PRACTICA N 3

PRUEBAS BIOQUIMICAS
1. INTRODUCCION
Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a
medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar
distintos microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la
actividad de una via metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un
medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.
Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los
cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en
estudio .Adems estudiaremos los resultados que estos test arrojan,
comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de trabajo de
nuestro laboratorio

2. OBJETIVOS
Realizar el experimento adecuadamente y poder identificar -aplicando
ste mtodo- distintos microorganismos.
Entender los principios bioqumicos de las pruebas.
Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados
por las pruebas bioqumicas
Conocer el uso de las pruebas bioqumicas para la identificacin de
microorganismo

3. MATERIALES
Prueba coagulasa
Agar citrato simons

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Medio sin
Prueba la
Prueba ureasa
Asa de siembra
Guantes
Tapa boca
Mechero para esterilizar

4. MARCO TEORICO
1. PRUEBA COAGULASA
1.1 FUNDAMENTO
Detecta un factor de agregacin clumping factor en la superficie de la
bacteriana.

1.2 PROCEDIMIENTO
Se coloca una colonia sospechosa de pertenecer a una especie de
Staphylococcus y se emulsifica en una gota de plasma de conejo.
Esterilizar el asa de siembra a llama

Sacar una pequea cantidad de muestra

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Inocular al microorganismo a medio de coagulasa, sin tocar las paredes

del tubo

Esterilizar el asa de siembra usada

Dejar incubar a 37C por 24 horas

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1.3 INTERPRETACIN
arracimamiento bacteriano en 1 minuto = prueba (+).
Si el resultado es negativo ensayar la produccin de coagulasa en tubo

2. AGAR CITRATO

2.1 FUNDAMENTO
Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que utilizan el citrato
como nica fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol.

2.2 PROCEDIMIENTO
El color original del medio es verde, y se encuentra tubo de ensayo
Esterilizar el asa de siembra

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Tomar la muestra de e. coli con la asa de siembra en punta

Inocular el microorganismo por puncin sin tocar las paredes del tubo

se incuba 24-72hs a 37C.

Resultado
positivo

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2.3 INTERPRETACIN
Si el microorganismo utiliza citrato, se produce alcalinizacin del medio de
cultivo pasando ste a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para el
citrato.

2.4 RESULTADOS
POSITIVO: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad
NEGATIVO: el medio permanece de color verde debido a que
no ha desarrollo bacteriano y no hay cambio de color

3. TSI
3.1

FUNDAMENTO

Es un medio de cultivo. Gracias a su composicin es uno de los medios de

cultivo ms empleados para la diferenciacin de enterobacterias con objetivo
de diferenciar entre:

bacterias fermentadoras de la glucosa

bacterias fermentadoras de la lactosa
bacterias fermentadoras de sacarosa
bacterias aerognicas
bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que
contengan azufre.

3.2

PROCEDIMIENTO

El medio fraccionado en tubo de ensayo contiene urea y rojo de fenol como

indicador, el color original del medio es amarillo (o sea cido)
Esterilizar el asa de siembra antes de tomar la muestra

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Sacar la muestra de salmonella

Se inocula el microorganismo por puncin tanto en profundidad como en

la superficie, sin tocar las pares del tubo

Se deja incubar 24 hs a 37 C.

3.3

INTERPRETACIN

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Si el microorganismo es productor de ureasa, desdobla la urea produciendo
amonaco, consecuentemente produce alcalinidad que se manifiesta porque el
medio toma un color fucsia.

RESULTADOS:
Pico alcalino/fondo alcalino: no hay fermentacin de azucares.
Caracterstica de bacterias no fermentadoras como Pseudomonas sp.
Pico alcalino/fondo cido: Glucosa fermentada, lactosa ni sacarosa
fermentadas. Shigella spp.
Pico alcalino/fondo negro: Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa
fermentada, produccin de cido sulfhdrico. Salmonela spp.
Pico cido/fondo cido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas.
Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli.
A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas

4.

PRUEBA SIM

4.1 FUNDAMENTO
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y
de sulfuro de hidrogeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de
la familia enterobacteriaceae.

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Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de
extracto de levadura, peptona y tripteina.
Adems la tripteina aporta grandes cantidades de triptfano, sustrato de la
enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol.
La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para
la deteccin de la enzima ortinina descarboxilasa, el purpura de bromocresol es
el indicador de PH que en medio alcalino es de color purpura y en medio acido
es de amarillo.

4.2 PROCEDIMIENTO:
Esterilizar el asa de siembra

Sacar la muestra de estreptococos

Inocular el microorganismo por puncin con el asa de siembra de punta.

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Esterilizar el asa de siembra usada

Se deja incubar a 37C durante 24hs.

4.3

RESULTADOS

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4.3.1 MOVILIDAD
RESULTADO POSITIVO: presencia de turbidez o crecimiento mas alla
de la lnea de siembra
RESULTADO NEGATIVO: crecimiento solamente en la lnea de siembra
4.3.2 RESORNITINA DECARBOXILASA
RESULTADO POSITIVO: color purpura
RESULTADO NEGATIVO: color amarillo. A veces se puede desarrollar
un color violceo en la superficie del medio
4.3.3 PRUEBA DEL INDOL
La prueba de indol se realiza una vez se ha determinado la movilidad y
la prueba de ornitina
RESULTADO POSITIVO: color rojo al agregar el reactivo revelador
RESULTADO NEGATIVO: el color del reactivo revelador permanece
incoloro -amarillento
.

5. UREASA
Positivo

Negativo

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5.1

FUNDAMENTO

Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que poseen la

enzima ureasa.

5.2

PROCEDIMIENTO

El medio fraccionado en tubo de ensayo contiene urea y rojo de fenol como

indicador, el color original del medio es amarillo (o sea cido)
Esterilizar el asa de siembra antes de tomar la muestra
Sacar la muestra de
Se inocula el microorganismo por puncin tanto en profundidad como en
la superficie, sin tocar las pares del tubo
Se deja incubar 24 hs a 37 C.

5.3

INTERPRETACIN

Si el microorganismo es productor de ureasa, desdobla la urea produciendo

amonaco, consecuentemente produce alcalinidad que se manifiesta porque el
medio toma un color fucsia.

6 LISINA HIERRO AGAR (LIA)

LIA + SH2 LIA-SH2-

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6.1

FUNDAMENTO

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente

salmonella spp, basado en la dexcarboxilacion, desanimacin de la lisina y en
la produccin de acido sulfhdrico.
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los
nutrientes para el desarrollo bacteriano.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas descarboxilasa y
deaminasa.
El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la
produccin de acido sulfhdrico.
Por la dexcarboxilacion de la lisina, se produce la amina cadaverina, que
alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.
La dexcarboxilacion de la lisina, tiene lugar en el medio acido, por lo que es
necesario que la glucosa sea previamente fermentada.

PROCEDIMIENTO

6.2

Esterilizar el asa de siembra antes de tomar la muestra

Sacar la muestra de
Se inocula el microorganismo por puncin tanto en profundidad como en
la superficie, sin tocar las pares del tubo
Se deja incubar 24 hs a 37 C

6.3

RESULTADOS

6.3.1 DESCARBOXILACION DE LA LISINA

PRUEBA POSITIVA: pico violeta, fondo violeta
PRUEBA NEGATIVA: Pico violeta fondo amarillo
6.3.2 Desimanacin de la lisina
Pico rojo, fondo amarillo. Esto sucede con cepas del genero
proteus, providencia y alguna cepas de salmonella spp

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