AUTOR]

durante el proceso metablico normal de la vida de la clula y por lo tanto


son ubicuas en animales, plantas y microorganismos (Krizek y Peliknov,
1998).
Las principales aminas biognicas son histamina, putrescina, cadaverina,
espermidina, espermina, tiramina, triptamina y fenil etilamina. stas son
constituyentes normales en alimentos fermentados (chucrut, quesos, vinos,
cerveza, etc). En alimentos no fermentados son indicadores de la calidad y
marcan su descomposicin. Usualmente, en este tipo de alimentos, las
aminas biognicas, son producidas por la actividad descarboxilante de
enzimas microbianas sobre aminocidos de estructura aliftica, aromtica o
heterocclica (Krizek y Peliknov, 1998).

[NOMBRE DEL AUTOR]

III. MARCO TERICO


En los EEUU, la histamina tiene diferentes implicancias toxicolgicas,
porque es la responsable del 5 % de todas las enfermedades transmitidas
por alimentos (ETA) y del 37% de las ETA provocadas por productos del mar
(Noltkamper, 2003).
La histamina es la nica amina biognica que tiene un nivel establecido en
la regulacin de productos del mar: para pescado fresco, la Unin Europea
establece que el contenido de histamina no debe sobrepasar en promedio
de 100 mg/kg en pescados pertenecientes a las familias Scombridae y
Scomberesocide y la FDA establece un nivel de 50 mg/kg para pescados
escmbridos y relacionados con escmbridos (Silva y col., 1998; FDA, 2001;
Baixas-Nogueras y col., 2001 y 2002). En Chile, SERNAPESCA, establece
niveles de histamina de 100 mg/kg, aplicable slo a clupeidos, escmbridos
y jurel (SERNAPESCA, 2005).
Las aminas biognicas son producidas por la descarboxilacin de ciertos
aminocidos libres, presentes en el msculo de pescados y crustceos en la
etapa post mortem. La histamina es una diamina que se genera por la
descarboxilacin de la histidina (figura N1) (FDA, 2001).

Figura 1: Descarboxilacin de la
histidina
El proceso de descarboxilacin puede ser producido por dos caminos
bioqumicos: por la enzima descarboxilasa endgena que naturalmente est
presente en el msculo de los pescados y crustceos o por la enzima
exgena liberada por diferentes microorganismos asociados con productos
marinos (FDA, 2001).
La produccin endgena es insignificante cuando es comparada con la
exgena. La naturaleza de la microflora y la composicin del producto
afectan la cantidad de descarboxilasa que una bacteria puede liberar (FDA,
2001).
Muchas bacterias poseen una limitada actividad de la histidina
descarboxilasa, pero slo Proteus morganii, Klebsiella pneumoniae y Hafnia
alvei han sido implicadas como organismos causantes de la formacin de
niveles de histamina toxicolgicamente significativos. Sin embargo, los
intentos para aislar e identificar las bacterias que producen histamina, se
han realizado slo en unas pocas muestras obtenidas de incidentes de
alimentos envenenados. Consecuentemente, an existen las posibilidades,

de identificar otras especies de bacterias, que pueden ser consideradas


como importantes productores de histamina (Behling y Taylor, 1982).
En la industria pesquera, la produccin bacteriana de histamina es
controlada principalmente por el uso de bajas temperaturas de
almacenamiento. La produccin de histamina por bacterias, aparentemente,
reside en las agallas y/o intestinos del pescado y un almacenamiento
prolongado a elevadas temperaturas genera una accin bacteriana sobre el
tejido de la histidina (Behling y Taylor, 1982).
La histamina ejerce sus efectos atacando a los receptores en las
membranas celulares en los sistemas respiratorios, cardiovasculares,
gastrointestinales, hematolgicos e inmunolgicos y en la piel. Los
sntomas, generalmente aparecen poco despus que el alimento es injerido
con una duracin de hasta 24 h. Los cuales pueden ser gastrointestinales
(nuseas, vmitos, diarreas), circulatorios (hipotensin), cutneos (erupcin,
urticaria, edema, inflamacin localizada), y neurolgicos (dolor de cabeza,
palpitaciones, hormigueos, bochornos). Los antihistamnicos se pueden
utilizar con eficacia para tratar los sntomas (FDA, 2001).

