Manual Estructura y Función Celular II

Manual de Prctica de Estructura y Funcin Celular II
MANUAL DE PRCTICAS
ESTRUCTURA Y FUNCIN
CELULAR II
Dra. Leticia Bucio Ortiz.
Dra. Vernica Souza Arroyo.
Dra. Viridiana Gonzlez Puertos.
Dr. No Salinas Arreortua.
Dr. Eduardo Casas Hernndez.
Febrero 2014.
NDICE.
Nombre
Pg.
INTRODUCCIN
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO _______________.
iv
1. Permeabilidad celular
2. Obtencin y caracterizacin de colgena
3. Glucoclix
12
4. Pared celular
18
5. Respiracin mitocondrial
22
6. Extraccin de los pigmentos en tejido vegetal y su separacin

cromatogrfica
.
29
7. Fotosntesis: demostracin de la tasa de fotosntesis, empleando

discos de hoja
.
36
8. Obtencin y determinacin cuantitativa del cido

desoxirribonucleico.
43
9. Mitosis
49
10. Meiosis en clula vegetal
56
Bucio Ortiz L, Souza Arroyo V, Gonzlez Puertos V,

Salinas Arreortua N y Casas Hernndez E.
INTRODUCCIN.
El presente manual de laboratorio, responde a las necesidades de llevar a la
prctica los temas considerados en la Unidad de Enseanza aprendizaje (UEA):
Estructura y Funcin Celular II (clave 2341093), la cual comprende 4 h de teora y 3
h de sesin prctica por semana. Dicha UEA es de tipo obligatorio para las
licenciaturas de Biologa Experimental, Biologa e Hidrobiologa y optativa para las
otras licenciaturas de la Unidad Iztapalapa y aprobada por el Colegio Acadmico de
la UAM, en su sesin 344 del 13 de Abril del 2012.
Las diez prcticas de laboratorio del presente manual, cubren en un 100 % los
temas tericos de esta UEA, se han realizado y probado en los laboratorios de la
DCBS, de la UAM-Iztapalapa y permiten la participacin activa de los alumnos para
reforzar los conocimientos vistos en la clase terica.
Prctica 1. Permeabilidad celular.

La permeabilidad selectiva de la membrana plasmtica juega un papel
fundamental en las clulas, ya que el intercambio de sustancias entre sta y el medio
es esencial para el funcionamiento adecuado y homeostasis celular. En esta prctica
se presentan 2 modelos de membrana, uno in vivo y otro in vitro, que permitir al
alumno darse cuenta de cmo actan dinmicamente las membranas, tanto
microscpica (eritrocitos) como macroscpicamente (condn de ltex).
Prctica 2. Obtencin y caracterizacin de colgena.

Las colgenas forman parte de la familia de las protenas fibrosas de la matriz
extracelular, su principal funcin es la de soporte estructural y celular. Por ello la
importancia biolgica de la colgena es muy significativa y en esta sesin prctica el
procedimiento que se plantea para la extraccin de esta protena es muy sencillo a
partir de crestas de pollo. Debido al alto contenido de prolina que contiene la
colgena en su estructura es posible identificarla por una reaccin colorida.
Prctica 3. Glucoclix.
Permite de una manera rpida y sencilla, determinar el tipo sanguneo de cada
uno de los alumnos, al observar una respuesta positiva mediante la aglutinacin de
clulas sanguneas al reaccionar con antisueros, A, B, o D. Esta aglutinacin es el
resultado de la interaccin que ocurre entre los antgenos de membrana que forman
el glucoclix y que son especficos de cada persona y los sueros agregados.

Prctica 4. Pared celular.

Con esta prctica el alumno tendr una enseanza activa, participativa e
individualizada, donde adems de promoverse el mtodo cientfico aplicar un
espritu crtico. Tambin aprender cuales son los componentes de la pared celular
en clulas vegetales,
as como su papel y funcionalidad tanto en tejidos
desarrollados (como el caso de epidermis de cebolla) o en tejidos de tipo
meristemticos (raz de frijol o haba) mostrando el desarrollo de esta estructura
desde sus diferentes estadios.
Prctica 5. Respiracin mitocondrial.
Esta prctica tiene como finalidad fundamental promover el aprendizaje de
forma significativa, ya que en ella se pueden integrar aspectos de ciencia bsica y el
mtodo cientfico. El estudio de la respiracin mitocondrial es fundamental ya que es
un proceso indispensable para
la sntesis de energa necesaria para la
supervivencia celular, permitiendo que los alumnos visualicen las consecuencias al
haber un mal funcionamiento en algunos de los complejos protenicos que conforman
la cadena respiratoria y la fosforilacin oxidativa, los cuales tienen un papel
importante en la funcionalidad de rganos y tejidos de los organismos.
Prctica 6. Extraccin de los pigmentos en tejido vegetal y su separacin
cromatogrfica.
El objetivo de esta prctica es el de fomentar la enseanza y conocimiento en
ciencia bsica. La prctica permite que los alumnos adquieran el conocimiento y
observen mediante la cromatografa en papel la presencia de los diferentes
pigmentos fotosintticos en el tejido vegetal, los cuales estn encargados de la
captacin de la energa solar, ya que la fotosntesis es el principal medio de fijacin
de carbono y la principal fuente de oxgeno en la atmsfera terrestre.
Prctica 7. Fotosntesis
En la fase luminosa de la fotosntesis, se utiliza la luz para generar ATP y reducir
al NADP+ a NADPH, que son empleados en la fase oscura (ciclo de Calvin) para fijar
CO2 y producir glucosa. Adems, se produce O2 como subproducto de la fotlisis del
agua en la cadena de transporte de electrones que ocurre en el cloroplasto de las
clulas del mesfilo de las hojas verdes.
Practica 8. Obtencin y determinacin cuantitativa del
cido
desoxirribonucleico.
La molcula de cido desoxirribonucleico (DNA) contiene toda la informacin
gentica de un organismo. Esta molcula est constituida por dos largas cadenas
polinucleotdicas antiparalelas unidas entre s formando una doble hlice que se
mantienen unidas por puentes de hidrgeno al aparearse por la complementaridad
ii

entre las bases nitrogenadas. La extraccin de DNA de hgado de pollo es a travs

de una tcnica sencilla. Las desoxipentosas presentes en la estructura del DNA,
permiten estimar su contenido mediante una reaccin colorida.
Prctica 9. Mitosis.
La mitosis es el proceso de divisin de las clulas somticas ya sea de tipo
vegetal o animal, en el cual a partir de una clula madre se producen dos clulas
hijas idnticas en cantidad y tipo de DNA. En esta prctica se toma como modelo
estudiar las diferentes fases de la mitosis en clulas de tipo vegetal, en el meristemo
apical de raz de cebolla, haba, frijol u otra semilla que se disponga. Mediante el uso
de un agente mitosttico es posible incrementar la probabilidad de observar clulas
y cromosomas en profase, metafase, anafase y telofase, en comparacin a clulas
en interfase.
Prctica 10. Meiosis en clula vegetal.
La meiosis es el proceso de divisin de las clulas germinales ya sea de tipo
vegetal o animal, en el cual a partir de una clula madre se producen cuatro clulas
hijas conteniendo la mitad del material gentico. El modelo que se utilizar son
botones florales en primeras etapas de desarrollo de plantas, debido a su fcil
disponibilidad se sugiere hacerlo en el gnero Gibasis u otras accesibles. En esta
prctica al emplear las anteras inmaduras, es posible obtener clulas que se
encuentran realizando alguna de las 2 divisiones meiticas, las que pueden
presentar 2 ncleos o bien formar ttradas, as como observar sus cromosomas en
las diferentes fases: profase, metafase, anafase o telofase.
iii

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

El laboratorio es un lugar donde se manipulan una gran cantidad y variedad de
productos peligrosos. Con el fin de evitar accidentes como incendios, explosiones,
intoxicaciones y quemaduras, se han establecido una serie de normas bsicas de
seguridad y precaucin para evitar riesgos.
Es obligatorio el uso de bata y lentes de seguridad.

Al realizar cada una de las prcticas, el alumno debe estar informado de las
medidas de seguridad, as como del manejo y toxicidad de los reactivos.
Es preciso identificar en el lugar, la localizacin de los extinguidores, las
regaderas y las salidas de emergencia del laboratorio.
Queda prohibido fumar e ingerir alimentos y bebidas dentro del laboratorio.
Debe revisarse el material de vidrio para comprobar posibles fisuras,
especialmente antes de su uso.
Asegurar el enfriamiento del material que se ha calentado antes de sujetarlo
con la mano.
Queda prohibida la visita de personas ajenas a la prctica que se realiza.
La transferencia de un lquido con pipeta nunca ha de realizarse succionando
con la boca, sino que deber utilizar perilla de hule.
Los productos y reactivos qumicos que puedan desprender vapores txicos o
corrosivos, deben ser manipulados en las campanas extractoras y los
solventes orgnicos nunca cerca de una flama.
No dejar en las mesas de laboratorio frascos destapados. Muchas sustancias
lquidas (alcohol, ter, cloroformo, amonaco, etc.) emiten vapores txicos.
Lavarse siempre las manos despus de realizar la prctica y antes de salir del
laboratorio.
Es imprescindible el uso de guantes cuando se manipulan sustancias txicas
o biolgicas, y recomendable cuando se trabaja con sustancias corrosivas e
irritantes. Cualquier quemadura con cido, o base, requiere que se ponga la
parte afectada bajo el chorro de agua fra durante 15 minutos y comunicarlo
de inmediato al profesor.
En el laboratorio existen contenedores debidamente etiquetados donde se
introducirn en su caso, los residuos generados ya sean qumicos o
biolgicos, para ser inactivados o incinerados..
En caso de tener que evacuar el laboratorio, cerrar la llave del gas y salir de forma
ordenada siguiendo en todo momento las instrucciones que haya impartido el
profesor.
iv

Prctica 1
PERMEABILIDAD CELULAR
INTRODUCCIN
Para llevar a cabo las reacciones qumicas necesarias en el mantenimiento de la
vida, la clula necesita mantener un medio interno apropiado. Esto es posible porque
las clulas se encuentran separadas del mundo exterior por una barrera limitante, la
membrana plasmtica. Adems, la presencia de membranas internas en las clulas
eucariotas proporciona compartimientos adicionales que limitan ambientes nicos en
los que se llevan a cabo funciones altamente especficas, necesarias para la
supervivencia celular.
El papel fundamental de las membranas es asegurar la separacin metablica y
qumica permitiendo que haya una composicin distinta a concentraciones diferentes
en los espacios delimitados. Por otra parte, es importante sealar que no se pueden
construir barreras impermeables absolutas, porque la vida celular y el funcionamiento
de los organelos requieren intercambios continuos y controlados de materia, energa
e informacin.
Estas membranas biolgicas estn compuestas por protenas asociadas a una matriz
constituida por una bicapa lipdica. Sus fracciones lipdicas consisten en mezclas
complejas que varan segn el origen de las membranas.
La principal caracterstica de la membrana plasmtica es su permeabilidad selectiva,
lo que le permite seleccionar las molculas que deben entrar y salir de la clula. De
esta forma se mantiene estable el medio intracelular, regulando el paso de agua,
iones y metabolitos, a la vez que mantiene el potencial electroqumico.
Molculas
hidrofbicas
y gases.
Molculas
pequeas
con carga.
Molculas grandes
con carga.
Iones.

