Universidad Complutense

FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA II

GUIA DE PRCTICAS DE
MICR OBIOL OGA
COMPLEMENT OS DE FORMA CIN

Ciencia y Tecnologa de los Alimentos

INDICE

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO..............................................................................1

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA.............................................................................................3
1. ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO..........................................................5
2. PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL......................................................................7
3. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.....................................................................................11
4. OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS.....................................................................................15
5. AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS. .............................................................21
6. SIEMBRAS: CULTIVO DE AEROBIOS.............................................................................................27
7. SIEMBRAS: CULTIVO DE ANAEROBIOS........................................................................................29
8. CONTROL MICROBIOLGICO AMBIENTAL...................................................................................31
9. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS A PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO BACTERIANO.. 35
10. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA ........................................43
ANEXO: MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS.......................................................47
BIBLIOGRAFA.....................................................................................................................................52
CALENDARIO.......................................................................................................................................53

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

- El acceso al laboratorio de prcticas slo se permite a los alumnos que estn realizando las prcticas. No se admiten visitas por razones de seguridad.
- Los laboratorios de investigacin son de acceso
restringido al personal del Departamento.

- Est prohibido pipetear con la boca.

- Ante un vertido accidental de material microbiolgico debe informarse inmediatamente al profesor encargado del grupo.
- No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura
de un frasco sin tener protegidas las manos.

- Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre

que se est trabajando en el laboratorio. Durante
el periodo de prcticas, la bata no debe utilizarse
fuera del laboratorio.

- No se manejarn los autoclaves o el material

recin esterilizado si no se dispone de guantes
apropiados.

- Debe respetarse la prohibicin de beber, comer,

masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe
evitar llevarse a la boca ningn objeto (bolgrafos...) o tocarse los ojos y nariz.

- La eliminacin de residuos, material desechable

y material reciclable se realizar siguiendo las
pautas de la prctica 1, utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto.

- En la superficie de trabajo no deben depositarse

en ningn momento ropa u objetos personales.

- Se deben lavar las manos con jabn antisptico

ante cualquier sospecha de contaminacin y siempre antes de marcharse del laboratorio.

- Cada alumno es responsable de la limpieza de

su lugar de trabajo y del material asignado, as
como de los microscopios que haya usado.
- Se deben usar los mecheros Bunsen con precaucin, no dejando material inflamable cerca y
evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se
comprobar que se ha apagado el gas al finalizar
el experimento y al abandonar el laboratorio.

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
Materiales empleados y forma de uso
Para trabajar en un laboratorio de Microbiologa se
requieren unas tcnicas especficas y diferentes
de las que se utilizan en otras disciplinas. Es
imprescindible trabajar en condiciones aspticas:
El material e instrumental que se va a utilizar, as
como los medios de cultivo, deben ser sometidos
a algn procedimiento de esterilizacin, eliminndose de ellos cualquier posible microorganismo.
Para mantener las condiciones de esterilidad,
debemos trabajar en campana de flujo laminar o
en la proximidad de la llama de un mechero
Bunsen.
En el laboratorio, el trabajo con microorganismos
suele realizarse utilizando cultivos axnicos o
puros, es decir, que contienen organismos de una
sola especie microbiana. La posibilidad de contaminacin est siempre presente porque los microorganismos se encuentran en todos los ambientes: En el aire, en el agua, en nuestra piel y, en
general, en todo lo que tocamos. Para evitar las
contaminaciones hemos de observar las siguientes normas:

- Asa e hilo de siembra: Antes de su utilizacin,

se esterilizan sometindolos a la accin de la
llama de un mechero hasta que el filamento quede
incandescente. Luego se flamear la parte inferior
del filamento. Una vez utilizados, deben flamearse
de nuevo con el objeto de eliminar los microorganismos que quedan en ellos.

Figura I.
Instrumentos
para siembra de
microorganismos
A: Asa de siembra
B: Hilo de siembra
C: Pipeta Pasteur
D: Cayado

- El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estriles.

- Los tubos o matraces deben ser tapados con
algodn hidrfobo estril o cubiertos con un
capuchn metlico, para impedir la entrada de
microorganismos. Si se usan placas de Petri
deben mantenerse tapadas mientras no se estn
manipulando.
- Los instrumentos que van a entrar en contacto
con el medio de cultivo, con los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa de
siembra, pipetas, etc) deben ser previamente esterilizados.

- Pipetas Pasteur: Son generalmente de vidrio y

se utilizan para la transferencia de cultivos lquidos, diluciones de suero, etc con ayuda de un chupete de goma u otro sistema de aspiracin mecnica. Pueden utilizarse, con el extremo inferior
cerrado, en sustitucin del hilo de siembra, cuando se realizan siembras en el interior del agar (en
profundidad). Para ello se sella previamente el
extremo de la misma con la llama del mechero.

Figura II. Pipetas

A: Pipeta automtica de 0,21 ml
B: Pipeta automtica de 0,020,2 ml
C: Pipeta de vidrio de 10 ml
D: Pipeta de vidrio de 1 ml

- Varillas de vidrio macizo acodadas (cayados):

Sirven para distribuir los microorganismos de la
muestra sobre la superficie del medio de cultivo
contenido en una placa de Petri. Se utilizarn previamente esterilizadas, impregnndolas en alcohol
y pasndolas posteriormente por la llama del
mechero. Tambin, pueden hacerse usando una
pipeta Pasteur, sellando el extremo de la misma y
acodndola con la llama del mechero.
- Pipetas graduadas de vidrio o plstico: Se suministran ya estriles a los alumnos, dentro de estuches metlicos o bien empaquetadas de forma
individual (envueltas en papel satinado o plstico
para mantener su esterilidad), en cualquier caso
deben abrirse cerca de la llama del mechero. La
pipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada,
debe flamearse ligeramente antes de ser usada.
Las pipetas llevan un algodn en la boquilla, que
acta como filtro, para evitar la contaminacin y
para impedir la llegada de lquido al sistema de
succin. Dicho algodn debe permanecer en la
boquilla durante el uso. Bajo ningn concepto se
debe pipetear con la boca una muestra microbiolgica. Para pipetear suspensiones de microorganismos se utilizan chupetes o pipeteadores ms
o menos sofisticados, como son las peras de
goma provistas de vlvulas que permiten controlar
la succin y el dispensado de los lquidos o los dispositivos semejantes a jeringas en los que se colo-