IV. MATERIALES Y MTODOS


4.1. MUESTRA
Se cosecharon 40 ejemplares de salmon coho a los que se le cort la
cabeza y se le extrajo las vsceras y agallas, se clasificaron segn peso y
sexo, y se enfriaron a 4C, obtenindose el salmn entero HG refrigerado.
Se colocaron en cajas de plumavit (10 individuos en c/u) y se cubrieron con
bolsas de hielo. Posteriormente, se trasladaron a Santiago, al estado
fresco-refrigerado, dnde se almacenaron en cmara refrigerada (0 - 2C)
de Prinal S.A., durante 24 das.
Se realizaron controles de histamina a los a los 0, 3, 6, 10, 12, 17, 19 y 24
das de almacenamiento. En cada da de control se analizaron 5 individuos,
a los cuales se les identific con letras (A, B, C, D y E). De cada individuo,
se extrajo msculo claro del corte noruego NQC (Einen y Thomassen,
1998), se pes, por duplicado 10 g que se sometieron al proceso de
extraccin.
La cuantificacin de histamina se realiz por la tcnica analticas de HPLC y
se compar con tcnica analitica CZE ya realizada.
4.2. MATERIALES
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
4.2.1. Reactivos
Se utilizaron los siguientes reactivos procedentes de Merck: cido
Tricloroactico (TCA), Bicarbonato de Sodio (NaHCO3), Cloruro de Dansilo,

Acetona HPLC, Metanol HPLC y Acetonitrilo HPLC. De Sigma, se utiliz el


estndar de histamina: Histamine Dihydrochloride.
4.2.2 Preparacin de soluciones
TCA 10%: Pesar 50 g de TCA y llevar a 500 ml con agua Mili-Q.
NaHCO3 0,25 M: Pesar 10,5 g de NaHCO3 y llevar a 500 ml con agua
Mili-Q.
Cloruro de Dansilo 10 mg/ml: Pesar 0,1 g de Cloruro de Dansilo y llevar a
10 ml con acetona grado HPLC. Usualmente se forma un precipitado
insoluble el cual hay que dejar decantar. Guardar refrigerado y protegido
de la luz.
Solucin madre histamina 1000 mg/L: Pesar 0,1656 g del estndar de
histamina y llevar a 100 ml con solucin TCA 10%. Puede ser guardada
refrigerada por un mes.
Solucin estndar histamina 100 mg/L: Tomar 5 ml de solucin madre
histamina 1000 mg/L y llevar a 50 ml con solucin TCA 10%. Puede ser
guardada refrigerada por una semana.
Solucin estndar histamina de concentracin < 100 mg/L: Medir la
alcuota correspondiente de la solucin estndar histamina 100 mg/L y
llevar a 10 ml con solucin TCA 10%. Puede ser guardada refrigerada
por una semana.
Fase mvil: metanol/agua (75/25): En una probeta de 1L medir 750 ml
de metanol, agregar 250 ml de agua Mili-Q medidos en una probeta de
250 ml.
4.2.3. Equipos
Moulinex Somela
Balanza analtica precisa Swiss Quality 1620 D
Homogeneizador: Ultraturrax T 25 Janke & Kunkel
Ika-Labortechnik
Bao de agua termorregulado
Cromatogrfo Waters TM 600 Controller Millipre
o Model Code 6 CE
o Ser N HX4HM9789M
o Style Code
Detector: WatersTM 996 Photodiode Array Detector Millipore
o Model Code 996
o Ser N MX4HMO975M
o Style Code
Columna: Precolumna y Columna BondapakTM C-18
o 3,9 x 150 mm column
o Part. N Wat 086684 Waters

4.3. METODOS
4.3.1. Validacin limitada de los mtodos de cuantificacin

Se realiz una validacin limitada para HPLC, donde se determin:


linealidad, lmite de deteccin, precisin, exactitud e intervalo (Eurachem,
2000), usando la metodologa de Daz y Barrera (2001).
Se estableci un intervalo de trabajo de 5 75 mg/L de histamina, de
acuerdo a los lmites mximos establecidos por la legislacin nacional e
internacional y se consider que el salmn posee un bajo contenido de
histamina ya que no pertenece a la familia de los pescados escmbridos
(Mietz y Karmas, 1978; De la Hoz y col., 2000; Vigel y col., 2000) y en este
estudio se ha mantenido refrigerado (0 2C).
4.3.1.1. Linealidad
Se determina por anlisis de muestras con concentraciones del
analito que comprenden el intervalo demandado por el mtodo. Los
resultados son usados para calcular una regresin lineal contra el analito
calculado por el mtodo de los mnimos cuadrados (Huber, 1994;
Eurachem, 2002).
Se prepar una serie de nueve diluciones del estndar de histamina
en el intervalo de 5 a 75 mg/L. Se determin una curva de calibracin,
preparando e inyectando un duplicado del estndar.
En las figuras N2 se indica la preparacin del estndar utilizada
para el clculo de la linealidad en cada tcnica analtica.
Figura N2: Preparacin del estndar para la determinacin de la linealidad por
HPLC

Se evaluaron los estimadores de regresin en el nivel de confianza p < 0,05


(Quattrocchi y col., 1992).