As mismo, las membranas semipermeables presentan el fenmeno en el que se

produce el paso o difusin de un disolvente a travs de una membrana
semipermeable (permite el paso de disolvente pero no de solutos) desde la
disolucin ms diluida a la ms concentrada. Los medios acuosos separados por una
membrana semipermeable pueden tener diferentes concentraciones, y se
denominan:
-Hipertnicos: son los que poseen una elevada concentracin de solutos con
respecto a otros en los que la concentracin es inferior.
-Hipotnicos: son los que contienen una concentracin de solutos baja con respecto
a otros que la poseen superior.
-Isotnicos: son los que poseen una concentracin de solutos igual a la
concentracin interna de la clula.
OBJETIVO GENERAL
Establecer Observar el comportamiento de las diferentes membranas

biolgicas y no biolgicas en relacin a su permeabilidad a distintos medios
acuosos.
OBJETIVO PARTICULARES
Observar el comportamiento de las clulas vegetales y animales frente a

medios a acuosos con diferente concentracin de soluto.
Observar el fenmeno de la permeabilidad en una membrana artificial.
HIPTESIS
Generada por el estudiante
MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo.
1 Vaso de precipitados de 500 mL.
1 Microscopio de campo claro.
3 Vidrio de reloj.
Papel seda.
Lanceta.
3 Pipetas Pasteur.
1 Piceta con etanol.
2

1 caja de portaobjetos.
1 caja de cubreobjetos.
Proporcionado por el alumno:
Etiquetas adheribles.
Hilo.
Condn (distinta marca por equipo).
Elodea.
Algodn.
Reactivos
Fenolftalena.
Yodo.
Yoduro de potasio.
Alcohol etlico.
Hidrxido de amonio.
Almidn.
NaCl.
Soluciones
NaCl 0.15 M (5 mL).

NaCl 0.075 M (5 mL).
NaCl 0.3 M (5 mL).
Lugol: disolver 1 g de yodo y 2 g de yoduro de potasio en 25 mL de
agua destilada, cuando se haya disuelto completamente agregar 75 mL
de agua destilada para obtener 100 mL.
Fenolftalena (1% P/V). Pesar 1 g de fenolftalena y disolver en 50 mL
de alcohol etlico, y aforar a 100 mL con agua destilada.
Almidn con hidrxido de amonio. Pesar 100 g de almidn y agregarlos
a 450 mL de agua destilada y adicionar 50 ml de hidrxido de amonio.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
A. Membranas biolgicas (estudio microscpico)
Clulas animal.
Nota: La obtencin de la muestra biolgica (sangre) deber realizarse bajo las
condiciones de higiene y seguridad que implican el manejar material biolgico:
3

trabajar en un rea limpia y especfica, no tener contacto directo con la muestra

biolgica, todos los materiales de desecho que contengan sangre (algodn, lanceta,
papel, palillos de madera, etc.) debern ser depositados en un contenedor especial
para ser incinerados
1. Con una lanceta estril picar la yema del dedo anular y depositar una gota de
sangre en un vidrio de reloj perfectamente limpio y etiquetado que contenga 2
mL de la solucin de NaCl 0.15 M, dejar reposar durante un minuto.
2. Con ayuda de una pipeta Pasteur colocar una gota de esta suspensin celular
en un portaobjetos, despus colocar un cubreobjetos y observar al
microscopio. Enfocar con el objetivo de 10X, pasar al objetivo de 40X, y
finalmente al de 100X para hacer observaciones.
3. Repetir el mismo procedimiento con la solucin de NaCl 0.075 M, y con la de
0.3 M.
4. Obtener fotografas y/o realizar las representaciones en cada aumento.
Clulas vegetal.
1. En un vidrio de reloj que contenga 2 mL de la solucin de cloruro de sodio
0.15 M, depositar una hoja de elodea y dejarla reposar de 2 a 3 min.
Posteriormente colocar la hoja en un portaobjetos, poner un cubreobjetos y
observar al microscopio.
2. Repetir el mismo procedimiento con la solucin de NaCl 0.075 M, y con la de
0.3 M.
3. Obtener fotografas y/o realizar las representaciones en cada aumento
B. Membrana artificial (estudio macroscpico)
1. Lavar el condn con agua de la llave y luego, con agua destilada.
2. Agregar 25 mL de la solucin de almidn con hidrxido de amonio dentro del
condn y cerrar con un hilo (Realizar en campana de extraccin).
3. Colocar el condn dentro de un vaso de precipitado de 500 mL que

contenga 2 /3 de agua destilada y 5 gotas de fenolftalena durante 30 minutos.
Observar si cambia el color del agua.
4

4. Abrir el condn y agregar 4 gotas de la solucin de lugol, observar si cambia el

color de la solucin de almidn.
5. Agregar 4 gotas de lugol al agua del vaso de precipitado y comparar con la
coloracin observada en el punto anterior.
RESULTADOS
1. Esquematizar el comportamiento de las clulas animal y vegetal frente a las
diferentes concentraciones de NaCl.
2. De acuerdo a las observaciones, elaborar una tabla donde se indique el tipo
celular, la concentracin salina a la que estuvo expuesta y las caractersticas
que se observan en ellas.
3. Indicar los cambios observados en el agua del vaso de precipitado y en la
solucin dentro del condn.
ANLISIS DE RESULTADOS
Nota: Con base en sus resultados y tomando como gua los siguientes enunciados,
redacte la discusin de la prctica:
Decir cul fue el propsito al colocar las clulas en una solucin

isotnica
Mencionar las diferencias observadas entre las clulas animal y vegetal
en presencia de la solucin hipotnica e hipertnica y explicar el
mecanismo implicado en los cambios morfolgicos.
Sealar cules substancias utilizadas (almidn, hidrxido de amonio y
fenolftalena) atravesaron la membrana de ltex del condn y cmo se
demostr que ocurri.
CONCLUSIN
CUESTIONARIO PREVIO
1. Mencionar, qu es una solucin isotnica, hipotnica e hipertnica y qu
efecto tienen en las clulas?
2. Mencionar, qu es y cul es la funcin de los siguientes componentes?
a. Almidn.
b. Hidrxido de amonio.
c. Lugol.
d. Fenolftalena.
5

BIBLIOGRAFA
1. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2008. Biologa
Molecular de la clula. 5. ed. Omega. Espaa.
2. Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J y Bertoni P. 2009. The world of the cell.
Seventh ed. The Benjamin/Cummings. USA.
3. Karp G. 2009. Biologa Celular y Molecular: conceptos y experimentos.
McGraw Hill. Mxico.
4. Lodish HF, Berk A, Matsudaira P, Kaiser M, Krieger M, Scott MP, Zipursky SI
y Carmel JE. 2005. Biologa Celular y Molecular. 5a ed. Mdica
Panamericana, Mxico.

Prctica 2
OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE COLGENA
INTRODUCCIN
La colgena es la protena ms abundante del organismo y el componente bsico de
la piel, huesos, ligamentos, tendones y cartlagos. Su principal funcin es
proporcionar integridad estructural, como parte de la matriz extracelular.
Se conocen aproximadamente 28 tipos de colgenas que se diferencian en su
secuencia de aminocidos y sus diferentes funciones. De acuerdo a la forma en que
se agregan, se han clasificado como fibrilares I, II, III, V y XI y no fibrilares VI, VII,
VIII, y X.
Como todas las protenas, la colgena est constituida por cadenas de residuos de
aminocidos, y posee dos caractersticas que la hacen nica:
a) Su composicin presenta un alto contenido de los aminocidos glicina y prolina,
siendo la nica protena que puede tener las formas hidroxiladas de la prolina y la
lisina.
b) La colgena es una protena fibrilar, con una estructura muy larga y compleja.
c) Se forma a partir de dos cadenas 1 y una 2, que se enrollan y se enlazan
formando la llamada triple hlice de tropocolgeno.
Los tropocolgenos se enlazan por sus extremos, formando largas hileras que, a su
vez, se alinean paralelamente unindose para formar las microfibrillas, que son
estabilizadas por puentes de hidrgeno, entre las hidroxiprolinas.
Estas microfibrillas tambin se alinean y se unen en paralelo para formar las fibrillas,
las cuales dan originan a las fibras. Son estas fibras de colgena las que aportan su
gran resistencia y elasticidad a los tejidos.
Cuando la colgena se somete a un tratamiento con cidos, estas estructuras en
paralelo se van desmontando hasta que las triples hlices se desenrollan y se
rompen parcialmente, dando lugar al hidrolizado de colgena. Por lo tanto, la
extraccin de la colgena se puede realizar a partir de cidos dbiles como el cido
actico diluido.
Adems, por el alto contenido de prolina e hidroxiprolina que presenta la colgena en
su estructura permite poder identificarla mediante una reaccin con ninhidrina. Todos
los aminocidos que poseen un grupo amino libre forman un producto color azul o
prpura cuando son calentados en presencia de ninhidrina y en el caso de la prolina,
que estructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino, la
coloracin final es amarilla.
7

Representacin esquemtica de la triple hlice da la colgena.
OBJETIVO GENERAL
Extraer la colgena de cresta de pollo e identificarla por un mtodo

colorimtrico
OBJETIVOS PARTICULARES
Extraer la colgena a partir de crestas de pollo.
Identificar a la colgena mediante un mtodo colorimtrico.
HIPTESIS
Generada por el estudiante.
MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo
1
1
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
4
Embudo.
Probeta de 50 mL.
Vasos de precipitados de 100 mL.
Vaso de precipitados de 250 mL.
Parrilla de calentamiento.
Centrfuga.
Bistur.
Pinza.
Tubos de centrfuga de 50 mL.
Piceta con agua destilada.
Agitador magntico.
Esptula.
Tubos de ensayo de vidrio de16 x 150 mm.
8
2
1
1
1
1

Pipetas graduadas de 5 mL.

Pipeta graduada de 10 mL.
Gradilla.
Balanza de dos platos.
Material proporcionado por los alumnos

10 g de crestas de pollo.
4 Bolsas de gasa.
1 Papel aluminio.
Reactivos
Etanol (CH3-CH2-OH).
Hidrxido de sodio (NaOH).
cido actico (CH3-COOH).
Cloruro de sodio (NaCl).
Prolina.
cido glutmico.
Soluciones
Etanol al 20%. (250 mL).