ca la pipeta y que operan por medio de un mbolo o con ayuda de bombas elctricas.
- Tubos de ensayo con cultivos problema y placas Petri: Se destapan cerca de la llama del
mechero utilizando para ello slo los dedos que
quedan libres en la mano que sostiene el asa de
siembra. Se flamea la boca del tubo, se toma una
pequea muestra del cultivo con asa de siembra
estril, previamente atemperada, y tras flamear de
nuevo la boca del tubo colocamos el tapn. Todo
el proceso se realiza cerca de la llama. Si el medio
es lquido, se debe agitar el tubo antes de tomar la
muestra, porque los microorganismos tienden a
sedimentar. En el caso de que el medio sea slido
(tubos de agar inclinado y placas Petri), la muestra se obtendr rozando ligeramente con el asa la
zona en la que se aprecia masa microbiana. Los
tubos y las placas deben permanecer abiertos el
menor tiempo posible con el fin de evitar contaminaciones.
- Medios de cultivo: Pueden ser lquidos, slidos
y semislidos. Se distribuyen en matraces, tubos
de ensayo y placas de Petri. Estas ltimas slo llevan medio slido. Su preparacin y esterilizacin
se describe mas adelante.
La composicin de los medios, colorantes y reactivos utilizados en prcticas se describe en el
anexo del final de la gua.

El asa de siembra se
maneja cogindola del
mango como si fuera un
lpiz

La boca del tubo se

flamea despus de abrir
y antes de cerrar

El tapn se maneja
con el dedo meique
de la mano derecha.

Figura III. Manejo del asa de siembra durante una inoculacin.

Toda la operacin se
realiza cerca del
mechero Bunsen

PRCTICA 1
ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO
En Microbiologa es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del material. Asimismo, es muy importante la recuperacin
del material reciclable y la eliminacin del material
desechable.

se sumergen en una mezcla sulfocrmica donde

se dejan 24 horas al cabo de las cuales se lavan
con agua y se dejan escurrir. Los portas se secan
con un pao de hilo limpio, procurando que no
queden hilazas sobre la superficie.

Todos los objetos sucios o contaminados deben

recogerse en recipientes adecuados, provistos de
tapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipetas, se separa del resto del material recogindose
en un contenedor vertical u horizontal lleno de una
solucin desinfectante, como por ejemplo una
solucin diluida de leja, en la que permanecer
antes de su lavado durante 24 horas.

El material que contiene colorantes se trata, segn

las condiciones del material, durante un tiempo
variable con una solucin que puede ser de cido
clorhdrico, ntrico o mezcla sulfocrmica.

Como los objetos contaminados contienen, con

frecuencia, cantidades importantes de materia
orgnica (procedente de los medios de cultivo)
que protegen a los microorganismos de los agentes fsicos o qumicos utilizados en la descontaminacin de los mismos, no puede asegurarse la
total destruccin de las formas vegetativas y
mucho menos de las esporas. Por ello, se recomienda utilizar mayores concentraciones de
desinfectante y tiempos ms largos de tratamiento
que para la desinfeccin o la esterilizacin de
material limpio.

El resto del material (tubos de plstico, jeringas,

etc) se trata con distintas soluciones desinfectantes como hipoclorito sdico, formol, etc, pero debe
recordarse que se utilizan a concentraciones
superiores a las utilizadas con otros fines.

Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminacin de instrumentos, equipos y material que sean estables al calor, as como de material desechable. A tal objeto se coloca este material en recipientes adecuados y se introducen en el
autoclave sometindolos a la accin del vapor de
agua a una atmsfera de sobrepresin (121 C) en
ciclos ms prolongados de lo habitual (1 hora en
lugar de 30 minutos).
Una vez efectuado este tratamiento, se procede a
su lavado para eliminar toda materia extraa,
sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o utilizando detergentes, mezcla crmica o
cualquier otro procedimiento enrgico, tanto
mecnico como qumico. Se aclara bien con abundante agua y se deja escurrir y secar a temperatura ambiente. En el caso de las pipetas, y antes
de ser lavadas, debe extraerse con ayuda de un
alambre o pinzas especiales, el trozo de algodn
que tienen en la boquilla.
Algunos de los objetos sucios y contaminados
(portaobjetos, pipetas, etc), despus de lavados,

PRCTICA 2
PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL
Introduccin

Material

En Microbiologa se define esterilizacin como la

destruccin o eliminacin total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material, incluidas las endosporas bacterianas. La esterilidad es
un estado absoluto, no hay grados de esterilidad.
El material que se va a esterilizar debe prepararse
de tal manera que se conserve sin contaminar una
vez esterilizado:

Mechero Bunsen, horno Pasteur o estufa de aire

caliente, autoclaves, equipos de filtracin y materiales a tratar.

- El material de vidrio, como tubos, matraces,

frascos, etc, se cierran con algodn graso o tapones metlicos para evitar la entrada o salida de los
microorganismos. Adems, cuando se usa
algodn, ha de cubrirse ste con un papel impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les
coloca en la boquilla un trocito de algodn que
actuar como filtro, evitando la contaminacin del
operario con los microorganismos de la muestra y
que ste a su vez contamine la muestra. Una vez
preparadas, se introducen en estuches o cajas
metlicas, o bien se envuelven individualmente en
papel satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con
calor seco, generalmente en un horno Pasteur.
- El material de plstico desechable ya se suministra estril y listo para su uso. Por ejemplo, las
placas de Petri se introducen en bolsas de plstico selladas y se esterilizan con xido de etileno o
radiaciones.
- Las soluciones y medios de cultivo lquidos se
envasan en matraces o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave.
Existen varios mtodos para llevar a cabo el proceso de esterilizacin y la eleccin de uno determinado viene condicionado por el tipo de material
que se quiere esterilizar.

Objetivos
Conocer la importancia de la esterilizacin y familiarizarse con el manejo de los procedimientos
ms frecuentemente utilizados para llevarla a
cabo.

Tcnicas
El mtodo ms comnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras
razones porque es el ms econmico y el ms
fcil de controlar. El calor utilizado con este fin
puede aplicarse en forma de calor seco o de calor
hmedo. El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidacin y se requieren temperaturas muy elevadas. El calor hmedo elimina
los microorganismos a temperaturas menores, ya
que la presencia de agua acelera la rotura de los
puentes de hidrgeno responsables de la estructura terciaria de las protenas, haciendo que stas
se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.
La esterilizacin por calor seco puede hacerse
por flameado o mediante estufas de aire caliente.
I) Flameado: Se emplea para esterilizar asas e
hilos de siembra, pinzas, esptulas, etc. Consiste
en someter directamente a la accin de la llama
de un mechero Bunsen los utensilios que se
vayan a esterilizar. Este mtodo es rpido y su eficacia es altsima, sin embargo no se puede aplicar
a objetos termolbiles.
II) Esterilizacin por aire caliente: Se lleva a
cabo en estufas de aire caliente y consiste en
colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se contaminen
una vez esterilizados, en el interior de una estufa.
Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio: Pipetas, matraces, tubos, etc. u otros
materiales termorresistentes. Las temperaturas a
las que se someten estos materiales son muy elevadas (160-180C durante cerca de 2 horas).
Estas temperaturas no pueden utilizarse para
esterilizar lquidos (como medios de cultivo), ya
que al llegar a los 100C comenzaran a hervir y
continuaran hirviendo sin elevar su temperatura
por encima del punto de ebullicin del agua a presin atmosfrica y a esta temperatura las endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante

horas. Pero incluso en muestras en las que supisemos que no existen endosporas, esta metodologa puede implicar cambios en la concentracin
de los componentes del medio, a causa de la fuerte evaporacin sufrida.
El calor hmedo tambin se utiliza para la destruccin de los microorganismos siendo, como ya
se ha comentado, a igual temperatura, mucho
ms eficaz que el calor seco; con este tratamiento
las enzimas se desnaturalizan rpidamente, al
igual que las membranas celulares. Adems, el
vapor de agua, especialmente si se genera a
sobrepresin, es un eficaz transmisor de calor al
interior de la clula microbiana. Se puede aplicar
utilizando varios mtodos: Ebullicin, vapor fluente y vapor saturado a presin:
I) Ebullicin: El agua hirviendo (100C) tiene
accin limitada, ya que aplicada durante 10 minutos va a destruir las formas vegetativas de los
microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podra utilizar el bao Mara o bao
de agua hirviente (slo con fines de desinfeccin
en el laboratorio), cuando no se necesita alcanzar
la esterilidad o cuando no se dispone de otros
mtodos mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc) como para medios de cultivo
que no puedan esterilizarse en autoclave.
II) Vapor fluente: Esta tcnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no
se puedan someter a una temperatura superior a
100C sin que pierdan alguna de sus propiedades,
como leche, azcares, suero, etc. Se utiliza un
autoclave a presin atmosfrica, con la espita
abierta, donde nunca se superan los 100C, y se
realiza el proceso durante tres das consecutivos,
dejndose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete
a calentamiento (100C) durante 30-45 minutos
destruyndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas termorresistentes.
Si stas se encuentran presentes en la muestra
germinan despus del calentamiento y estas formas vegetativas sern destruidas en los siguientes ciclos.
Este mtodo de esterilizacin se denomina tambin esterilizacin fraccionada o tindalizacin.
III) Vapor saturado a presin: La esterilizacin
por esta tcnica utiliza vapor de agua saturado
que se somete a una atmsfera extra de presin
sobre la presin atmosfrica normal, elevndose
con ello el punto de ebullicin del agua de 100C
a 121C y consiguindose la destruccin de todos
los microorganismos (salvo los termfilos extre-

mos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es tambin necesaria para la destruccin

de las endosporas bacterianas, que presentan
una alta resistencia trmica y que pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100C durante
horas. El vapor de agua difunde por smosis a
travs de las membranas de las esporas, coagulando su protoplasma, fenmeno que se acenta
si el vapor es saturado y a sobrepresin. Esta tcnica de esterilizacin requiere el uso del autoclave.

Figura 2.1: Autoclave de cuba horizontal

El autoclave permite elevar la presin una o dos
atmsferas sobre la presin atmosfrica, elevndose con ello la temperatura de ebullicin del
agua que se encuentra en su interior.
Consta de un recipiente metlico, generalmente
de acero inoxidable, similar a una gran olla, en
cuyo interior se introduce el material a esterilizar
que se coloca sobre una rejilla o placa agujereada. Despus de cerrar cuidadosamente la tapa, se
conecta la fuente de calor y comienza a elevarse
la temperatura en su interior. La salida continua
del chorro de vapor a travs de la vlvula nos indica que el aire contenido en el interior del autoclave ha sido eliminado. La eliminacin de este aire
es importante ya que la difusin del calor entre el
vapor de agua y el aire es pobre, por lo que no se
alcanzar la temperatura esperada a la presin
elegida y no se conseguir la esterilizacin. La
vlvula se cierra cuando slo sale vapor de agua
y, a partir de ese momento, comienza a elevarse
la presin hasta una atmsfera sobre la presin
normal, elevndose como consecuencia la temperatura hasta 121C. Transcurridos 15-20 minutos,
en estas condiciones, el material se ha esterilizado. Es el incremento de temperatura por encima
de los 100C y no la presin la que destruye los
microorganismos.
Si se esterilizan volmenes grandes de lquidos,
es necesario mantener el material en el autoclave
durante perodos de tiempo ms prolongados,
pues se tarda ms en alcanzar los 121C en el

centro de un gran volumen.

Una vez transcurrido el tiempo necesario, se
apaga el autoclave y se deja descender la temperatura hasta que el indicador marque menos de
80C, que ser cuando la presin haya descendido hasta presin atmosfrica. Se abre ligeramente la espita para comprobar que no queda vapor a
presin en el interior y ya se puede proceder a retirar todo el material esterilizado, dejndolo enfriar
a temperatura ambiente.
El autoclave se utiliza para esterilizar medios de
cultivo, instrumentos, ropas, soluciones, jeringas,
etc que puedan soportar altas temperaturas y una
atmsfera de sobrepresin.
Para la esterilizacin de materiales lquidos sensibles al calor, como algunos medios de cultivo,
soluciones de antibiticos, enzimas, vacunas, etc.
o tambin para gases, se utiliza la filtracin. En la
esterilizacin por calor se destruyen los
microorganismos del medio, mientras que la filtracin los retira de una forma mecnica, en lugar de
destruirlos.
La filtracin es el paso de un lquido o gas a travs
de un material filtrante, con poros lo suficientemente pequeos como para retener clulas microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad
son, generalmente, los denominados filtros de
membrana y estn integrados por pequeas piezas de material sinttico, generalmente acetato de
celulosa o policarbonato, que pueden tener poros
con tamaos de 0,22 y 0,45 m, diseados para
retener bacterias. La accin combinada de los
poros, la trama del filtro y la naturaleza qumica
del material utilizado retiene los microorganismos,
pero no el fluido. Los fluidos que se van a filtrar
pasan a travs de la membrana con la ayuda del
vaco generado, por ejemplo, con una bomba de
vaco.
Tanto los filtros de membrana como los equipos
de filtracin con los que stos se usan deben ser
esterilizados por otros mtodos, generalmente
vapor saturado a presin en el autoclave.
Los virus y algunas bacterias de tamao muy
pequeo como, por ejemplo, los micoplasmas, no
son retenidos por los filtros habituales.