Coeficiente de regresin lineal (r), se determin para evaluar el ajuste al


modelo lineal propuesto:

La pendiente (b) indica la sensibilidad del mtodo y la ordenada al origen (a)


evala la proporcionalidad de la funcin analtica, es decir, que la recta pase
por el origen y que cualquier desviacin pueda adjudicarse nicamente a un
error aleatorio Quattrocchi y col., 1992).
Como indicador del modelo lineal se calcul un test estadstico t r con
n-2 grados de libertad y se compar con el valor t tabulado para el nivel de
confianza p < 0,05. En este caso la hiptesis nula es la no correlacin entre
x e y. Si tr es mayor que ttabla, se rechaza la hiptesis, siendo la
correlacin lineal significativa con la probabilidad calculada (Quattrocchi y
col., 1992).

Donde: r = coeficiente de regresin lineal y n = nmero de


datos.
Se definen los valores Sxx y Syy como la suma de los cuadrados de las
desviaciones respecto a la media de los valores individuales de x e y. Es
decir: (Skoog y col., 2001).

A partir de Sxx y Syy pueden calcularse los siguientes parmetros:


Desviacin estndar de la regresin (Sr):

Desviacin estndar de la pendiente (Sb):

Desviacin estndar de la ordenada en el origen (S a):

4.3.1.2. Lmite de deteccin


El lmite de deteccin (LD) es la menor concentracin de analito en
la muestra que puede detectarse, pero no necesariamente cuantificarse y
se expresa en unidades de concentracin (%, mg/L, g/L, etc.)
(Quattrocchi y col., 1992; Huber, 1994; Eurachem, 2002).

Tambin se determin el lmite de cuantificacin (LC), el cual es la


menor concentracin de analito que puede determinarse con exactitud y
precisin razonables en las condiciones establecidas y se expresa en
unidades de concentracin (%, mg/L, g/L, etc.) (Quattrocchi y col., 1992;
Huber, 1994; Eurachem, 2002).
El lmite de deteccin y cuantificacin se estim a partir de la curva
de regresin, considerando concentraciones bajas del estndar, por
extrapolacin a concentracin cero: (Quattrocchi y col., 1992).

Se determin la pendiente de la curva de calibracin (concentracin vs


respuesta): b.
Se obtuvo una 2 curva de calibracin, considerando slo las
concentraciones bajas del estndar (5, 10 y 15 mg/L de histamina),
inyectando cada punto por triplicado. Se determin la ecuacin de esta
nueva recta de calibracin y se extrapol la respuesta a concentracin
cero, obtenindose un estimado de la respuesta del blanco: Y bl.
Se determin la desviacin estndar correspondiente a cada
concentracin de la 2 curva de calibracin. Se calcul la recta,
desviacin estndar vs concentracin y se extrapol a concentracin
cero, obtenindose el estimado S bl, correspondiente a la desviacin
estndar del blanco.
Se calcul el lmite de deteccin (3 desviaciones estndar del blanco) y el
lmite de cuantificacin (10 desviaciones estndar del blanco) para n
medidas individuales: (Quattrocchi y col., 1992).
4.3.1.3. Precisin
Corresponde a la proximidad de concordancia entre resultados de pruebas
mutuamente independientes y usualmente es expresada en trminos de
desviacin estndar (Eurachem, 2002).
La desviacin estndar medida puede dividirse en dos categoras,
repetitividad y reproducibilidad. La repetitividad se obtiene si el anlisis se
lleva a cabo en un laboratorio por un operador, utilizando un solo equipo en
un relativamente corto perodo de tiempo. La reproducibilidad se define
como la variabilidad a lo largo del proceso de medida, que puede
determinarse para un mtodo ejecutado dentro de un nico laboratorio,
pero en das diferentes (Huber, 1994).
La precisin se expresa como la desviacin estndar (s) o desviacin
estndar relativa (RSD) (Quattrocchi y col., 1992).

Donde n es el nmero de medidas, Xi es el valor medido en el ensayo i y X


el estimador de la media poblacional, calculado como: (Quattrocchi y col.,
1992)

La desviacin estndar relativa (RSD) se calcula como: (Quattrocchi y col.,


1992)

La precisin se determin realizando un estudio interda, que permite


evaluar la reproducibilidad y de un estudio intrada, que permite evaluar la
repetitividad.
Dentro del intervalo dado por la curva de calibracin, se
seleccionaron tres concentraciones del estndar de histamina (20 - 30 - 50
mg/L) para calcular ambas
expresiones de la precisin:
Estudio interda: Se realiz en un perodo de seis das seguidos. Cada da,
se prepararon los estndares y se calcul su dispersin obtenida de las
inyecciones realizadas diariamente.
Estudio intrada: Dentro de un da, se prepararon los estndares y se
calcul su dispersin obtenida de seis inyecciones.
Los lmites de aceptacin para ambas expresiones de la precisin
fueron obtenidos segn la frmula emprica de Horwitz, donde la desviacin
relativa es:

Donde C es la concentracin del analito expresada en potencias de 10


(Quattrocchi y col., 1992).
4.3.1.4. Exactitud
La exactitud de un mtodo analtico corresponde a la diferencia
entre el valor obtenido (media) y el valor verdadero. Se establece por
anlisis de un material de referencia apropiado. Cuando no se dispone del
material de referencia, una estimacin de la exactitud puede ser obtenida
mediante ensayos de recuperacin del estndar qumico en una matriz
negativa (Quattrocchi y col., 1992; Huber, 1994; Eurachem, 2002).
Se determin realizando una medicin de la recuperacin de la
extraccin, expresada por:

Donde
col., 1992)

es el valor medio y

^
X

el valor verdadero (Quattrocchi y

La exactitud, se expres como el porcentaje obtenido entre el valor


medio versus el valor verdadero. Se evalu en tres niveles de concentracin
(20 30 50 mg/L) inyectando cada uno por triplicado.
Se considera como

el promedio de los resultados obtenidos a

partir de la muestra adicionada de estndar de histamina a la matriz


negativa durante la etapa de extraccin. Se considera matriz negativa a la
muestra de Salmn coho, correspondiente al da cero, ya que su contenido
de histamina sera insignificante (Mietz y Karmas, 1978; De la Hoz y col.,
2000; Vigel y col., 2000).
Se considera como valor verdadero la concentracin de la cantidad
agregada de estndar de histamina a la matriz negativa.
En las figuras N4 se indica la preparacin de la muestra utilizada
para el clculo de la exactitud en dicha tcnica analtica.

Figura N3: Preparacin de la muestra para la determinacin


de la exactitud por HPLC

4.3.1.5. Intervalo
Se determina por anlisis cuantitativos de muestras con diferentes
concentraciones del analito. Establecindose el intervalo de concentracin
para el cual se obtiene una exactitud y precisin aceptable (Huber, 1994;
Eurachem, 2002).
4.3.2. Cuantificacin de histamina por HPLC
El mtodo se basa en determinar el contenido de histamina del alimento
mediante la extraccin con TCA 10%, derivatizacin pre-columna con cloruro
de dansilo y posterior anlisis de los derivados dansilados en HPLC por
deteccin UV a 254 nm. En la figura N6 se seala la descripcin de la
preparacin de la muestra.

Figura N4: Determinacin de histamina por HPLC en msculo


claro de Salmn coho

4.3. 2.1. Condiciones cromatogrficas

Deteccin UV: 254 nm


Fase mvil sistema isocrtico: metanol/agua (75/25)
Flujo: 1 ml/min
Presin: 1300 1400 psi
Temperatura: 30C
Inyeccin: 20 L (limpiar la jeringa y el inyector con agua despus de
cada inyeccin)
Tiempo de corrida: 10 min
Lavado de columna: Utilizar acetonitrilo o metanol/agua (70/30)
Tiempo de lavado: 15 min.

4.3.3. Parmetros analticos

4.3.3.1. Clculo de la eficiencia


La eficiencia de la columna o del capilar est dada por el nmero de
platos tericos (N), dado por: (Skoog y col., 2001)
Donde: en HPLC, tx = tr = tiempo de retencin, expresado en minutos.
en CZE, tx = tm = tiempo de migracin, expresado en minutos.
W = ancho de la base del pick, expresado en minutos.
4.3.3.2. Clculo
electrofortica

del

factor

de

capacidad

de

la

movilidad

En HPLC la medicin del factor de capacidad (k) es una operacin


muy frecuente, ya que su valor se emplea tanto para evaluar la retencin
como para ajustar la separacin. El valor de k, puede ser ajustado
modificando la fuerza de elucin de la fase mvil (Quattrocchi y col., 1992).
El k est dado por la siguiente expresin: (Quattrocchi y col., 1992)

Donde : tn = tiempo de retencin.


to = tiempo muerto.
En electroforesis capilar, el movimiento de un analito a travs de un
capilar se describe por el tiempo de migracin y movilidad efectiva,
comparables con el tiempo de retencin y factor de capacidad en
cromatografa (Huber, 1994).
La movilidad electrofortica (ep) est dada por la siguiente expresin:
(Gallardo y col., 1997)

Donde: Ld = largo del capilar hasta el detector, expresado en cm.


tm = tiempo de migracin, expresado en segundos.
V = voltaje, expresado en volts.
Lt = largo total del capilar, expresado en cm.
4.3.4. Anlisis estadstico
4.3.4.1. Anlisis de varianza de una variable
Para evaluar la variabilidad de la concentracin de histamina entre
los duplicados de los individuos, se realiz un anlisis de ANOVA de una
variable, en un nivel de confianza p < 0,05, en el programa Statgraphics
plus 4.0.
4.3.4.2. Anlisis de varianza de variables mltiples
Para evaluar la variabilidad de la concentracin de histamina con
respecto a las variables da de almacenamiento, individuo, estrato-peso

(anexo N3, figura N12) y sexo, se realiz un anlisis de ANOVA de variable


mltiple, en un nivel de confianza p < 0,05, en el programa Statgraphics
plus 4.0.
4.3.4.3. Test de rango mltiple
Se realiz el test de Tukey, en el programa Statgraphics plus 4.0,
para las variables que mostraron diferencia significativa (p < 0,05) en el
anlisis de ANOVA de variable mltiple.