NaOH 2 M. (250 mL).
cido actico 0.5 M. (250 mL).
NaCl 5 M. (25 mL).
Solucin de prolina al 0.5%, pH 6.0. (10 mL).
Solucin de cido glutmico al 0.5%, pH 6.0. (10 mL).
Reactivo de ninhidrina al 2% en acetona. (20 mL).
Albmina 10 mg/ml (10 mL).
A. Extraccin de colgena
1. Lavar las crestas de pollo con agua destilada y secarlas con gasa.
2. Pesar 10 g de crestas de pollo en un papel aluminio y tomarlas con la pinza
para fragmentarlas en pequeos trozos con el bistur.
3. Colocarlas en un vaso de precipitados de 100 mL y agregarle 25 mL de etanol
al 20%, poner en agitacin constante por 10 min a temperatura ambiente.
9

4. Decantar y desechar el etanol con la ayuda de la esptula.

5. Adicionar a las crestas 25 mL de la solucin de NaOH 2M y dejar en agitacin
por 10 min a temperatura ambiente.
6. Decantar y desechar la solucin de NaOH con la ayuda de la esptula.
7. Aadir a las crestas 25 mL de cido actico 0.5 M y dejar en agitacin por 10
min a temperatura ambiente.
8. Filtrar a travs de dos capas de gasa con ayuda del embudo de vidrio,
recuperando el filtrado en un vaso de precipitados de 100 mL.
9. Adicionar al filtrado 2 mL de la solucin de NaCl 5M lentamente y transferirlo a
un tubo de centrfuga.
10. Centrfugar a 3,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente y
desechar el sobrenadante.
11. Disolver el botn en 10 mL de agua destilada.
12. Tomar una alcuota de colgena para realizar la identificacin.
B. Identificacin de la colgena
1. Disponer de una serie de tubos de ensayo y agregar los reactivos como se
indica en la siguiente tabla.
Reactivos
1
Prolina (mL)
1.0
cido glutmico (mL)
1.0
Albmina (mL)
1.0
1.0
Muestra de colgena (mL)

2.
3.
4.
Tubo No.
Adicionar 0.5 mL del reactivo de ninhidrina a cada tubo y taparlo con papel
aluminio
Incubar todos los tubos en bao de agua hirviendo durante 2 minutos.
Dejar enfriar y observar que color se produjo en cada uno de los ensayos.
RESULTADOS
1.
2.
3.
Hacer una tabla de referencia de colores para cada una de las muestras.
Indicar si su muestra contiene colgena.
Comparar el color obtenido en la muestra de colgena con la de los
aminocidos y la albmina.
10

Nota: Recordar que los puntos que se dan a continuacin son una base para realizar
el anlisis.
Con base a las observaciones explicar a qu se debe el color obtenido
en la muestra de colgena y de la albmina.
Indicar qu tipo de molcula es la ninhidrina y por qu se puede utilizar
para identificar a la colgena.
CONCLUSIN
CUESTIONARIO PREVIO
1.
2.
3.
4.
Mencionar los elementos que constituyen a la matriz extracelular.

Investigar el papel fisiolgico de la colgena.
Explicar cul es la funcin del cido actico en la tcnica.
Describir la reaccin qumica entre la ninhidrina con el cido glutmico y
con la prolina.
BIBLIOGRAFA
Molecular de la clula. 5 ed. Omega. Espaa.
2. Brodsky B, Persikov AV. 2005. Molecular structure of the collagen triple helix. Adv
Protein Chem. 70:30139.
3. Karp G. 2009. Biologa Celular y Molecular. 5 ed. McGraw-Hill/Interamericana de
Mxico.
4. Lodish HF, Berk A, Matsudaira P, Kaiser M, Krieger M, Scott MP, Zipursky SI y
Darnell JE. 2005. Biologa Celular y Molecular. 5a ed. Mdica Panamericana.
Espaa.
5. Mathews C, Van Holde KE, Ahern KG. 2003. Bioqumica. 3 ed. Addison Wesley.
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6. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2004. Bioqumica de Harper,
16 ed. Manual Moderno. Mxico.
7. Shoulders MD, Raines RT. 2009. Collagen structure and stability. Annu Rev
Biochem. 78:929-58.
8. Voet D. 2007. Fundamentos de Bioqumica. La vida a nivel molecular. 2 a ed.
Mdica Panamericana. Espaa.
11

Prctica 3
GLUCOCLIX
INTRODUCCIN
El glucoclix, se refiere a la zona que rodea a la clula que es rica en carbohidratos
(oligosacridos), llegando a representar de 2-10% del peso de la membrana. Los
oligosacridos se encuentran unidos a protenas o lpidos de la membrana,
formando glucoprotenas con numerosas cadenas laterales de oligosacridos, y
glucolpidos, con tan slo una.
La especificidad antignica de una clula radica en los pequeos oligosacridos que
pueden estar ligados a una larga cadena peptdica o a una esfingomielina, como la
ceramida.
Las clulas sanguneas contienen un gran nmero de determinantes antignicos,
debido a los cuales es posible la clasificacin del grupo sanguneo. Las dos
clasificaciones ms importantes para describir grupos sanguneos en humanos son
los antgenos (el sistema ABO) y el factor Rh. Por lo tanto, los sistemas antignicos
considerados ms importantes son el sistema ABO y el sistema Rh (aunque en la actualidad
se han determinado hasta 32 sistemas antignicos).
Las personas con sangre del tipo A tienen glbulos rojos que expresan antgenos de
tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antgenos B en el plasma de su
sangre. Las personas con sangre del tipo B tienen glbulos rojos con antgenos de
tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antgenos A en el plasma de su
sangre. Los individuos con sangre del tipo O 0 (cero) no expresan ninguno de los
dos antgenos (A o B) en la superficie de sus glbulos rojos pero tienen anticuerpos
contra ambos tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos
antgenos en su superficie y no producen ninguno de los dos anticuerpos.
La determinacin del grupo sanguneo se basa en una reaccin inmunolgica.
Cuando una muestra de sangre con eritrocitos que contienen en la membrana
antgenos A, y/o B, reacciona con suero o una solucin que contiene anticuerpos B
y/o A, se aglutina, el tipo sanguneo ser A, B AB. O bien, si la reaccin
inmunolgica no ocurre no habr aglutinacin, lo cual corresponder al tipo
sanguneo O.
12

Representacin esquemtica de los

antgenos de superficie en los eritrocitos.
OBJETIVO GENERAL
Establecer la participacin del glucoclix en la determinacin del grupo

sanguneo.
Observar la reaccin inmunolgica debida a los carbohidratos de los

antgenos con anticuerpos especficos a travs de la aglutinacin.
Determinar el tipo de sanguneo de cada alumno, observando si hay o no
aglutinacin de sus eritrocitos.
Establecer un porcentaje de la frecuencia para cada grupo sanguneo,
tomando como muestra el total de alumnos.
HIPTESIS
MATERIAL Y EQUIPO
1 Microscopio ptico de campo claro.
13

1
1
1
1
Caja de portaobjetos.
Caja de cubreobjetos.
Lanceta estril por alumno.
Piceta con alcohol.
Torundas de algodn.
1 Micropipeta de 20-200 L.
Puntas para micropipeta.
Material proporcionado por los alumnos.
1 Caja de palillos de madera.
Reactivos
Etanol.
Antisuero anti-A.
Antisuero anti-B.
Antisuero anti-D.
Soluciones
Etanol al 70 %
Nota: La obtencin de la muestra biolgica (sangre) deber realizarse bajo las
condiciones de higiene y seguridad que implican el manejar material biolgico:
trabajar en un rea limpia y especfica, no tener contacto directo con la muestra
biolgica, todos los materiales de desecho que contengan sangre (algodn, lanceta,
papel, palillos de madera, etc.) debern ser depositados en un contenedor especial
para ser incinerados.
1.
2.
3.
Limpiar el extremo del dedo anular con una torunda de algodn impregnada
de alcohol.
Oprimir la punta del dedo anular, para que la presin permita que se ponga
morado y pueda obtenerse ms rpido la muestra de sangre.
Con la lanceta estril, picar la yema del dedo y colocar 3 pequeas gotas de
sangre en puntos equidistantes en el portaobjetos.
14

4.
A cada una de las gotas de sangre y por separado, agregar 25-50 L de

antisuero A, antisuero B y antisuero D, evitar que se mezclen las gotas de
sangre entre s. Tener cuidado de usar una punta limpia para cada solucin.
5.
Con un palillo diferente para cada muestra, mezclar y homogenizar la sangre y

el suero.
6.
Esperar durante dos minutos y realizar las observaciones (observar si hay o

no aglutinacin).
Realizar observaciones en el microscopio ptico, con los objetivos de 10X,
40X y 100X.
Capturar las imgenes y realizar la interpretacin de la interaccin de los
eritrocitos con cada uno de los anticuerpos.
7.
8.
RESULTADOS
1.
2.
3.
4.
Indicar observaciones a nivel macroscpico y microscpico. Realizar imgenes y si

es posible tomar fotos de los resultados observados.
Elaborar una tabla, indicando el nombre del integrante del equipo y el tipo
sanguneo que present.
Indicar en una tabla cuantos alumnos del grupo de EFC-II, presentaron el tipo
sanguneo A, B, AB, O y RH+.
Elaborar una grfica (histograma) donde se indique el porcentaje de alumnos que
presentaron cada uno de los grupos sanguneos.
15

el anlisis.
Con base en sus observaciones, explicar qu es la aglutinacin y

qu indica?
Qu son los antisueros A, B y D, cul es su reaccin ante las clulas
sanguneas y que indica la aglutinacin?
Describir qu tipo sanguneo es el que se encuentra en mayor
proporcin e investigar a qu se debe este fenmeno.
CONCLUSIN
CUESTIONARIO PREVIO
1.
2.
3.
Definir los siguientes trminos:

Glicoprotena.
Receptor.
Ligando.
Antgeno.
Anticuerpo.
Lectina.
Qu tipo de monosacridos se encuentran conformando los oligosacridos de
las glicoprotenas del glucoclix?
Cules son los antgenos especficos que definen el tipo sanguneo?
BIBLIOGRAFA
Molecular de la clula. 5ed. Omega. Espaa.
2. Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J y Bertoni GP. 2009. The world of the cell.
Seventh ed. The Benjamin/Cummings. USA.
3. Cotorruelo CM, Biondi CS, Garca Borrs S, Racca AL. 2002. Clinical aspects
of Rh genotyping. Clin Lab. 48; (5-6:271-81.
4. Fudenberg HH, Stites DP, Caldwell JL, Wells JV. 1980. Manual de Inmunologa
clnica. 2 ed. El Manual Moderno. Mxico.
16

5. Gasimli L, Linhardt RJ, Dordick JS. 2012. Proteoglycans in stem cells.

Biotechnol Appl Biochem. 59; 2:65-76.
6. Karp G. 2009. Biologa Celular y Molecular. 5 ed. McGraw-Hill/Interamericana
de Mxico.
7. Lodish HF, Berk A, Matsudaira P, Kaiser M, Krieger M, Scott, MP, Zipursky SI
y Darnell JE. 2005. Biologa Celular y Molecular. 5a ed. Mdica
Panamericana. Espaa.
8. Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG Bioqumica. 2003. 3 ed. Addison
Wesley. Mxico.
9. Voet D. Fundamentos de Bioqumica. La vida a nivel molecular. 2007. 2 a ed.
17

Prctica 4
PARED CELULAR
INTRODUCCIN
Las clulas vegetales estn rodeadas por una pared relativamente delgada, pero
mecnicamente fuerte de la que carecen las clulas animales. Sin embargo, las
paredes celulares no son exclusivas de las plantas, tambin se encuentra en las
clulas procariotas de Eubacteria y Archaebacteria y las del reino fungi, las cuales
tambin estn rodeadas por pared celular, con una composicin qumica diferente.
En clulas vivas las paredes tienen un papel importante en actividades como
absorcin, transpiracin, translocacin, secrecin y reacciones de reconocimiento.
Pared
Celular
Membrana
citoplasmtica
Clula
Clulavegetal
vegetal
La pared celular en vegetales est constituida por: un componente cristalino o

porcin fibrosa (esqueleto) y un componente amorfo o matriz no fibrosa, altamente
hidratado, semejante a un gel. Esta estructura se parece a la de la fibra de vidrio y de
otros materiales compuestos, en los cuales las fibras cristalinas rgidas se usan para
reforzar la matriz y hacerla ms flexible.
Componente cristalino. Est representado por las cadenas celulsicas que pueden
alcanzar 4 m de longitud. Estas son cadenas lineales de D-glucosa unidas por
enlaces covalentes 1-4 , que debido a la alterna configuracin espacial de las
cadenas glucosdicas, la unidad repetitiva de la celulosa es la celobiosa, un
disacrido 1-4 -D glucosa, dispuestas de modo ordenado mediante enlaces puentes
de hidrgeno, formando una estructura cristalina (que contiene algunas regiones no
cristalinas).
Por otra parte, las clulas meristemticas presentan las caractersticas citolgicas de
las clulas indiferenciadas y son las responsables del crecimiento permanente de las
plantas y estn presentes durante toda la vida de stas. Las clulas meristemticas
muestran las caractersticas citolgicas de las clulas indiferenciadas, son pequeas,
isodiamtricas y tienen una pared celular primaria delgada.
18

OBJETIVO GENERAL
Identificar la pared celular que conforma a las clulas vegetales tanto en

epidermis de cebolla como en tejido meristemtico.
Reafirmar los conocimientos sobre el uso del microscopio.