10

PRCTICA 3
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
Introduccin
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes,
factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los
compuestos necesarios para el desarrollo de los
microorganismos.
Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras
bacterias necesitan medios especiales y existen
algunas que no pueden crecer en ninguno de los
medios desarrollados hasta ahora. Los distintos
tipos de medios de cultivo varan segn las necesidades de los microorganismos objeto de estudio,
pero todos han de cumplir los siguientes requisitos:
- Han de contener las sustancias necesarias para
el crecimiento del microorganismo que se siembra.
- Han de mantenerse estriles hasta el momento
de la siembra.
Los requerimientos para el crecimiento microbiano
se pueden agrupar en dos categoras: Fsicos y
qumicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presin osmtica; entre los
requerimientos qumicos se encuentran el agua,
las fuentes de carbono y nitrgeno, las sustancias
minerales, el oxgeno y determinados factores
orgnicos de crecimiento.
Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y condiciones adecuadas.

Objetivos
Aprender a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de cultivo.

Tipos de medios de cultivo

Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la
mayora de ellos pueden adquirirse ya elaborados,
necesitando algunos slo la adicin de agua o la
esterilizacin.
Los medios de cultivo pueden clasificarse:
A) Por el estado fsico en que se encuentran

1.-Medios lquidos o caldos: Son aquellos que

contienen, disueltos en agua, los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos.
2.-Medios slidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les aade un agente solidificante.
El agar es un polisacrido complejo que se obtiene de algas rodofceas de origen marino cuyas
propiedades son de gran utilidad en la preparacin
de medios de cultivo slidos: No es degradado
enzimticamente por los microorganismos (a
excepcin de algunos microorganismos de
ambientes marinos), funde aproximadamente a
100C y permanece en estado lquido mientras la
temperatura no descienda por debajo de 45-50C.
Adems, una vez solidificado se puede incubar a
temperaturas elevadas sin que se lice.
Generalmente el agar se aade, para solidificar un
medio lquido, en una concentracin del 1,5%. Los
medios con agar se envasan en tubo o en placa
de Petri.
3.-Medios semislidos: Son similares a los
medios slidos, pero la concentracin del agente
solidificante es menor, generalmente del 0,4% con
lo que, una vez solidificados mantienen una consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para
determinar la movilidad de los microorganismos.
B) Por su composicin
1.-Medios complejos: Contienen todos los
nutrientes necesarios para el crecimiento de
muchos tipos de microorganismos, pero no se
conocen todos los componentes que forman parte
de ellos, ni las concentraciones exactas de cada
uno de ellos. Muchos de sus componentes proceden de la degradacin parcial de tejidos o productos animales, de plantas o de microorganismos
que son fuente de aminocidos, azcares, lpidos,
vitaminas y minerales.
Ejemplos de dichos componentes son las peptonas o triptonas (protenas animales digeridas
enzimticamente), el extracto de carne y el extracto de levadura. Como ya se ha mencionado, en
estos medios suelen encontrarse azcares pero
en muchos casos los medios complejos son suplementados con glucosa.
Un ejemplo de medio nutritivo complejo es el
caldo nutritivo, que contiene peptona y extracto de
carne.
11

2.-Medios definidos: Son aquellos que contienen

los distintos nutrientes en forma de productos qumicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. As, un medio definido que permita el desarrollo de un microorganismo hetertrofo y "poco exigente", como E. coli, debera contener sales inorgnicas y fuentes de carbono y nitrgeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa y
NH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro,
manganeso y cobre, se encuentran generalmente
presentes como contaminantes de los productos
qumicos antes citados, en cantidades suficientes
para el crecimiento.
C) Por su utilizacin:
Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los que se pueden
desarrollar una gran variedad de microorganismos
con distintos requerimientos nutricionales. Sin
embargo, en algunas ocasiones, es necesario aislar a partir de una muestra un microorganismo que
se encuentre en un bajo nmero y que pueda ser
enmascarado por otros microorganismos presentes en un nmero ms elevado. En esos casos es
recomendable utilizar medios de cultivo que ayuden a separar y diferenciar dichos microorganismos o que, de forma selectiva, favorezcan el crecimiento de alguno de ellos.
Estos medios pueden ser:
1.-Medios selectivos: Son aquellos que permiten
el crecimiento de un tipo determinado de
microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los
dems.
Algunos de estos medios contienen un agente
selectivo como antibiticos, productos qumicos,
colorantes, etc. Entre los agentes selectivos podemos citar el cloruro sdico, que en concentracin
elevada inhibe la mayora de los microorganismos
excepto los microorganismos halotolerantes,
como son los estafilococos, o la azida de sodio,
que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas al fijarse al hierro de la porfirina del sistema
citocromo, permitiendo seleccionar los estreptococos, que carecen de este sistema, as como otros
Gram positivos. De la misma manera, la bilis y
sales biliares convierten los medios de cultivo a
los que se aaden en selectivos para Salmonella
ya que, adems de inhibir a los microorganismos
Gram positivos, en concentraciones elevadas inhiben tambin a bacterias Gram negativas fermentadoras de lactosa.
Los colorantes, como el verde brillante, inhiben
selectivamente las bacterias Gram positivas, siendo tambin inhibidor para la mayora de las bacte-

12

rias intestinales excepto para Salmonella. Este

colorante es la base del medio Agar Verde
Brillante, utilizado para el aislamiento de
Salmonella a partir de muestras fecales.
Los medios selectivos pueden serlo tambin por
su pH, as el agar glucosado de Sabouraud ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias.
2.-Medios diferenciales: Son aquellos diseados
para distinguir unos microorganismos de otros, a
partir de una poblacin mixta, por la apariencia
distinta que toman sus colonias. Estos medios de
cultivo ponen de manifiesto propiedades que un
determinado tipo de microorganismo posee.
Por ejemplo, el agar sangre es un medio nutritivo
enriquecido y es a la vez un medio diferencial, ya
que permite reconocer aquellos microorganismos
capaces de producir hemlisis. Otros medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que
pone de manifiesto la degradacin de un nutriente
especfico (generalmente un azcar) por el cambio de color que se origina cuando ste es metabolizado, como en el caso del medio CLED.
Los medios diferenciales pueden ser adems
selectivos, si se aaden agentes que inhiben el
cre-cimiento de determinados microorganismos.
En este caso va a ser posible distinguir diferentes
tipos microbianos dentro del limitado grupo de
microorganismos que pueden crecer. As, el medio
Levine es selectivo para las bacterias Gram negativas por contener dos colorantes, eosina y azul de
metileno, que inhiben el crecimiento de bacterias
Gram positivas. Es tambin un medio diferencial,
porque distingue las bacterias que fermentan la
lactosa (con produccin de cido) de las no fermentadoras. La formacin de cidos a partir de
lactosa hace que ambos colorantes precipiten en
la superficie de las colonias, que aparecen de
color morado. En ciertas ocasiones, como ocurre
en el caso de E. coli, las colonias presentan
adems un brillo metlico. El agar MacConkey es
otro ejemplo de medio selectivo y diferencial. La
presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben
el crecimiento de bacterias no entricas; la fermentacin de lactosa con liberacin de productos
cidos hace virar un indicador de pH incorporado
en el medio.