V. RESULTADOS
5.1. TABLAS
Tabla N1: Concentracin del estndar de histamina versus rea obtenida

Tabla N2: Concentracin del estndar de histamina versus rea obtenida

Tabla N3: Concentracin de histamina en Salmn coho, conservado al


estado refrigerado por 24 das

Tabla N4: Resultados con rplica

Tabla N5: Resultados promediados

5.2. FIGURAS (GRAFICOS)


Figura N5: Histograma de peso-vivo de las muestras de Salmn coho

Figura N6: Promedio de la concentracin de histamina con respecto al da de


Almacenamiento

Figura N7: Grfico de las medias del promedio de la concentracin de histamina


con respecto al da de almacenamiento

VI. DISCUSIN DE RESULTADOS


6.1. VALIDACIN LIMITADA DE LA TCNICA HPLC
6.1.1. Linealidad
En el intervalo 5 a 75 mg/L se prepararon dos curvas de calibracin donde
se evaluaron los estimadores de regresin en un nivel de confianza p <
0,05, que se presentan en la siguiente tabla y sus respectivos grficos en
la figura N8.

Tabla N6: Estimadores de regresin de las curvas de calibracin de histamina


por HPLC.

Figura N8: Curvas de calibracin de histamina por HPLC

El coeficiente de regresin lineal (r), de las curvas de calibracin, es


semejante a 0,9959; obtenido en otro estudio donde se aplic HPLC, para
la determinacin de histamina (Veciana-Nogus y col., 1995).
De acuerdo al nmero de mediciones y en un nivel de confianza p< 0,05,
el valor de t tabulado es: ttabla = 2,120 (OMahoney, 1986). Los valores
obtenidos para tr son mayores que el valor de t tabulado, por lo tanto se
rechaza la hiptesis nula (no entre x e y), siendo las correlaciones
lineales significativas.
Al comparar ambas curvas de calibracin, se aprecia que la curva N1 es
ms satisfactoria, porque su coeficiente de regresin es ms cercano a 1 y
por la menor magnitud de los estimadores de la desviacin estndar: S r, Sb
y Sa.
6.1.2. Lmite de deteccin
Clculo de la pendiente de la curva de calibracin:
La pendiente de la curva de calibracin N1 es b = 22450,4872.
Clculo de la respuesta a concentracin cero:
Segn lo explicado en la metodologa, en el punto 2.3.1.2.,
considerando los valores medios de rea, se obtiene una 2 curva de
calibracin, la cual es graficada en a figura N9.

La estimacin de la respuesta a concentracin cero es Ybl =


58332,7778.

Figura N9: Promedio del rea versus concentracin del estndar de histamina

Clculo de la desviacin estndar de la respuesta a concentracin cero:


De acuerdo a lo explicado en la metodologa, en el punto 2.3.1.2.,
se obtiene la recta dada por la desviacin estndar vs concentracin, la
cual es graficada en la figura N10.
La estimacin de la desviacin estndar a concentracin cero: Sbl =
1610,1271.
Figura N10: Desviacin estndar versus concentracin del estndar de
histamina

Aplicando las ecuaciones N8 y N9, se determin el lmite de


deteccin (LD) y el lmite de cuantificacin (LC): LD = 2,8 mg/L y LC =
3,3 mg/L.
En otra investigacin de determinacin de histamina por HPLC,
realizada en condiciones cromatografas semejantes, se obtuvo un LD
dentro del rango de 1 a 5 mg/L (Eerola y col., 1993), lo cual es coincidente
con los resultados del presente estudio. Sin embargo, si esta tcnica
analtica, es aplicada en otras condiciones cromatografas (derivatizacin

post-columna), el LD alcanza valores menores a 1 mg/L (Veciana-Nogus y


col., 1995).

6.1.3. Precisin
Se determin evaluando la reproducibilidad y repetitividad de las
concentraciones seleccionadas en la curva de calibracin N1.
En las tablas N7 y N8 se indican los valores de la RSD (ecuacin N12)
obtenidos para los tres niveles de concentraciones en las pruebas de
reproducibilidad (ensayos intrada) y repetitividad (ensayos interda).