Observar la pared celular en diferentes tipos de clulas.
HIPTESIS
Generada por el alumno.
MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo
1
1
1
1
1
Microscopio.
Vidrio de reloj.
Pinza de diseccin.
Proporcionado por el alumno

1 Hoja de afeitar.
1 Cebolla.
Radcula de embriones (frijol, haba)
Reactivos
Azul de metileno
1.
Mediante una bistur y unas pinzas de diseccin, aislar una parte de la

epidermis correspondiente a la zona cncava de la tercera o cuarta cubierta
de la cebolla y colocarla extendida en un portaobjetos. A continuacin se
19

aaden dos gotas de azul de metileno y se observa al microscopio ptico con

los objetivos de 10X, 40X y 100X.
2.
Posteriormente a la radcula de los embriones se les hace un corte

transversal, lo ms delgado posible. Depositar los cortes en el portaobjeto
(seccin a) y teir con azul de metileno (seccin b) y a continuacin observar
al microscopio con los objetivos de 10X,40X y 100X.
a)
b)
RESULTADOS
1.
Capturar las imgenes del microscopio y/o esquematizar la pared celular tanto
de la epidermis de cebolla como de los tejidos meristemticos.
el anlisis.
20

Mencionar la relacin que existe entre la pared celular observada y la

clula.
Mencionar la importancia de la pared celular en los tejidos
meristemticos.
CONCLUSIN
CUESTIONARIO PREVIO
1.
2.
3.
4.
Mencionar las principales funciones de la pared celular.

Indicar de que est compuesta la pared celular.
Qu otros organismos tienen pared celular? Mencionar sus caractersticas
particulares.
De donde proviene la pared celular de la radcula?
BIBLIOGRAFA
1. Azcon-Bieto J. 2008. Fundamentos de fisiologa vegetal. 2 ed. Mcgraw-Hill /
Interamericana de Espaa, S.A. Espaa.
2. Karp G. 2009. Biologa Celular y Molecular: Conceptos y experimentos.
McGraw Hill. Mxico.
3. Escaso F, Martinez JL, Planello R. 2011. Fundamentos bsicos de fisiologa
vegetal y animal. Prentice-Hall. Mxico.
y Darnell JE. 2005. Biologa Celular y Molecular. 5a ed. Mdica Panamericana.
Mxico.
21

Prctica 5
RESPIRACIN MITOCONDRIAL
INTRODUCCIN
La energa en forma de ATP es utilizada por la mayora de los seres vivos para
realizar las funciones metablicas. Esta energa la obtienen a partir del catabolismo
de los carbohidratos en donde intervienen mltiples reacciones de xido-reduccin
que estn enfocadas a oxidar a los carbonos de la glucosa y convertirlos en CO 2,
como se observa en la siguiente reaccin:
C6H12O6 + O2
6 CO2 + 6H2O
+ ATP
La oxidacin de la glucosa se divide en tres grupos de reacciones principales
denominadas: gluclisis, ciclo de Krebs y fosforilacin oxidativa.
La gluclisis es un proceso que se lleva a cabo en el citosol y es cuando a partir de
una molcula de glucosa (6C) se producen dos molculas de piruvato (3C). Este
piruvato es transportado a la matriz mitocondrial en forma de acetil coenzima A para
ingresar al ciclo de Krebs en donde hay liberacin de dos molculas de CO 2 por cada
piruvato y se obtiene poder reductor en forma de NADH+H y FADH 2, que son
sustratos que se requieren para la fosforilacin oxidativa, que se lleva a cabo en la
membrana interna mitocondrial.
La fosforilacin oxidativa es un proceso que se realiza en dos etapas bsicamente.
En la primera, la cadena respiratoria consta de cuatro complejos multiprotenicos
embebidos en la membrana interna de la mitocondria los cuales contienen hierro o
azufre. Estos complejos son los encargados por medio de reacciones de xidoreduccin de transferir electrones desde el NADH+H o el FADH2 hasta el oxgeno
para formar agua. Por otro lado se lleva a cabo la translocacin de protones desde la
matriz mitocondrial hacia el espacio intramembranal. El flujo de protones genera un
gradiente electroqumico que se denomina fuerza protn-motriz que es un tipo de
energa acumulada por la diferencia de cargas.
La segunda etapa est confinada a la fosforilacin oxidativa, la energa generada por
el gradiente electroqumico de protones es utilizada por la enzima ATP-sintasa para
la generacin del ATP y su liberacin a la matriz mitocondrial. Posteriormente hay
sistemas de lanzaderas que permiten el transporte de esta energa al citosol para ser
utilizado en el metabolismo celular y al mismo tiempo introducen ms ADP hacia la
matriz mitocondrial para sintetizar nuevo ATP (Figura 1).
Existen compuestos exgenos que intervienen directamente en la cadena oxidativa,
los llamados inhibidores son molculas que se unen en una subunidad especfica o
22

en un grupo prosttico y compiten con los donadores o aceptores de electrones

impidiendo la llegada de electrones al oxgeno. Mientras que los agentes
desacoplantes son compuestos que abaten la fuerza protn-motriz, ya que
introducen protones hacia la matriz mitocondrial y bloquean la sntesis de ATP.
Figura.1. Representacin esquemtica de la cadena respiratoria y de los sitios

donde actan los inhibidores y desacoplantes.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el proceso de la respiracin mitocondrial en condiciones normales y

en presencia de algunos agentes que la alteran.
Evaluar la importancia de la glucosa sobre la respiracin mitocondrial de la

levadura.
Observar el efecto de los inhibidores sobre la respiracin mitocondrial de la
levadura.
Valorar el efecto causado por los desacoplantes sobre la respiracin
mitocondrial de la levadura.
HIPTESIS
23

MATERIAL Y EQUIPO
Material por grupo (se usar un da antes de la prctica)
1
1
1
1
1
Paquete de levadura en polvo (5 g).

Matraz Erlenmeyer o 1 vaso de precipitados de 1 L.
Agitador magntico o mosca.
Parrilla de agitacin.
Balanza granataria.
Material por grupo (Se usar el da de la prctica)

1 Balanza de dos platos.
2 Vasos de precipitados.
1 Agitador de vidrio.
4 Micropipetas de 10-100 L con puntas de plstico.
4 Micropipetas de 100-1000 L con puntas de plstico.
1 Balanza granataria.
1 Centrfuga clnica.
2 Vasos de precipitados de 50 mL.
2 Pipetas Pasteur con bulbo.
1 Probeta de 250 mL.
4 Tubos de 50 mL para centrfuga.
1 Gradilla.
13 Tubos de ensayo o tubos de polipropileno de 15 mL.
1 Espectrofotmetro.
3 Celdas para espectrofotmetro.
1 Vaso de precipitados de 600 mL.
1 Piceta con agua destilada.
1 Pipeta graduada de 1 mL.
1 Palangana con hielo.
1 Termmetro.
1 Agitador Vrtex.
1 Esptula.
24

Material proporcionado por el alumno

1 Rollo de papel higinico.
1 Papel aluminio (indispensable).
Reactivos
cido 2-[N-morfolino] etanosulfnico (MES).

Glucosa.
Metanol.
Cianuro de sodio (NaCN).
Antimicina A.
Rotenona.
Bromuro de 1-[4,5-dimetiltetrazol-2-il]-3,5-difeniltetrazolio (MTT).
m-clorofenilhidrazona carbonil cianuro (CCCP) o 2,4 dinitrofenol (DFN).
Trietanolamina (TEA). para ajustar el pH del amortiguador (MES).
Hidrxido de sodio (NaOH)
Soluciones
TEA al 50% o
NaOH 2N (50 mL).
MES 0.1 M pH 6.0. Se ajusta con TEA o con NaOH.
Glucosa 1M (20 mL).
*NaCN 40 mM KCN 40 mM (1 mL).
*Antimicina A 1 mM (1 mL).
*MTT, 4 mg/ml (60 mL).
*CCCP 1 mM DNF 1 mM (1 mL)
*Rotenona 2 mM (1 mL).
*Nota: Se deben manejar bajo las medidas de seguridad adecuadas.
A. Ayuno de las levaduras (por grupo)
1.
Este procedimiento se llevar a cabo 24 horas antes de realizar la prctica.
25

2.
En el matraz Erlenmeyer de 1L, agregar 750 mL de agua destilada y un

agitador magntico.
3. Agregar 5 g de levadura al matraz con el agua destilada.
4. Poner un tapn con una gasa y dejarlo 24 horas a temperatura ambiente.
Nota: es muy importante verificar que la parrilla slo est agitando y no calentando.
B. Preparacin de las levaduras (por equipo)
1.
2.
3.
4.
5.
Agitar homogneamente la solucin del matraz y tomar 100 mL de la

suspensin de levadura y Centrfugarlos a 2,500 rpm durante 5 min a
temperatura ambiente.
Decantar el sobrenadante y recuperar el botn o pelet de las levaduras
Pesar 3.25 g del pelet de las levaduras obtenido de la Centrfugacin.
Resuspender el pelet perfectamente en 3.25 mL de agua destilada.
Tomar 250 L del homogenado de levaduras (5 gotas) y colocarlo en cada
uno de los 13 tubos de ensayo.
C. Ensayo de respiracin mitocondrial en las levaduras. (Por equipo)
1.
La preparacin de los tubos con las levaduras ser por duplicado (12 tubos)
excepto el blanco segn la siguiente tabla:
Se considera que una gota es aproximadamente 50 L de solucin.
Agua (mL)
Blanco
Tubo 1
Levadura +
Agua
Tubo 2
Levadura +
Glucosa
Tubo 3
Levadura +
Glucosa+
NaCN
Tubo 4
Levadura
+Glucosa+
Antimicina
A
4.45
3.95
3.7
3.65
3.65
3.65
3.65
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
MES 0.1M pH
6.0 (mL)
Glucosa 1M
(mL)
NaCN 40 mM
Tubo 5
Tubo 6
Levadura + Levadura +
Glucosa+
Glucosa +
Rotenona Desacoplante
1 GOTA
Antimicina A
1mM
1 GOTA
Rotenona 2 mM
1 GOTA
CCCP 1mM
MTT 4 mg/mL
(mL)
1 GOTA
0.5
0.5
0.5
0.5
26
0.5
0.5
0.5
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Agitar todos los tubos usando un agitador (agitador Vrtex).