Preparacin de los medios de cultivo

La preparacin de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercializacin de
medios deshidratados, en los que los diferentes
nutrientes se encuentran ya mezclados en las
debidas proporciones, siendo slo necesario la

Figura 3.1: Preparacin de medios de cultivo

Figura original del "Manual Prctico de Microbiologa" (Daz y cols.)

Bao a 55C

MEDIOS
LQUIDOS
(CALDOS)

AGAR
INCLINADO

13

adicin de la cantidad correcta de agua destilada

para disolver sus componentes.
Cuando se prepara un medio lquido se debe disolver totalmente todos sus componentes en agua
destilada. A continuacin el caldo se envasa en los
recipientes adecuados (matraces o tubos), tapando los mismos y esterilizndolos.
La preparacin de un medio slido puede hacerse
de dos maneras: Preparar el caldo y aadir agar al
1,5% o bien utilizar un medio slido comercial.
Independientemente de la forma elegida para
hacerlo, la preparacin de los medios de cultivo
slidos requiere procedimientos especiales, ya
que el agar es insoluble en agua. Por ello, una vez
aadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta
100C, para permitir que el agar se funda y quede
incorporado al resto de los nutrientes disueltos.
El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se tapan y se esterilizan. Los medios slidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en
posicin vertical, si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al
solidificarse en esa posicin adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie de
siembra.
Si se desean preparar placas de Petri, se utilizar
el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un
matraz y, una vez atemperado, se verter en placas vacas en un ambiente asptico, como el que
proporciona la proximidad de la llama de un
mechero o una campana de flujo laminar. En algunas ocasiones, el medio de cultivo destinado a
placas puede conservarse estril en tubos, que se
fundirn al bao Mara cuando se vayan a preparar las placas.
Si se han de incorporar al medio compuestos termolbiles, como vitaminas o antibiticos, se esterilizarn stos por filtracin y se aadirn al medio
de cultivo previamente esterilizado en autoclave y
una vez que este se haya atemperado. En todos
los casos se han de seguir las instrucciones del
fabricante.
La conservacin de los medios ya preparados
puede hacerse a temperatura ambiente, pero es
preferible conservarlos a 4C para retrasar su deshidratacin.

14

PRCTICA 4
OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS
Introduccin
La morfologa de los microorganismos puede examinarse de dos formas: Observando microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando clulas muertas teidas con colorantes.
El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de sus caractersticas (morfologa, tamao, movimiento, etc). Sin embargo,
las microorganismos vivos son casi incoloros y no
se pueden visualizar fcilmente al microscopio
ptico normal cuando se encuentran suspendidos
en agua, de ah que se utilicen colorantes para
incrementar su contraste con el entorno que los
rodea y de esta forma hacerlos visibles.
Los colorantes son compuestos aromticos solubles en agua (generalmente en forma de sales),
que contienen un in orgnico coloreado y otro in
inorgnico.
Pueden dividirse en dos grupos: cidos y bsicos.
El colorante es cido si la porcin coloreada tiene
carga negativa, es decir, si tiene un anin coloreado, siendo en este caso repelido por estructuras
de la clula que presenten la misma carga, como
es el caso de la superficie bacteriana. El colorante se denomina bsico si la porcin coloreada es
el catin, cargado positivamente y con afinidad por
estructuras de la clula con carga negativa, como
es la superficie celular.
Las bacterias toman mejor los colorantes bsicos,
como son el cristal violeta, el azul de metil eno y la
safranina. La eosina es un colorante de tipo cido,
as como la nigrosina.

EXAMEN EN FRESCO

Objetivo
Observar microorganismos vivos en el microscopio de campo claro. Estudiar su morfologa y agrupacin, apreciar las diferencias de tamao entre
organismos procariticos y eucariticos y aprender a diferenciar el movimiento browniano de la
movilidad de los microorganismos.

Material
Asa de siembra, portaobjetos y cubreobjetos (o
portaobjetos excavados), cultivos de microorganismos (Proteus mirabilis y Saccharomyces spp.)
y microscopio.

Tcnica
Para la observacin de microorganismos sin teir
se pueden utilizar dos tipos de preparaciones:
Montaje hmedo y montaje en gota pendiente.
- En el primer caso, depositar una gota de la
muestra tomada con asa de siembra previamente
flameada, en un portaobjetos y colocar sobre la
misma un cubreobjetos presionando suavemente.
- En el segundo caso, depositar una gota de la
muestra en el centro de un cubreobjetos limpio y
colocarlo invertido sobre el pocillo de un portaobjetos excavado, de manera que la gota no se

Figura 4. 1. Montaje hmedo entre portaobjetos y cubreobjetos

Figura 4. 2. Montaje en gota pendiente.

15

mueva ni tome contacto con los lados o el fondo

de la depresin.
Utilizar el microscopio con el objetivo de 40
aumentos, disminuyendo la cantidad de luz incidente sobre la muestra con ayuda del diafragma o
bajando el condensador. Un exceso de luz dificultar la observacin de los microorganismos, ya
que poseen el mismo ndice de refraccin que el
medio circundante (el vidrio del portaobjetos y el
lquido en el que se encuentran suspendidos).
Si se utiliza el objetivo de inmersin se debe colocar una gota de aceite de inmersin sobre el
cubreobjetos.
Para reducir la evaporacin de la muestra con el
calor desprendido por el foco luminoso y que los
microorganismos pierdan su movilidad, debe realizarse la operacin rpidamente o bien sellar los
bordes del cubreobjetos con parafina.
Observar la forma y el tamao de los microorganismos, comparando las levaduras (clulas eucariticas) con las bacterias (clulas procariticas).
Describir su movilidad, diferenciando el movimiento browniano, debido a la colisin de los microorganismos con las molculas del lquido que los
rodea, de la verdadera movilidad. La movilidad se
manifiesta por el desplazamiento de los microorganismos a grandes distancias y en una direccin
determinada, aunque a veces pueden apreciarse
rotaciones o giros. Los desplazamientos cortos y
sin sentido se deben al movimiento browniano.