Tabla N7: RSD (%) de las pruebas de la reproducibilidad para la determinacin


de la precisin por HPLC

Tabla N8: RSD (%) de las pruebas de la repetitividad para la determinacin de


la precisin por HPLC

Se observa, que la desviacin estndar de la reproducibilidad es dos o tres


veces ms grande que aqulla para la repetitividad (Huber, 1994). Los

resultados obtenidos, para ambas expresiones de la precisin, presentan


un valor de RSD, que est dentro del lmite dado por la ecuacin de
Horwitz, es decir la variabilidad a largo plazo (reproducibilidad) y corto
plazo (repetitividad) es aceptable, por lo cual los resultados que se
obtengan se pueden considerar confiables.
6.1.4. Exactitud
De acuerdo a lo explicado en la metodologa, en el punto 2.3.1.4., la
exactitud se calcul realizando un ensayo de recuperacin.
Los resultados obtenidos en las pruebas de recuperacin
concentraciones seleccionadas se indican en la tabla N9.

de

las

Tabla N9: Recuperacin del estndar de histamina en muestras de Salmn coho


en la
Determinacin de la exactitud por HPLC

En los tres niveles de concentracin, los resultados de las pruebas de


recuperacin son satisfactorios, ya que estn alrededor del 100%.
En otra investigacin en la cual se aplic HPLC, para la determinacin de
histamina, en el clculo de la exactitud, se obtuvo un valor de RSD (%) de
5,8 (Eerola y col., 1993); el cual es ms alto que el obtenido en el presente
estudio, probablemente debido a que, los investigadores realizaron un
mayor nmero de mediciones en el clculo de la recuperacin.
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en otros estudios de
aplicacin de esta tcnica, en los cuales se registran valores de
recuperacin de 96% (Eerola y col., 1993) y 99,2% (Veciana-Nogus y col.,
1995).
6.1.5. Intervalo
Mediante los resultados obtenidos en los parmetros mencionados
anteriormente, se aprecia que esta tcnica analtica presenta una precisin
y exactitud aceptable dentro del intervalo de 5 a 75 mg/L.
6.2. CUANTIFICACIN DE HISTAMINA EN SALMN COHO

Una vez que la tcnica analtica HPLC fue validada y se demostr su


confiabilidad, se utiliz para la cuantificacin de histamina en Salmn coho
fresco refrigerado, conservado a 0 2C por un perodo de 24 das.
A travs de los resultados obtenidos en las pruebas de linealidad por HPLC,
se obtuvo el cromatograma del estndar de histamina y su tiempo de
retencin, el cual se compar con los cromatogramas de las muestras de
Salmn coho para determinar su contenido de histamina (anexo N6,
figuras N15 - N18).
En los cromatogramas obtenidos por HPLC se observa que el pick del
estndar de histamina no interfiere con los otros pick de la muestra, por lo
cual, esta tcnica no presenta dificultades en la cuantificacin de esta
amina.
En la tabla N10 se indica el tiempo de retencin (tr) para el pick de
histamina en el estndar y en muestras de salmn, ambos obtenidos en la
cuantificacin por HPLC.

Tabla N10: Tiempo de retencin obtenido en HPLC en el pick de histamina en el


estndar y en muestras de salmn

En la determinacin por HPLC se realiz una derivatizacin pre-columna


con cloruro de dansilo, el cual es un reactivo que posee grupos fluorforos
que pueden ser detectados por un detector de fluorescencia. En el anexo
N6 se presenta el cromatograma del estndar de histamina obtenido por
este tipo de detector, en el cual se aprecia una mejor deteccin, ya que
aumenta la altura del pick; sin embargo, se mantiene la base ancha que se
reflejara en un bajo nmero de platos tericos y por lo tanto sera una
determinacin poco eficiente.
Los resultados de la cuantificacin de histamina, en muestras de Salmn
coho obtenido por HPLC, en los controles realizados a los 0,3,6,10,12,17,19
y 24 das de almacenamiento refrigerado, se presentan en el anexo N2.
De acuerdo a lo explicado en el punto 4.3.4.1., se realiz el ANOVA, el cual
demostr que no existen diferencias significativas (p > 0,05) entre los
duplicados de cada individuo, por lo tanto se pueden promediar los
resultados (HPLC: anexo N4, tabla N15).
De acuerdo a lo explicado en el punto 4.3.4.2., se realiz el ANOVA, el cual
demostr que no existen diferencias significativas (p > 0,05) entre la
concentracin de histamina con respecto al individuo, estrato-peso y sexo;
y que si existen diferencias significativas (p < 0,05) con respecto al da de
almacenamiento (HPLC: anexo N4)

Habiendo establecido estadsticamente que el contenido de histamina de


los salmones en estudio slo incide significativamente los das de
almacenamiento, se discute a continuacin la evolucin de histamina a
travs del tiempo.
la figura N11 indica los resultados promedios obtenidos de la
cuantificacin de histamina en las muestras de Salmn coho refrigerado (0
- 2C) por un perodo de 24 das.
Figura N11: Evolucin de la histamina por HPLC en Salmn coho refrigerado (0 2C)
a travs del tiempo