Incubar los tubos a 30 C por 15 min en obscuridad (cubrir los tubos con papel
aluminio).
Pasar los tubos al hielo durante 5 min y colocarlos en una gradilla.
Agitar en el Vrtex para resuspender las levaduras antes de cada lectura.
Transferir a una celda espectrofotomtrica y leer los tubos empezando por el
blanco y ajustar a cero, en un espectrofotmetro a una longitud de onda de
570 nm (se sugiere prender el espectrofotmetro 15 min antes de empezar a
leer).
Anotar las lecturas de la densidad ptica (D.O.) obtenida de los 12 tubos.
TUBO
1
D.O.
TUBO
1
D.O.
RESULTADOS
Anotar los datos obtenidos en una tabla y elaborar la grfica, indicando un ttulo,
variables y unidades que se emplean.
el anlisis.
Analizar la densidad ptica obtenida con glucosa como sustrato de la

cadena respiratoria y comparar con la lectura de las levaduras a las que
no se les agreg sustrato.
Analizar los datos obtenidos con los diferentes inhibidores que se
utilizaron e indicar las diferencias con las levaduras a las que se les
agreg solo glucosa.
Analizar los datos obtenidos con el desacoplante que se utiliz e indicar
la diferencia con las levaduras a las que se les agreg solo glucosa.
27

CONCLUSIN
CUESTIONARIO PREVIO
1.
2.
3.
4.
Explicar qu es un sustrato de la cadena respiratoria? y mencionar algunos

ejemplos de stos.
Investigar cul es el efecto de la rotenona y la antimicina A sobre la cadena
respiratoria? e indique a qu nivel acta cada una.
Investigar cul es el efecto del CCCP y el DNF sobre la cadena respiratoria?
Indicar a qu nivel actan.
Cul es la diferencia entre el efecto causado por un agente desacoplante y el
de un inhibidor?
BIBLIOGRAFA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Knigsberg M. 1992. Bioenergtica de la cadena respiratoria mitocondrial.

Libros de Texto y Manuales de Prcticas. UAM. Mxico.
Knigsberg M. 1997. Manual de Prcticas de Temas Selectos de Biofsica.
Libros de Texto y Manuales de Prcticas.UAM. Mxico.
Knigsberg M. 2009. Manual de Bioqumica II. Libros de Texto y Manuales de
Prcticas.UAM. Mxico.
Kulawiak B, Gebert JHM, Guiard B, Wiedemann N, Gebert N. 2013. The
mitochondrial protein import machinery has multiple connections to the
respiratory chain. Biochim Biophys Acta. 1827 (5):612626.
Mathews CK., Van Holde KE, Ahern KG. 2003. Bioqumica. 3 ed. Addison
Wesley. Mxico.
Ping- Lu S y Ju-Li S. 2010. Regualtion of yeast Situins by NAD Metabolism
and Calorie Restriction. Biochim Biophys Acta. 1804 (8): 1567-1575.
Snchez NS y Knigsberg M. 2006. Using yeast to easily determine
mitochondrial funcionaly with MTT assay. Biochem. Mol. Biol. Educ. 34:209212.
Voet D. 2007. Fundamentos de Bioqumica. La vida a nivel molecular. 2 a ed.
Wallstrm SV, Florez-Sarasa I, Arajo WL, Escobar MA, Geisler DA, Aidemark
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of
NDA-type
alternative mitochondrial NAD(P)H
dehydrogenases
in
Arabidopsis thaliana modifies growth and metabolism, but not high light
stimulation of mitochondrial electron transport. Plant Cell Physiol. En prensa.
28

Prctica 6
EXTRACCIN DE LOS PIGMENTOS EN TEJIDO VEGETAL Y
SU SEPARACIN CROMATOGRFICA
INTRODUCCIN
La fotosntesis es el proceso ms importante en nuestro planeta ya que a partir de la
energa solar se proveen de hidratos de carbono para la produccin de energa en
las plantas y animales, constituye el principal medio de fijacin de carbono y es
tambin la principal fuente de oxgeno en la atmsfera terrestre.
En la fotosntesis es necesario que se lleve a cabo la captacin de la luz solar y las
molculas que se encargan de atrapar esta energa son los pigmentos de absorcin
de luz. Las partes de estos pigmentos que absorben luz se denominan cromforos
que absorben eficientemente una longitud de onda especfica de la luz visible. En la
figura 1 se muestra algunos de los cromforos ms importantes.
En conjunto los cromforos cubren todo el espectro de luz visible; los fotones de luz
que llegan pueden absorberse por uno u otro de estos cromforos. Los pigmentos
ms abundantes en las plantas superiores son la clorofila a y la clorofila b. El metal
unido a las clorofilas es el Mg2+.
En el caso de los vegetales, las clorofilas se encuentran en los cloroplastos formando
parte de los fotosistemas I y II. Los carotenos y las xantofilas, son pigmentos
complementarios que contribuyen con la absorcin de luz de diferente longitud de
onda a la de las clorofilas.
Figura 1.Representacin esquemtica de clorofila y -caroteno.
29

OBJETIVO GENERAL
Obtener los diferentes pigmentos presentes en los vegetales verdes.
Extraer los pigmentos de diferentes vegetales (hojas verdes como espinaca,

perejil).
Separar los cromforos obtenidos de las hojas verdes por cromatografa en
papel.
HIPTESIS
MATERIAL Y EQUIPO
Material por grupo
1 Balanza de dos platos.
1 Balanza granataria.
1
1
1
1
3
2
2
2
2
1
1
1
Mortero con pistilo.

Embudo de vidrio.
Embudo de separacin.
Soporte universal con anillo.
Pipetas Pasteur con bulbo.
Parrilla elctrica.
Palangana con hielo.
Capilares adelgazados.
Papel filtro Whatman #1 para cromatografa.
30


20 g de tejido vegetal limpio y seco (hojas verdes de espinaca, perejil,
cilantro). Se sugiere que cada equipo trabaje con una muestra diferente.
4 Gasas de algodn.
1 Frasco con tapa (por equipo)
1 Par de guantes desechables (por equipo)
Reactivos
Etanol.
ter dietlico.
ter de petrleo.
Hexano.
Sulfato de sodio.
Metanol.
Soluciones
Disolucin de ter dietlico-metanol-hexano (45:15:5) (200 mL).

Etanol al 70%.
A. Extraccin de los pigmentos
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Colocar el mortero en un bao de hielo, la extraccin de los pigmentos se lleva

a cabo en frio.
Pesar 10 g del tejido vegetal sin los peciolos, ni las venas grandes.
Trocear las hojas y macerar en 10 mL de etanol hasta que se forme una masa
espesa.
Adicionar 5 mL de etanol y 10 mL de ter de petrleo.
Filtrar el macerado a travs de las 2 gasas colocadas en el embudo de vidrio,
recibiendo el filtrado en un embudo de separacin.
Adicionar al embudo de separacin 15 mL de disolucin ter dietlico-metanolhexano y 25 mL de agua destilada, lenta y suavemente resbalando por las
paredes del embudo.
31
7.
8.
9.

Agitar suavemente y dejar que se separen las dos fases. Desechar la fase
acuosa y colectar la fase orgnica que se encuentra en la parte superior, en
un vaso de precipitados de 50 mL.
Adicionar unos cristales de sulfato de sodio para eliminar los restos de agua.
Calentar levemente sobre una parrilla elctrica para concentrar el extracto a
un volumen de 2 mL.
B. Separacin de los pigmentos obtenidos por cromatografa en papel.
1.
2.
3.
4.
Colocar 20 mL de etanol en un frasco con tapa.

Ponerse guantes y cortar un fragmento de 6 x 8 cm de una hoja de papel
Whatman # 1, el cual se debe colocar en una cartulina nueva. Marcar el
sentido en que correr la muestra, que se indica en la caja del papel
Whatman.
Trazar con lpiz una lnea tenue a 1.5 cm, con un punto marcar divisiones
cada 1 cm. Se debe tener en cuanta, el sentido en que correr la muestra.
Aplicar la muestra obtenida por usted, con un capilar que tenga la punta
adelgazada. Poner una microgota entre los puntos marcados sobre el papel
Whatman, dejar secar y repetir 5 veces la aplicacin en el mismo punto,
dejando secar en cada ocasin. Realizar el mismo procedimiento para otras
dos o tres muestras obtenidas por otros equipos.
32

5.
Colocar el papel Whatman de forma vertical dentro del frasco con los 20 mL
de etanol al 70 %, sin que las muestras toquen este eluyente y tapar el frasco.
6.
Dejar correr la cromatografa durante 1.5 h. Sacar el papel del frasco y dejar
secar por 10 min.
Marcar con un lpiz los lmites de las manchas y tomar la distancia desde el
punto de aplicacin. A partir de estos datos y la distancia a la que lleg el
eluyente determinar el Rf de cada una de las muestras que se aplicaron al
papel, empleando la frmula:
7.
Rf= Distancia recorrida por cada muestra (cm).

Distancia recorrida por el eluyente (cm).
RESULTADOS
1.
Capturar la imagen y/o realizar un diagrama similar a lo que se observa en el

cromatograma.
33
2.