TINCIN DE LOS MICROORGANISMOS

Existen distintos tipos de tincin:
1.-Tincin simple: Aquella en la que slo se utiliza un colorante, que generalmente tie a los
microorganismos. Este tipo de tincin se denomina directa.
Si el colorante proporciona una coloracin al
fondo, sin alterar el aspecto de las clulas, que
permanecen sin teir, la tincin se denomina
negativa.
La tincin simple permite observar morfologa
celular, tamao y agrupacin de los microorganismos.
2.-Tincin diferencial: Es aquella que emplea
secuencialmente dos colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en funcin de
diferencias en su estructura y composicin qumica. La tincin de Gram y la cido-alcohol-resistente, basadas en las propiedades de la pared celular
bacteriana, son las ms utilizadas.

16

3.-Tincin estructural: Se utiliza para identificar y

estudiar determinadas estructuras que pueden
estar presentes en los microorganismos. En las
tinciones estructurales se colorea nicamente una
parte de la clula.
Se utilizan este tipo de tinciones para poner en
evidencia la presencia de cpsulas, endosporas,
flagelos o inclusiones (almidn, polifosfato, etc.).

Tcnica general
En la mayora de los casos, los pasos a seguir son
los que se indican a continuacin:
1- Realizar una extensin con el asa de siembra
esterilizada, para ello se toma una pequea gota
de cada uno de los cultivos y se extiende en un
portaobjetos limpio. Si el cultivo procede de un
medio slido, se coloca una gota de agua en el
portaobjetos y se mezcla con una pequea porcin de la muestra hasta formar una suspensin
homognea, extendindola con el fin de obtener
una fina pelcula. Posteriormente, se deja secar al
aire o en la parte alta de la llama del mechero,
pero no se debe eliminar el lquido calentando el
portaobjetos a la llama porque pueden distorsionarse las clulas.
2- Fijar la muestra. La fijacin tiene como finalidad
coagular el protoplasma de las clulas y hacer que
se adhieran al portaobjetos, siendo el calor el
mtodo ms utilizado para la fijacin, aunque pueden utilizarse otros agentes, como el alcohol
(metanol) u otros compuestos qumicos. La fijacin con calor se recomienda cuando se trabaja
con muestras de un cultivo slido; en muestras
obtenidas de un cultivo lquido es mejor hacer la
fijacin con metanol ya que se retienen en el portaobjetos un mayor nmero de clulas. Es necesario que la extensin se haya secado antes de
proceder a la fijacin, por ello se debe esperar
hasta que el lquido de la misma se evapore. La
fijacin por calor se lleva a cabo pasando varias
veces la preparacin seca a travs de la llama de
un mechero, con la extensin hacia arriba. El calor
desnaturaliza las protenas y suele matar al microorganismo. Es importante no excederse en este
proceso, para evitar que las bacterias se deformen
o se rompan, siendo suficiente que el portaobjetos
se note caliente sobre el dorso de la mano, pero
no demasiado.
3- Realizar la tincin. Para ello es necesario cubrir
la preparacin con abundante colorante y dejarlo
actuar durante algn tiempo.
4- Pasado ese tiempo, lavar con agua las preparaciones teidas para eliminar el exceso de colorante, dejando caer con suavidad el agua sobre un
extremo del portaobjetos, que se mantendr inclinado durante este proceso. No se debe dirigir el

Figura 4.3. Tcnica de extensin de una muestra sobre portaobjetos.

agua con demasiada fuerza sobre la preparacin
para no arrastrar la muestra.
5- Eliminar el exceso de agua del portaobjetos golpendolo ligeramente con cuidado por el canto.
Permitir que se seque la preparacin, bien utilizando un papel secante, sin frotar o bien dejndola secar al aire, aunque lleva ms tiempo.
6- Examinar la preparacin al microscopio, con el
objetivo de inmersin (100x), colocando, previamente, una gota de aceite de inmersin sobre la
preparacin.

TINCIN SIMPLE

Objetivo
Estudiar las caractersticas de los microorganismos en cultivo, es decir, tamao, forma y agrupacin de las clulas.

Material
Asa de siembra, portabojetos, cultivos bacterianos
de microorganismos (Escherichia coli y
Staphylococcus aureus), colorantes, microscopio
y aceite de inmersin.

Tcnica
1- Preparar extensiones de los distintos
microorganismos, dejar secar al aire y proceder a
su fijacin.
2- Realizar la tincin cubriendo la preparacin con
abundante colorante y dejarlo actuar durante
algn tiempo. Para la fuchsina fenicada bastan de
15 a 30 segundos, para el cristal violeta es suficiente de 30 a 45 segundos, para la safranina de
1 a 2 minutos y para el azul de metileno de 3 a 5
minutos.
3- Lavar con agua las preparaciones teidas y
continuar con la tcnica tal y como se indica previamente.
4- Examinar la preparacin al microscopio con el

Figura 4.4. Procedimiento general para realizar una tincin.

17

objetivo de inmersin. Observar la forma y disposicin de los microorganismos teidos con el colorante.

TINCIN DIFERENCIAL
La tincin diferencial colorea selectivamente ciertos tipos de clulas, ya que los colorantes que se
utilizan reaccionan de modo diferente con los distintos microorganismos, generalmente debido a
diferencias en la estructura y/o composicin qumica de la pared celular de stos.
Estas tcnicas son de gran inters en la identificacin y la clasificacin de las bacterias, y la ms utilizada es la tincin de Gram.

res, son las que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular gruesa, compuesta
principalmente por peptidoglucano, mientras que
en Gram negativas, aunque la pared est tambin
constituida por pptidoglucano, es ms delgada y
presenta adems una membrana externa con lipopolisacridos. Las paredes de las bacterias Gram
positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratacin y sus poros se contraen, dificultando la
salida del complejo cristal violeta-yodo. En las
Gram negativas, el alcohol desorganiza la capa
lipdica ms externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglucano.
La tincin de Gram es ms reproducible cuando
se aplica a cultivos jvenes de bacterias, ya que
las bacterias Gram positivas, en la fase estacionaria de crecimiento, pueden aparecer como Gram
negativas.