Al considerar los resultados (figuras N11) se observ que la concentracin


de histamina aumenta a medida que aumenta el tiempo de
almacenamiento, lo cual concuerda con otros estudios de determinacin de
histamina en pescado (Gallardo y col., 1997; De la Hoz y col., 2000; Du y
col., 2002a).
En el presente estudio la concentracin de histamina, generada en el
Salmn coho, conservado al estado fresco - refrigerado, est por bajo del
lmite establecido por la Unin Europea y SERNAPESCA, de 100 mg/kg, pero
algunas muestras correspondientes al da 24 de almacenamiento (figura
N14) sobrepasan los lmites ms estrictos establecidos por la FDA de 50
mg/kg (FDA, 2001). Es decir, la histamina sera un peligro potencial en el
Salmn coho cuando se conserva refrigerado por un perodo prolongado.
Estos resultados demuestran, que el contenido de histamina en Salmn
coho, es menor que el registrado en las especies de pescados,
pertenecientes a las familias Scombridae (tales como: caballa, atn,
albacora, etc.) y Clupeidae (tales como: sardinas, arenque, etc.), bajo las
mismas condiciones de almacenamiento. Por ejemplo: en sardinas
almacenadas por 15 das y en atunes almacenados por 9 das, se registraron
niveles de histamina de 211,52 y 95,5 mg/kg respectivamente (Gallardo y
col., 1997; Silva y col., 1998; Du y col., 2002a). Sin embargo, a pesar que
este pescado es escmbrido porque pertenece a la familia Salmonidae,
debera conservarse congelado cuando el perodo de almacenamiento es
prolongado para disminuir el riesgo de formacin de histamina.

En las mismas muestras de salmn de este estudio (pero de otra seccin de


cada salmn), conservadas al estado fresco refrigerado, Maier (2005)
demostr que a los 24 das se present un recuento de aerobios mesfilos
(RAM) inferior a los lmites mximos permitidos por SERNAPESCA (2005); sin
embargo, de acuerdo a los anlisis sensoriales se le estim una vida til de
12 das. La produccin de histamina no est relacionada con la carga
bacteriana, pero s est influenciada por el nmero de bacterias capaces de
sintetizar la histidina descarboxilasa (Du y col., 2002b). Esta relacin se
aprecia en los resultados obtenidos, porque a pesar que todas las muestras
de Salmn coho tienen una carga bacteriana aceptable; algunas de ellas,
correspondientes al da 24 de almacenamiento tienen una concentracin de
histamina que es superior a los lmites de la FDA. Se recomienda estudiar la
existencia de
bacterias formadoras de histamina y su correlacin con el contenido de
histamina en el Salmn coho.
En una visita inspectiva realizada a la empresa Mainstream S. A., que
proces los Salmones coho entero (HG) para este estudio, se comprob la
correcta implementacin del sistema HACCP. Esto fue confirmado por Maier
(2005) quien encontr bajos valores RAM y explica los bajos valores de
histamina registrados inicialmente.
En un estudio sobre la generacin de histamina, en diferentes tipos de
pescados (caballa, albacora, mahi-mahi y salmn), inoculados con
Morganella morganii (principal bacteria asociada con produccin de
histamina), y luego almacenados a distintas temperaturas (4, 15, 25 y
37C), se demostr que en el Salmn atlntico (Salmo salar) se registran las
concentraciones ms bajas de histamina, por ejemplo en las muestras
almacenadas a 4C, a las 14 horas de almacenamiento, en el salmn se
registran valores de 40 mg/kg; en cambio en las otras especies se
alcanzaron concentraciones en el intervalo de 45 a 75 mg/kg (Kim y col.,
2002). Es decir, debido a que el msculo del salmn contiene una baja
cantidad del aminocido histidina, posee menos probabilidades de
generacin de altas concentraciones de histamina.
En lo que se refiere a la influencia de la temperatura en la formacin de
histamina, en pescados conservados al estado fresco refrigerado se inhibe
la generacin de histamina (Veciana-Nogus y col., 1997; Du y col., 2001,
2002a y 2002b). En cambio, en pescados sometidos a temperatura
ambiente elevada aumenta el contenido de histamina (Jeyasekaran y col.,
2004; Shakila y col., 2005). En este estudio hasta el da 12 no se detect
histamina, pero a partir del da 17 hubo un aumento significativo (30
mg/kg), que se elev a un valor promedio de 46 mg/kg el da 24.
Segn la FDA, la ausencia de descomposicin en el pescado, suministra un
producto inocuo. Es decir, un producto inocuo no debera tener evidencias
de contaminacin, que incluyan olores de descomposicin, altos niveles de
histamina y de otras aminas asociadas con la descomposicin, tales como
cadaverina y putrescina, las cuales son capaces de aumentar la toxicidad
histamnica (FDA, 2001).
Los avances de la tecnologa, ofrecen ventajosas alternativas frente a los
tradicionales procedimientos, de este modo se conocen otros medios de
conservacin, tales como el envasado al vaco y bajo atmsfera modificada,
que permiten extender la vida til de los productos refrigerados. Se ha

demostrado, que estos nuevos medios de conservacin inhiben el


crecimiento de aminas biognicas (De la Hoz y col., 2000; zogul y col.,
2002).