Determinar el Rf de cada uno de los pigmentos obtenidos y hacer una tabla

comparativa de los Rf de cada una de las muestras obtenidas en la
cromatografa.
el anlisis.
Explicar el patrn de separacin de los componentes de la mezcla de

cada una de las muestras analizadas.
Se encontr diferencia en el corrimiento de los pigmentos obtenidos
en los vegetales? A qu se debe?
Cuntos pigmentos se obtuvieron en cada extracto y cul es su
afinidad con el eluyente?
Comparar la cromatografa de los pigmentos con lo que se tiene
reportado en la literatura.
CONCLUSIN
CUESTIONARIO PREVIO
1.
2.
3.
4.
5.
Qu es la fotosntesis?
Qu es un pigmento fotosinttico, cuntos tipos hay, y a qu longitud de
onda presentan un mximo de absorcin de la luz solar?
Qu es la clorofila y cul es su participacin en el proceso de la fotosntesis?
Cul es el fundamento de la cromatografa en papel?
Cuntos tipos de cromatografa podran aplicarse en la separacin de los
pigmentos fotosintticos y por qu?
BIBLIOGRAFA
1.
2.
3.
4.
Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J y Bertoni GP. 2009. The world of the cell.
Seventh Ed. The Benjamin/Cummings. USA.
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Utilizing Leaf Disks. The American Biology Teacher, 47(2):96-99.
35

Prctica 7
FOTOSNTESIS: DEMOSTRACIN DE LA TASA DE
FOTOSNTESIS, EMPLEANDO DISCOS DE HOJAS
INTRODUCCIN
La fotosntesis es un proceso por el cual la energa luminosa es convertida en
energa qumica por los organismos auttrofos. En su fase luminosa, este proceso
utiliza la luz para generar ATP y reducir NADP+ a NADPH, que son empleados en la
fase oscura (ciclo de Calvin) para fijar CO2 y producir glucosa. En las plantas, ambas
fases ocurren en el cloroplasto, dentro de las clulas del mesfilo de las hojas verdes
(figura 1).
Figura 1. Corte transversal de una hoja, mostrando los diferentes tejidos que la
componen.
La fotosntesis puede ser resumida en la siguiente reaccin:
CO2 + 6 H2O + LUZ C6H12O6 + 6 O2
La velocidad a la que ocurre la fotosntesis depende directamente de la cantidad
(brillantez) y calidad (longitud de onda) de la luz empleada, as como de otros
parmetros.
Existen diferentes metodologas complejas para estudiar la fotosntesis, sin embargo,
se puede estudiar la tasa de fotosntesis por una simple estimacin de la tasa de
36

produccin de oxgeno en un disco de tejido de hoja. Los discos de hoja flotan

normalmente, pero cuando son infiltrados con una solucin de bicarbonato de sodio,
la densidad relativa del disco aumenta, y ste se hunde Al exponerlos a la luz, la
fotosntesis se lleva a cabo en el mesfilo de la hoja, y el oxgeno producido desplaza
al lquido infiltrado de los espacios intercelulares y la densidad en el disco disminuye,
hacindolo flotar (figura 2). El tiempo requerido para que el disco flote es
inversamente proporcional a la tasa de fotosntesis. En el procedimiento, la fuente de
dixido de carbono es una solucin de bicarbonato de sodio.
Figura 2. Al exponer los discos de hoja a la luz, se produce O2 que llena los espacios
dentro del tejido de la hoja y hace que esta flote.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el proceso de fotosntesis en una planta verde.
Determinar la tasa de fotosntesis en una planta verde.

Demostrar como la tasa de fotosntesis puede ser modificada por luz de
diferentes longitudes de onda.
HIPTESIS
37

MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo
1 Agitador de vidrio.
5 Jeringas de plstico de 20 mL sin aguja.
5 Tapones de goma.
1 Lmpara de mesa con foco.
1 Perforadora de papel o un popote.
Hojas frescas, de preferencia de una planta de hoja ancha
Toallas de papel.
1 Cronmetro o reloj con segundero.
Papel celofn de colores rojo, verde, amarillo y azul.
1 Papel aluminio.
1 Cinta adhesiva (Masking tape).
Reactivos
Bicarbonato de sodio (NaHCO3).

Jabn lquido.
Soluciones (por equipo)
Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 300 mL al 0.1 M o 0.2%.

Solucin de jabn lquido diluido. Una gota en medio litro de agua. (5
mL).
1.
2.
Corte varios discos de la parte verde de una hoja con una perforadora de
papel, o con un popote (figura 3A). Evite la parte de las venas y manjelos con
cuidado ya que se trata de clulas vivas y se pueden daar fcilmente. La
superficie de la hoja debe ser suave y no muy gruesa, y no debe tener
vellosidades. Se obtienen buenos resultados con hojas de espinaca o de
hiedra
Coloque los discos (entre 5 y 10) dentro de una jeringa y coloque con cuidado
el mbolo para no daar los discos (Figura 3B). El nmero de discos
38

depender del volumen de la jeringa. Se recomienda colocar 5 discos para la

jeringa de 20 mL o 10 discos para la de 50 mL.
Figura 3. Cortar pequeos discos de una hoja verde, y posteriormente se introducen

en una jeringa conteniendo una solucin de bicarbonato de sodio.
3.
4.
5.
Llene la jeringa con una solucin de NaHCO3 hasta aproximadamente 3

cuartos de su capacidad. Agregue una gota de jabn lquido diluido a la
solucin de bicarbonato para hacerla ms hidroflica y permitir que penetre
ms fcilmente a la hoja
Retire el aire dentro de la jeringa presionando el mbolo hasta que el lquido
comience a salir de la punta de la jeringa (Figura 4A).
Selle la punta de la jeringa presionndola fuertemente sobre un tapn de
goma o con el dedo. Jale el mbolo de la jeringa mientras la agita, y elimine
cualquier nuevo residuo de aire. El gas se expandir y saldr de los discos de
hoja (Figura 4B).
39
6.
7.
8.
9.
10.

Figura 4. Procedimiento para infiltrar los discos de hoja con la solucin de

bicarbonato.
Repita el paso 5 hasta que no salgan ms burbujas y todos los discos se
hundan hasta el fondo del lquido.
Retire el dedo o el tapn de la punta de la jeringa, y colquela en posicin
vertical, frente a la luz directa de una lmpara de mesa o frente a la luz del sol.
Registre el nmero de discos que flotan al cabo de cada minuto. Agite
suavemente la jeringa para separar los discos que se hayan adherido entre s.
Contine con el registro de los discos que flotan al cabo de cada minuto, hasta
que todos los discos se encuentren flotando.
Indique sus resultados en una grfica de nmero de discos flotando contra el
tiempo.
Repita el experimento empleando varias jeringas, cubiertas cada una de ellas
con papel celofn de color rojo, verde, amarillo o azul, durante la exposicin a
la luz. Realice un experimento con la jeringa cubierta con papel aluminio como
control negativo de la fotosntesis. En este ltimo caso, revise rpidamente la
jeringa al cabo de cada minuto, de modo que la exposicin a la luz sea
mnima.
RESULTADOS
1.
Registrar sus resultados en la siguiente tabla como se indica:
Tabla de datos
Tiempo
(minutos)
0
1
2
3
4
5
6
Luz blanca
Nmero de discos flotantes

Luz roja
Luz verde Luz amarilla
Oscuridad
Nota: Continuar la tabla hasta completar 15 minutos de observacin, o hasta que

todos los discos se encuentren flotando
40
2.

Elaborar una grfica con los resultados obtenidos, colocando el tiempo (eje X)
y el nmero de discos flotando (eje Y). Utilice una lnea de color diferente para
cada experimento (Figura 5).
Figura 5. Grfica con los resultados obtenidos.
Nota: Recordar que los puntos que se dan a continuacin son una base para
realizar el anlisis.
Comparar los datos obtenidos para cada una de las condiciones
experimentales, indicando qu era lo esperado de acuerdo con lo
reportado en la literatura.
CONCLUSIN
CUESTIONARIO PREVIO
1.
2.
3.
4.
5.
Cul es el rango de longitud de onda que absorben cada uno de los

pigmentos que participan en la fotosntesis?
Cmo se produce el oxgeno durante la fase luminosa de la fotosntesis?
Por qu se emplea una solucin de bicarbonato de sodio como fuente de
CO2 para el experimento?
Qu diferencias se esperan entre los experimentos realizados en diferentes
condiciones de iluminacin?
Por qu flotan los discos de hoja despus de ser expuestos a la luz?
41

BIBLIOGRAFIA
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J y Bertoni GP. 2009. The world of the cell.
Karp G. 2009. Biologa Celular y Molecular. 5 ed. McGraw-Hill/Interamericana
de Mxico.
Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. 2003. Bioqumica. 3 ed. Addison
Wesley. Mxico.
Salisbury F. y Ross .W. 1994. Fisiologa de las plantas. Grupo Iberoamrica.
Mxico.
Steucek, GL., Hill RJ y Class/Summer. 1985. Photosynthesis I: An Assay
Utilizing Leaf Disks. The American Biology Teacher, 47(2):96-99.
Wickliff, JL y Chasson, RM. 1964. Measurement of photosynthesis in plant
tissues using bicarbonate solutions. Bioscience, 14: 32-33.
ANEXO.
Especies de plantas recomendadas para esa prctica
Dieffenbachia, conocida en Mxico
como Amoena. Pertenece a un
gnero de plantas tropicales de la
familia de las Arceas con
caractersticas manchas claras en
sus
hojas.
Son
utilizadas
frecuentemente como planta de
interior debido a su tolerancia a la
sombra.
Ligustrum vulgare, es una especie de planta

perteneciente a la familia Oleaceae.
Conocido en Mxico como trueno, por el
parecido de sus ramas torcidas con el
relmpago. Es un arbusto de 2 a 3 m de
altura, con hojas parecidas a las del olivo,
pero de color ms verde, son opuestas y
lanceoladas. Las flores son blancas y
olorosas. El fruto es una baya negra,
amarga y txica.
42

Prctica 8
OBTENCIN Y DETERMINACIN CUANTITATIVA DEL
CIDO DESOXIRRIBONUCLEICO
INTRODUCCIN
El cido desoxirribonucleico (DNA), es un cido nucleico que contiene instrucciones
genticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos y
es responsable de su transmisin hereditaria. En los organismos eucariotas, la mayor
parte de su DNA, se encuentra almacenado dentro del ncleo celular y una mnima
parte en elementos celulares llamados mitocondrias y cloroplastos.
La molcula de DNA est constituida por dos largas cadenas de polinucletidos
unidas entre s por puentes de hidrgeno formando una doble hlice. Estos
nucletidos estn formados por la unin de un monosacrido (desoxirribosa), un
cido fosfrico y una base nitrogenada de tipo prico (adenina y guanina) o
pirimidnico (citosina o timina).
En la doble hlice las bases nitrogenadas se unen entre s mediante puentes de
hidrgeno; dos entre adenina-timina (A-T) y tres entre citosina-guanina (C-G) y
viceversa, de esta forma las cadenas son complementarias. El orden en el que
aparecen las cuatro bases a lo largo de una cadena en el DNA es crtico para la
clula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones del programa
gentico de los organismos.
En el interior del ncleo de las clulas eucariotas, el DNA est asociado a protenas
especiales llamadas histonas, formando la cromatina. Durante la divisin celular, la
cromatina se condensa formando los cromosomas. Para extraerlo es necesario
homogeneizar el tejido y romper las clulas para separar el ncleo, romper tambin
la envoltura nuclear para liberar su contenido, luego separar el DNA de las protenas
que lo protegen y, por ltimo, precipitarlo para extraerlo de la solucin. Una vez
realizado esto, el DNA aparecer como un agregado de fibras blanquecinas.
La desoxirribosa en soluciones fuertemente cidas se deshidrata dando aldehdo 5hidroxilevulnico. Este aldehdo se condensa con la difenilamina dando un compuesto
de color azul que absorbe a 595 nm de longitud de onda. Esta reaccin puede ser
usada para cuantificar la cantidad de DNA presente en la muestra.
43

Representacin de la doble hlice del DNA
OBJETIVO GENERAL
Extraer el cido desoxirribonucleico a partir de un tejido animal y determinar su
identificacin cuantitativamente.
Extraer el DNA a partir de un tejido animal.

Determinar la cantidad de DNA extrado.
HIPTESIS
44

MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo
2
1
1
1
2
1
1
2
1
7
1
1
1
1
1
1
1
2
Morteros con pistilo.