Tincin de Gram
Objetivo
Es uno de los procedimientos de tincin ms tiles
en la identificacin de microorganismos, ya que
divide a stos en dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos. En esta tcnica es necesario utilizar varias soluciones:
1.- Un primer colorante bsico, generalmente cristal violeta, que se aplica sobre la muestra y que
reacciona con las clulas (cargadas negativamente), colorendolas.
2.- Un mordiente, que incrementa la afinidad entre
el primer colorante y las clulas. Parece ser que el
mordiente (solucin diluida de yodo) se combina
con el colorante, para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior de la clula.
3.- Un agente decolorante, como el etanol de 90%
o la mezcla alcohol-acetona (1:1), que son disolventes orgnicos capaces de eliminar el primer
colorante de algunas bacterias, decolorndolas.
4.- Un colorante de contraste, igualmente de
carcter bsico pero de distinto color que el primer
colorante. Generalmente se suele utilizar la safranina, de color rosa, que contrasta con el color violeta del primer colorante, y que teir slo a las
bacterias decoloradas en el paso anterior.
Los organismos que resisten la decoloracin y
retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecern de color violeta oscuro al microscopio y se
denominan Gram positivos. Aquellos que pierden
el color inicial del cristal violeta tras la decoloracin, se clasifican como Gram negativos y toman
el color rosa debido al segundo colorante, la safranina.
Las diferencias qumicas en sus paredes celula-

18

Aprender una tcnica de coloracin diferencial e

interpretar los resultados obtenidos en la misma,
distinguiendo bacterias Gram positivas y Gram
negativas.

Material
Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianos
de microorganismos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Neisseria spp.),
colorantes, solucin de lugol, etanol de 95%,
microscopio y aceite de inmersin.

Tcnica
Preparar extensiones de los distintos microorganismos, que debern encontrase en fase exponencial de crecimiento. Dejar secar al aire y proceder posteriormente a la fijacin, siguiendo la tcnica ya descrita.
Para la coloracin se seguir el siguiente protocolo (modificacin de Hucker):
1- Teir durante un minuto con la solucin cristal
violeta.
2- Lavar el exceso de colorante con agua.
3- Cubrir la extensin con una solucin diluida de
yodo (lugol), que actuar como mordiente, durante un minuto.
4- Lavar con agua el exceso de lugol.
5- Decolorar con etanol de 90%, cubriendo la preparacin y dejando actuar durante 30 segundos.
6- Lavar con agua abundante para eliminar el

resto del disolvente.

7- Colorear con safranina durante un minuto (coloracin de contraste).
8- Lavar con agua y dejar que la preparacin se
seque.
9- Examinar las preparaciones al microscopio, con
aceite y usando el objetivo de inmersin. Las bacterias Gram positivas aparecern coloreadas de
violeta, mientras que las Gram negativas se
observan de color rosa.

TINCIN ESTRUCTURAL
Las tinciones estructurales se utilizan para poner
de manifiesto partes especficas de los microorganismos que carecen del contraste necesario para
poderse observar con el microscopio ptico. Los
procedimientos y colorantes utilizados permiten
teir selectivamente una porcin de la clula,
como pueden ser endosporas, flagelos, cpsulas,
etc.

Tincin de esporas (endosporas)

Las endosporas son estructuras que se forman en
el interior de ciertos tipos de bacterias, entre los
que destacan las pertenecientes a los gneros
Clostridium y Bacillus. A diferencia de la clula
vegetativa de la que procede, la endospora es
resistente a factores ambientales adversos: Altas
temperaturas, compuestos qumicos txicos y
tambin a los colorantes. Sin embargo, existen
colorantes como el verde malaquita que, con
ayuda del calor, pueden penetrar en ella. Una vez
teidas, no perdern el colorante en el lavado con
agua y s lo harn las formas vegetativas, que
quedarn teidas con el colorante de contraste.
La posicin y morfologa de las esporas en el interior de la bacteria tiene inters taxonmico, ya que
es de utilidad para diferenciar especies dentro de
un mismo gnero.

Tcnica (mtodo de Wirtz)

Los cultivos bacterianos debern encontrarse en
fase estacionaria, para que se favorezca la esporulacin. Con ellos se preparan extensiones en
portaobjetos y tras secar al aire se fija con calor
segn ya ha sido indicado.
1- Se cubre la preparacin con solucin de verde
malaquita, calentando con el mechero hasta la
emisin de vapores. Se realiza invirtiendo el
mechero y pasando la llama bajo la preparacin
peridicamente. Esta operacin se repite durante
5 minutos, evitando que la muestra hierva y que
se evapore completamente el colorante, aadiendo ms colorante en caso necesario.
2- Lavar con agua el exceso de colorante.
3- Aplicar la solucin de safranina, como colorante de contraste, durante 30 segundos.
4- Lavar con agua y secar la preparacin
5- Examinar con objetivo de inmersin, anotando
la morfologa y disposicin de las endosporas en
las dos especies de Bacillus. Las esporas de B.
subtilis son ovaladas y aparecen en posicin subterminal no deformante, coloreadas de verde, en
el interior de las formas vegetativas, con forma
bacilar y que estn teidas de rosa. Las esporas
de B. sphaericus son esfricas, aparecen en posicin terminal, estando la clula deformada por el
tamao de la espora.

Objetivo
Aprender una tcnica de tincin estructural e interpretar los resultados obtenidos, reconocer las
esporas teidas y observar su forma y su localizacin en las bacterias.

Material
Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianos
de microorganismos (Bacillus subtilis, Bacillus
cereus y Bacillus sphaericus), colorantes, microscopio y aceite de inmersin.

19

Figura 4.3. Ejemplos de morfologa bacteriana al microscopio ptico.

Staphylococcus en tincin Gram (arriba, izquierda) (objetivo 100x)
Escherichia en tincin simple (arriba, derecha) (objetivo 100x)
Bacillus en tincin Gram (abajo, izquierda) (objetivo 100x)
Observacin en fresco de clulas de Candida (abajo, derecha) (objetivo 40x).

20

PRCTICA 5
AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS
- Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de aislamiento en placa de Petri.
- Obtener colonias separadas, utilizando uno o
ms mtodos.
- Estudiar la morfologa de cada colonia.

AISLAMIENTO

Introduccin
En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados
en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar
con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros.
Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene
un slo tipo de microorganismo y que procede
generalmente de una sola clula; el crecimiento
de sta origina, en medio slido, una masa de
clulas fcilmente visible que recibe el nombre de
colonia.
Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de
una poblacin microbiana mixta, se utilizan las
denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron
desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio,
Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido
con esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert
Koch introdujo los medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en
Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica
de las colonias sobre la superficie del medio de
cultivo o en el interior del mismo.
El aspecto de las colonias sirve para diferenciar
distintas especies microbianas.

Objetivos

Carga (1 estra)

Material
Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, placas
de Petri con medio de cultivo slido y cultivo de
microorganismos.

Tcnicas

Serie de
diluciones
conocidas de
la muestra

Cayado

Figura 5.1. Siembra por extensin en

superficie para recuento.
Existen distintas tcnicas que pueden utilizarse:
a) Extensin en superficie con cayado
Depositar sobre la superficie de una placa con
agar nutritivo una gota 0,1 ml de una determina-

Primera diseminacin

Segunda diseminacin

(2 estra)

(3 estra)

ltima diseminacin

(4 estra)

Figura 5.2. Tcnica de aislamiento por estra en superficie.