VI. CONCLUSIN
La formacin de histamina en Salmn coho almacenado refrigerado (0
2C), es nula hasta el da 12 de almacenamiento; pero aumenta
progresivamente a partir del da 17, no obstante el salmon coho es apto
para el consumo hasta los 24 das, conservado al estado fresco
refrigerado, ya que el contenido de histamina es inferior a los lmites
establecidos por SERNAPESCA para productos pesqueros de exportacin
(aplicable slo a pescados clupeidos, escmbridos y jurel). Sin embargo, los
niveles de histamina, registrados en algunas muestras del da 24, sealan
que estas muestras no son aptas para el consumo, porque sobrepasan los
lmites mximos de la FDA, para pescados escmbridos y relacionados con
escmbridos.

VII. BIBLIOGRAFA
1. MAIER Neumann, Liliana Cristina. Evolucin de la calidad e inocuidad
de Salmn coho (Oncorhynchus kisutch) conservado al estado
refrigerado. Tesis (Magster en Ciencias de los Alimentos) Santiago,
Chile. Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Qumicas y
Farmacuticas, 2005.
2. CIDEIBER. Chile. Actividades del primario-sector pesquero [en lnea]
<http://www.cideiber.com/infopaises/chile/chile-04-04.html>
[consulta: 16 mayo 2005]
3. NCh 2637 of 2001. Productos hidrobiolgicos: Determinacin de
histamina y otras aminas biognicas Mtodo HPLC con detector UV.
Diario Oficial del 22 de enero del 2002.
4. SERNAPESCA. Programa de control de producto final. Norma tcnica,
Seccin 1: Requisitos generales para la certificacin sanitaria de los
productos pesqueros de exportacin. Departamento de Sanidad
Pesquera
[en
lnea]
Servicio
Nacional
de
Pesca.
Chile.
<www.sernapesca.cl> [consulta: 20 marzo 2005].
5. HUBER, L. Validacin de mtodo. En su: Buenas prcticas de
laboratorio y buenas prcticas de fabricacin actuales. Holanda,
Hewlett Packard, 1994. pp. 53 64.

6. QUATTROCCHI, O.; ABELAIRA, S.; LABA, R. Bases de la separacin. En


su: Introduccin a la HPLC: Aplicacin y Prctica. Argentina, Artes
Grficas Farro S. A., 1992. pp. 39 63.

VIII. ANEXOS
ANEXO N1
RESULTADOS DE LA VALIDACIN LIMITADA DE LAS TCNICAS
ANALTICAS
I.

Validacin limitada de HPLC


1.1. Linealidad
Tabla N11: Concentracin del estndar de histamina versus rea obtenida

1.2. Lmite de deteccin


Tabla N12: Concentracin del estndar de histamina versus rea obtenida

ANEXO N2
CUANTIFICACIN DE HISTAMINA
I. Cuantificacin por HPLC
Tabla N13: Concentracin de histamina en Salmn coho, conservado al
estado refrigerado por 24 das

ANEXO N3
CLASIFICACIN DE LOS SALMONES SEGN PESO
Figura N12: Histograma de peso-vivo de las muestras de Salmn coho

ANEXO N4

ANLISIS ESTADSTICO DE LA CUANTIFICACIN DE HISTAMINA POR


HPLC
I. Anlisis estadstico de los resultados con rplica
Tabla N14: Resultados con rplica

Tabla N15: ANOVA de la concentracin de histamina versus rplica

II. Anlisis estadstico de los resultados promediados

Tabla N16: Resultados promediados

Tabla N17: ANOVA del promedio de la concentracin de histamina versus da de


almacenamiento, individuo, estrato-peso y sexo

III. Test de Rango mltiple con respecto a la variable Dia

Tabla N18: Test de tukey

Figura N13: Promedio de la concentracin de histamina con respecto al da de


Almacenamiento

Figura N14: Grfico de las medias del promedio de la concentracin de histamina


con respecto al da de almacenamiento

ANEXO N5
CROMATOGRAMAS Y ELECTROFEROGRAMAS
I. Resultados de HPLC: Cromatogramas
Figura N15: Estndar de histamina de 50 mg/L

Figura N16: Muestra de Salmn coho, marcada con estndar de histamina

Figura N17: Muestra de Salmn coho, del da 3 de almacenamiento

Figura N18: Muestra de Salmn, del da 24 de almacenamiento

ANEXO N6

DETERMINACIN POR HPLC CON DETECTOR DE FLUORESCENCIA


Figura N19: Estndar de histamina de 240 mg/L

Figura N20: Estndar de histamina de 120 mg/L