Bistur
Embudo.
Probeta de 100 mL.
Pipeta Pasteur.
Centrfuga.
Tubos de centrfuga de 50 mL.
Tubos de ensayo de 16 x 150 mm.
Gradilla.
Palangana con hielo.
Balanza de dos platos.
Espectrofotmetro.
Celdas para espectrofotmetro.
Material proporcionado por los alumnos

10 g Hgado de pollo fresco.
2 Bolsas de gasa estril.
1 Papel aluminio.
Reactivos
Alcohol etlico.
Dodecil sulfato de sodio (SDS).
Difenilamina.
Cloruro de sodio (NaCl).
cido desoxirribonucleico (DNA).
cido actico (CH3-COOH).
cido sulfrico (H2SO4).
45

Soluciones
Alcohol etlico 95% fro. (500 mL).
NaCl 2 M. (500 mL).
SDS al 5%. (10 mL).
Reactivo de difenilamina (0.8 g en 80 mL de cido actico y adicionar
2.0 mL de cido sulfrico concentrado, preparar en fresco, 80 mL).
Solucin patrn de DNA 0.2 mg/mL (50 mL).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
A. Extraccin de DNA
Enfriar el mortero en un bao de hielo.
Pesar 10 g de hgado de pollo fresco en un papel aluminio y fragmentarlo con
el bistur en el mortero fro.
Macerar perfectamente hasta obtener una suspensin homognea
manteniendo el mortero en hielo.
Adicionar 50 mL de agua destilada y remover suavemente.
Filtrar la suspensin a travs de dos capas de gasa con ayuda del embudo de
vidrio, recuperando el filtrado en un vaso de precipitados de 250 mL que debe
estar en el bao de hielo.
Adicionar 50 mL de la solucin de NaCl 2M y mezclar suavemente.
Agregar 1 mL de SDS y mezclar suavemente, evitando que se forme espuma.
Dejar incubar en el hielo durante 10 min.
Aadir lentamente, resbalando por las paredes del vaso de precipitados 50 mL
de etanol fro. No mezclar.
Dejar incubar en hielo durante 10 min. Es muy importante evitar que se
mezclen las soluciones, pues ser en la interfase donde precipitar el DNA.
Tomar el DNA de la interfase con la ayuda de una pipeta Pasteur, teniendo
cuidado de no tomar la fase inferior y transferirlo a un tubo de centrfuga.
Centrfugar la muestra a 3000 rpm durante 5 min y desechar el sobrenadante.
Disolver el botn en 5 mL de agua destilada y mantener en hielo.
Tomar una alcuota de DNA para realizar la cuantificacin.
B. Cuantificacin de DNA
1.
Disponer de una serie de tubos de ensayo para realizar la curva patrn de

DNA y agregar los reactivos como se indica en la siguiente tabla:
46

Reactivos
Tubo No.
1
Patrn de DNA (mL)
0.2
0.4
0.8
1.0
Agua (mL)
1.0
0.8
0.6
0.2
Muestra de DNA (mL)
1.0
1.0
2.
3.
4.
Adicionar 2.0 mL del reactivo de difenilamina (con mucho cuidado) a cada

tubo.
Incubar todos los tubos en bao de agua hirviendo durante 10 minutos.
Dejar enfriar y medir la absorbancia a 595 nm de longitud de onda, usar como
blanco el tubo No. 1.
RESULTADOS
1.
2.
Graficar la curva patrn de DNA, obtener los valores de ecuacin de la recta y

calcular la cantidad de DNA presente en la muestra.
Indicar los niveles de DNA que contiene la muestra y comparar con los valores
obtenidos por otros grupos de trabajo.
el anlisis.
Con base a las observaciones, explicar a qu se debe el color obtenido en
la muestra de DNA.
Indicar qu tipo de molcula es la difenilamina y por qu se puede utilizar
para cuantificar al DNA.
Mencionar si el mtodo de extraccin es el adecuado y s existen otros
mtodos.
CONCLUSIN
CUESTIONARIO PREVIO
1.
2.
Cul es la funcin y la importancia del DNA en los organismos.

Cul es la composicin y la funcin de los cromosomas?
47
3.
4.
5.

Qu diferencia existe entre los nucletidos de DNA y los de RNA?

Por qu el DNA en solucin se precipita en presencia de alcohol fro?
Cul es el efecto del cloruro de sodio y del SDS en la tcnica?
BIBLIOGRAFA
Molecular de la Clula. 5 ed. Omega. Espaa.
2. Gercel-Taylor C. 2005. Diphenylamine assay of DNA fragmentation for
chemosensitivity testing. Methods Mol Med.111:79-82.
de Mxico. Mxico.
4. Lewin B. 2008. Genes IX. Jones and BartlPicetaett Publishers. USA.
6. Rice PA y Correll CC. 2008. Protein-nucleic acid interactions: Structural
biology. Royal Society of Chemistry. USA.
48

Prctica 9
MITOSIS
INTRODUCCIN
La mitosis (del griego mitos, filamento) es el proceso de divisin celular en el cual a
partir de una clula se originan 2 clulas hijas con igual nmero y tipo de
cromosomas. Este tipo de divisin celular es semejante en todas las clulas
eucariotas, y es llevado a cabo por las clulas somticas, aunque existen algunas
diferencias entre clulas vegetales y animales. En las clulas vegetales, la mitosis
se lleva a cabo sin la presencia de centriolos y steres, ya que carecen de ellos.
El proceso de divisin celular inicia al final del periodo G2 de la interfase, y termina al
iniciarse el periodo G1 de una nueva interfase. Est conformado por las etapas:
profase, metafase, anafase y telofase. Cuando se originan las clulas hijas, ocurre la
separacin del citoplasma el cual se denomina: citocinesis. ste puede ser
simultneo con la anafase y la telofase o puede producirse en una etapa posterior.
En la profase, cada cromosoma est compuesto por dos cromtidas, resultado de la
duplicacin del DNA en el periodo S, o de sntesis del DNA en la interfase. Conforme
progresa esta etapa, la cromatina se observa cada vez ms condensada, para dar
origen a cada una de las cromtidas hermanas del cromosoma, el cual se observa
ms corto y grueso. El nuclolo se desintegra y el nucleoplasma se mezcla con el
citoplasma, esto ocurre en la prometafase.
Alrededor de los centriolos en cada polo celular, se forman los steres y comienza a
observarse la presencia del huso mittico.
Al inicio de la metafase (del griego meta, entre), los microtbulos se alargan y se
unen a los cromosomas, que estn dispersos en el citoplasma. Posteriormente se
orientan en el plano ecuatorial.
Durante la anafase (del griego ana, de nuevo) ocurre la separacin de los
centrmeros, las cromtidas se separan y migran hacia los polos. Los microtbulos
unidos a los cromosomas, se acortan.
La telofase (del griego telo, fin) se inicia al trmino de la migracin de los
cromosomas hacia los polos. Los cromosomas comienzan a descondensarse y se
agrupan en la cromatina, la cual es rodeada por cisternas del retculo endoplsmico
que se fusionan para formar la nueva envoltura nuclear y dar origen al ncleo.
Finalmente, se forman los nuclolos, por medio de los organizadores nucleolares que
se encuentran en algunos cromosomas, se lleva a cabo la citocinesis y se originan
las 2 clulas hijas (figura 1).
49

Figura 1. Etapas de la mitosis.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el proceso de la mitosis en clulas vegetales.
Identificar a las clulas que se encuentren en mitosis y diferenciarlas de

clulas en interfase.
Examinar las clulas en mitosis e identificar en qu fase se encuentran.
Determinar el ndice mittico en diferentes tipos de muestras con clulas en
mitosis, en ausencia y presencia de un agente mitosttico.
HIPTESIS
MATERIAL Y EQUIPO
1
1
1
1
2
Microscopio ptico.
Estuche de diseccin.
Vidrios de reloj.

Cebolla con races recin formadas.
Semillas de haba, frijol, garbanzo, etc. recin germinadas.
1 Navaja, para corte fino.
50

Reactivos
Etanol.
cido actico.
Orcena.
cido clorhdrico (HCl).
Colchicina.
Aceite de inmersin.
Soluciones
Solucin fijadora: etanol con cido actico 3:1. (100 mL).

HCl al 1 N. (10 mL).
Solucin de acetorcena: calentar a ebullicin 55 mL de cido actico,
agregar 2 g de orcena y dejar hervir 7-10 min. Dejar enfriar totalmente
y agregar 55 mL de agua destilada. Filtrar y mezclar 90 mL de esta
solucin con 10 mL de HCl 1 N.
Colchicina al 0.1 % en agua destilada.
Una semana antes de la prctica.
Muestras de cebolla.
1.
2.
3.
4.
Observar la cebolla, en caso de que la coronilla tenga races

muertas y/o est de color grisceo, cortar una delgada
rebanada para desechar el tejido muerto.
Colocar la cebolla limpia en un frasco o vaso con agua, la
coronilla debe estar en contacto con el agua.
Cambiar el agua todos los das.
Un da antes de la prctica mantener la cebolla en la
obscuridad y exponerla a la luz en el momento de la prctica.
51

Muestras de semillas germinadas.

1.
2.
3.
4.
5.
Lavar las semillas con una solucin de hipoclorito de sodio al 1%, durante 3-5
minutos y nuevamente enjuagarlas con agua limpia.
En un recipiente o frasco de vidrio, colocar un poco de algodn para formar
una cama y humedecer.
Colocar las semillas sobre la capa de algodn, distribuyndolas
homogneamente.
Colocar el recipiente en un lugar donde se expongan a la luz del da y cuidar
que siempre est hmedo el algodn.
Al momento de llevar las races y semillas germinadas al laboratorio, debe

tenerse cuidado de que las muestras siempre estn hmedas y no
experimenten cambios drsticos de temperatura o maltrato.
Al momento de la prctica.
1.
De las races de cebolla y semillas germinadas,

cortar la parte apical del tejido meristemtico
(aproximadamente rebanadas de menos de 1 mm),
en algunas muestras se podr observar una
coloracin amarillenta.
2.
En los vidrios de reloj, hacer dos lotes con las

muestras de races de cebolla, en uno se colocarn
en un mililitro de agua de la llave y en el otro, las
races se sumergen en un mililitro de una solucin
de colchicina al 0.1%.
Se dejan reposar por una hora. Hacer lo mismo con
las muestras de raz de las semillas de haba o de las
muestras que se dispongan. Etiquetar cada uno de
los lotes.
3.
4.
Posteriormente, quitar el lquido (agua o colchicina), esto se puede hacer

absorbindolo con papel.
52

5.
Agregar unas gotas de la solucin fijadora a las muestras hasta cubrirlas.

Dejar reposar 2-4 min.
6. Retirar el fijador, nuevamente con papel absorbente.
7. Colocar una muestra de raz en un portaobjetos etiquetado previamente.
8. Agregar una gota de acetorcena, suficiente para cubrir la muestra. Dejar
reposar 5 min.
9. Poner un cubreobjetos a la muestra, verificar que el colorante no se haya
evaporado. Colocar el portaobjetos en una toalla de papel, cubriendo la cara
superior del cubreobjetos con una parte de la toalla.
10. Con una goma de lpiz hacer presin sobre el cubreobjetos para disgregar el
tejido. El excedente de colorante se absorber por la toalla de papel.
11. Observar la laminilla al microscopio ptico con los objetivos de 10, 40 y 100 X.
Al usar el objetivo de 100 X, no olvidar colocar una gota de aceite de
inmersin en el cubreobjetos. Obtener fotos de las figuras mitticas.
12. Realizar el conteo de clulas en varios campos observados, para obtener el
ndice mittico. Determinar el ndice mittico, en cada una de las muestras de
diferentes lotes.
ndice mittico =
Nmero de clulas en mitosis X 100

Nmero total de clulas contadas
RESULTADOS
1.
Hacer observaciones al microscopio ptico para encontrar clulas en divisin

mittica. capturar imgenes e indicar caractersticas y aumento, como se
muestra en el ejemplo a continuacin.
Metafase
Anafase
1000 X
Figuras mitticas en una muestra de cebolla.
53

Muestras de raz de cebolla

Lote 1: Muestras testigo
Lote 2: Muestras en colchicina
(fotos)
(fotos)
Muestras de raz de haba germinada

(fotos)
(fotos)
Muestras de raz de ..
(fotos)
Tipo de
muestra
(fotos)
No. de
clulas
contadas
DETERMINACIN DEL NDICE MITTICO:

No. de
No. de
clulas
I.M.
clulas
Lote1:
Lote 2:
en
contadas testigo colchicina
mitosis
Tipo de muestras.
54
I.M.

Efecto de la colchicina para obtener el ndice mittico y compararlo con

respecto a los resultados de los testigos.
Indicar cul es la utilidad de tener muestras testigo.
CONCLUSIN
CUESTIONARIO PREVIO
1.
2.
3.
4.
Esquematizar y describir brevemente qu es la mitosis y sus fases.

Qu es la colchicina y cul es su funcin en esta prctica?
Cul es la funcin del fijador y cul la del colorante empleado en esta
prctica?
Mencionar 5 ejemplos de clulas que realizan mitosis e indique el tiempo que
tardan para realizarla.
BIBLIOGRAFA
Molecular de la clula. 5 ed. Omega, Espaa.
2. Becker W M, Kleinsmith LJ, Hardin J y Bertoni GP. 2009. The world of the
cell. Seventh ed. The Benjamin/Cummings. USA.
3. De Robertis EMF y Hib J. 2011. Fundamentos de Biologa Celular y Molecular.
De Robertis. 4 ed. El Ateneo. Argentina.
4. Howe B, Umrigar A, Tsien F. 2014. Chromosome Preparation From Cultured
Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203.
de Mxico. Mxico.
7. Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. 2003. Bioqumica. 3 ed. Addison
Wesley. Mxico.
8. Tiang CL, He Y, Pawlowski WP.2012. Chromosome organization and
dynamics during interphase, mitosis, and meiosis in plants.Plant Physiol. 158;
1:26-34.
Wijnker E, Schnittger A. 2013. Control of the meiotic cell division program in
plants. Plant Reprod. 26; 3:143-58.
55

Prctica 10
MEIOSIS EN CLULA VEGETAL
INTRODUCCIN
La meiosis es el tipo de divisin celular, en la cual se originan 4 clulas hijas y cuyo
material gentico constituye un nmero haploide de cromosomas (n). Cada una de
las clulas hijas producidas por meiosis contiene un complejo nico de cromosomas,
debido al entrecruzamiento y a la segregacin al azar de ellos. De esta forma, la
meiosis es una fuente de variabilidad en la descendencia.
Durante la meiosis, cada clula diploide se divide dos veces, y el DNA slo se
duplica una vez, antes de la primera divisin nuclear. As, cada una de las cuatro
clulas producidas al final, contiene la mitad del nmero de cromosomas presentes
en el ncleo de la clula original.
Las meiosis consiste de dos divisiones sucesivas, designadas convencionalmente
meiosis I y meiosis II. Durante este proceso de divisin se redistribuyen los
cromosomas y se producen clulas que tienen un nmero haploide de cromosomas
(n). Durante la interfase que precede a la meiosis, los cromosomas se duplican. En la
profase I de la meiosis, los cromosomas homlogos se aparean.
Cada par homlogo est formado por cuatro cromtidas. Cada homlogo consta de
dos cromtidas hermanas idnticas, que se mantienen unidas por el centrmero.
Mientras los homlogos estn apareados, ocurre entre ellos el entrecruzamiento,
dando como resultado el intercambio de material cromosmico, permanecen
asociados en los puntos de entrecruzamiento -o quiasmas- hasta el final de la
profase I. Luego, los cromosomas comienzan a separarse, las cromtidas hermanas
de cada homlogo ya no son completamente idnticas.
Al finalizar la meiosis I, los cromosomas homlogos se separan. Se producen dos
ncleos, cada uno con un nmero diploide de cromosomas. Cada cromosoma, a su
vez, est formado por dos cromtidas. Los ncleos pueden pasar por un periodo de
interfase, pero el material cromosmico no se duplica.
En la segunda etapa de la meiosis, la meiosis II, las cromtidas hermanas de cada
cromosoma se separan, como si fuese una mitosis. Cuando los dos ncleos se
dividen, se forman cuatro clulas haploides (figura 1).
56

Figura 1. Etapas de la meiosis.
OBJETIVO GENERAL
Identificar diferentes fases de la meiosis en clulas de tipo vegetal.
Realizar la diseccin de inflorescencias.

Identificar los rganos sexuales masculinos.
Obtener las clulas gamticas masculinas en fase temprana de desarrollo.
Fijar y teir las clulas gamticas.
Observar e identificar por microscopia ptica clulas en alguna fase de la 1 o
2 divisin meitica.
HIPTESIS
MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo
1 Microscopio estereoscpico.
1 Microscopio ptico.
1 Estuche de diseccin.
57

2 Jeringas de insulina (se ocuparan las agujas, para la diseccin).

1 Caja de portaobjetos.
1 Caja de cubreobjetos.
Botones florales en primeras etapas de desarrollo de Gibasis geniculata
(apagafuego, hoja de cucaracha, mataliz) o botones florales en primeras etapas de
desarrollo de otra planta que se disponga.
Reactivos
Etanol.
cido actico.
Orcena.
cido clorhdrico (HCl).
Soluciones
Solucin de etanol con cido actico 3:1 (100 mL).

HCl 1 N. (10 mL).
Solucin de acetorcena: Calentar a ebullicin 55 mL de cido actico,
agregar 2 g de orcena y dejar hervir 7-10 min. Dejar enfriar totalmente
y agregar 55 mL de agua destilada. Filtrar y mezclar 90 mL de esta
solucin con 10 mL de HCl 1 N.
1.
A. Obtencin de las clulas gamticas.

De la planta elegida, obtener los botones florales en las primeras etapas de
desarrollo y colocarlas en un portaobjeto. Ejemplo de la muestra de inters.
58

2.
Agregar una gota del fijador y hacer la diseccin bajo el microscopio

estereoscpico.
3.
Con la punta de las agujas de las jeringas de insulina quitar parte de los
spalos, que se ven en color verde y dejar al descubierto los estambres con
las anteras.
Cortar las anteras y separarlas del resto de tejido vegetal. Si la muestra se
seca se puede agregar otra gota del fijador.
4.
5.
Una vez separadas las anteras, con la punta de la jeringa abrir la antera y
liberar las clulas gamticas del saco y con la punta de la aguja esparcirlas en
una pequea rea del portaobjetos.
B.Tincin de las clulas gamticas.
1.
2.
3.
4.
5.
Dejar secar el fijador de la muestra.

Agregar a la muestra una gota de solucin de acetorcena, colocar un
portaobjetos y reposar 5-10 min.
Posteriormente colocar el portaobjetos con el cubreobjetos, en una toallita de
papel a modo de sndwich y presionar, para quitar el exceso de colorante.
Observar al microscopio ptico con los objetivos de 10, 40 y 100 X. Al usar el
objetivo de 100 X, no olvidar colocar una gota de aceite de inmersin en el
cubreobjetos. Obtener fotos de las figuras meiticas.
Realizar el conteo de clulas en varios campos observados, para obtener el
ndice meitico.
59

RESULTADOS
1.
Hacer observaciones al microscopio ptico para encontrar clulas en

diferentes etapas de la divisin meitica, capturar imgenes e indicar
caractersticas y aumento, como se muestra en el ejemplo a continuacin.
Ttradas.
Metafase.
2 div. meitica.
Profase.
2 div. meitica.
Telofase.
2 div. meitica.
1000X
Figuras meiticas en una muestra de Gibasis geniculata.
2.
Determinar el ndice meitico:

ndice meitico =
Nmero de clulas en meiosis X 100

Nmero total de clulas contadas
:
Tipo de muestras y clulas donde se observa la meiosis.
ndice meitico encontrado.
Explicar cul es el significado de encontrar clulas con 2 ncleos o ttradas y
nmero cromosmico en ellas.
60

CONCLUSIN
CUESTIONARIO PREVIO
1.
2.
3.
4.
5.
Esquematizar y describir brevemente qu es la meiosis y sus fases.

Mencionar las partes de la flor, y resaltar las estructuras sexuales femeninas
y masculinas.
Referente a la planta utilizada indicar el nmero de cromosomas que presenta
en su fase diploide y haploide.
Cul es la funcin del fijador y cul la del colorante empleado en esta
prctica?
En qu etapa de la meiosis ser posible observar ttradas? Explicar.
BIBLIOGRAFA
Molecular de la clula. 5 ed. Omega. Espaa.
2. Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J y Bertoni GP. 2009. The world of the cell.
3. Birchler JA, Han F. 2013. Meiotic behavior of small chromosomes in maize.
Front Plant Sci. 17;4: 505.
4. De Robertis EMF y Hib J. 2011. Fundamentos de Biologa Celular y Molecular.
De Robertis. 4 ed. El Ateneo. Argentina.
de Mxico. Mxico.
y Darnell, JE. 2005. Biologa Celular y Molecular. 5a ed. Mdica
7. Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. 2003. Bioqumica. 3 ed. Addison
Wesley. Mxico.
8. Pareja ONM, Santacruz ONK, Ordoez JHR, Lagos BTC. 2010.
Comportamiento meitico de diferentes especies de lulo, Solanum sp. Acta
Agronmica. 59; 4:394-400.
9. Tiang CL, He Y, Pawlowski WP.2012. Chromosome organization and
dynamics during interphase, mitosis, and meiosis in plants.Plant Physiol. 158;
1:26-34.
10. Voet D. Fundamentos de Bioqumica. 2007. La vida a nivel molecular. 2 a ed.
11. Wijnker E, Schnittger A. 2013. Control of the meiotic cell division program in
plants. Plant Reprod. 26; 3:143-58.
61

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Establecer Observar el comportamiento de las diferentes membranas

Observar el comportamiento de las clulas vegetales y animales frente a

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trabajar en un rea limpia y especfica, no tener contacto directo con la muestra

3. Colocar el condn dentro de un vaso de precipitado de 500 mL que

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4. Abrir el condn y agregar 4 gotas de la solucin de lugol, observar si cambia el

Decir cul fue el propsito al colocar las clulas en una solucin

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Representacin esquemtica de la triple hlice da la colgena.

Extraer la colgena de cresta de pollo e identificarla por un mtodo

Extraer la colgena a partir de crestas de pollo.

Identificar a la colgena mediante un mtodo colorimtrico.

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Pipetas graduadas de 5 mL.

Material proporcionado por los alumnos

Etanol al 20%. (250 mL).

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4. Decantar y desechar el etanol con la ayuda de la esptula.

cido glutmico (mL)

Muestra de colgena (mL)

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Mencionar los elementos que constituyen a la matriz extracelular.