21

da dilucin del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta
que est completamente seco. Incubar la placa,
en posicin invertida, a la temperatura deseada
(durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de microorganismo. La posicin invertida evitar que el
agua de condensacin se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas.
Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.
b) Estra mltiple en superficie
Con un asa de siembra, previamente esterilizada,
se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la
superficie de la placa con agar nutritivo, en forma
de estras muy juntas, pero sin hacer presin para
no daar el agar.
Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la
siembra realizada previamente, se extiende de
nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas
estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las
sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a
incubar, a la temperatura adecuada, siempre en
posicin invertida.
Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de bacterias.
c) Dilucin en masa
En una placa de Petri vaca se deposita un
pequeo volumen conocido de muestra y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a
45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la
placa. De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de culMedio fundido
Medio
atemperado
fundido
Inculo
Inculo
atempera
calibrado
calibrado

Homogeneizar
Homogeneiz

Figura 5.3. Siembra por dilucin en masa

o inclusin en agar.

22

tivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular
el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de
la muestra. La homogeneizacin de la muestra y
el medio de cultivo se realiza por rotacin del tubo
entre las manos, antes de verterlo sobre la placa.
En ambos casos, trs homogeneizacin, se dejan
enfriar las placas hasta que se solidifique el medio
y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posicin invertida).
Aunque con esta tcnica se obtienen colonias aisladas, generalmente slo se utiliza para determinar el nmero de microorganismos viables en una
muestra, cuando stos son anaerobios facultativos o microaerfilos.

Resultados
a) Extensin en superficie: Tras el perodo de
incubacin se examinarn las placas. Las colonias
aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma
correcta. Podrn diferenciarse las colonias de
acuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc.
Esta tcnica de siembra, adems de permitir que
se distingan las colonias por su morfologa, permite el recuento de microorganismos viables. La
expresin de este recuento se hace en "unidades
formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una
procede de un slo microorganismo (o de un
grupo de microorganismos, pues en algunos
casos stos tienden a formar agregados). A partir
de las colonias aisladas, los microorganismos
pueden transferirse a otros medios de cultivo para
su estudio.
b) Por estra mltiple en superficie: Tras la incubacin, se observarn las colonias
aisladas en alguna regin de la
placa inoculada.
Con esta tcnica
se logra la separacin de los microorganismos que
se encuentran en
un cultivo mixto, o
bien que proceden
de
muestras Figura 5.4. Aislamiento
homogneas, pero por estra en superficie.
en las que existe un
elevado nmero.
En las zonas donde existen colonias aisladas se
puede estudiar la morfologa colonial.

c) Dilucin en masa: Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que
estn en la superficie tendrn distintas caractersticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras
que las colonias que se desarrollan en el interior,
bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular,
aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las
colonias que aparecen en la profundidad del agar
son siempre biconvexas y no se diferencian unas
de otras por su morfologa.

RECUENTO

Tcnicas

anteriormente (pg. 22). Para realizar el recuento,

se cuentan las colonias y se expresa el resultado
en UFC/ml de muestra.
c) Filtracin
MTODO DE FILTRACIN
Se utiliza para la determinacin del nmero de
microorganismos a partir de una muestra lquida
(ej., agua de consumo humano, bebidas) o alimentos slidos solubles en agua (ej., azcar,
sal...) mediante filtracin de volmenes determinados de la muestra a analizar a travs de filtros de
membrana e incubacin de los mismos sobre
medios de cultivo a temperaturas adecuadas.
Utilizaremos la tcnica de filtracin para la determinacin de coliformes totales y Escherichia coli
en un agua de consumo humano.

Pueden utilizarse distintas tcnicas:

a) Extensin en superficie con cayado
Depositar sobre la superficie de una placa con
agar nutritivo 0,1 ml de la muestra problema y de
una serie de diluciones decimales obtenidas a partir de sta. Despus se procede como se ha
expuesto en el apartado de Aislamiento (pg. 21).
Para realizar el recuento, se cuentan las colonias
y se expresa el resultado en UFC/ml de muestra.
b) Dilucin en masa
Mediante esta tcnica se pueden realizar recuentos tanto en placa de Petri como en tubo. Para
ello, se inoculan los medios atemperados con 1 ml
de la muestra problema y de una serie de diluciones decimales de sta, como se ha expuesto

Figura 5.5.
Recuento por dilucin en masa.

Material
- Muestra de agua para analizar.
- Membranas filtrantes estriles de steres de
celulosa, de 0'45 m de poro.
- Pinzas de extremos planos.
- Equipo de filtracin por vaco.
- Placas de Petri con agar lactosa-trifeniltetrazoliotergitol 7 (Agar de lactosa TTC con heptadecilsulfato de sodio o tergitol 7).
- Estufas a 37C y 44C.
Tcnica
- Colocar un filtro de membrana estril sobre el
sistema de filtracin, utilizando pinzas estriles.
Adaptar el embudo y filtrar 100 ml de la muestra
de agua previamente homogeneizada.
- Retirar el embudo y, con unas pinzas esterilizadas, transferir la membrana sobre el medio de cultivo agar de lactosa TTC de modo que la superficie de filtracin quede hacia arriba. Es importante
que la membrana quede homogneamente apoyada sobre el medio de cultivo.
- Esta prueba se realizar por duplicado, incubando las placas en posicin invertida, una a 37C y
otra a 44C durante 24-48 horas
Resultados y recuento
Se examinan las membranas y se cuentan como
bacterias lactosa-positivas todas las colonias, sin
tomar en consideracin el tamao, que originen un
viraje de color a amarillo del medio por debajo de
la membrana, consecuencia de la acidificacin del
medio tras la fermentacin de la lactosa.
Las caractersticas de los distintos coliformes en
este medio son:
- Klebsiella y Enterobacter: Colonias rojo ladrillo o naranja.
23

- Escherichia y Citrobacter: Colonias amarillas

con centro naranja.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa dan colonias azul-violetas sobre fondo azulverdoso.
Para realizar el recuento se cuentan las colonias
lactosa-positivas que hayan aparecido sobre la
superficie del filtro, despus de la incubacin a
37C (coliformes totales) y 44C (Escherichia coli),
y se expresan como nmero de UFC presentes en

C
D

fermentacin (campana de Durham).

- 5 tubos con 10 ml de caldo lactosado, a concentracin doble, con campana de Durham.
- 5 tubos con 9 ml de caldo lactosado, a concentracin sencilla, con campana de Durham.
- Pipetas de 10 ml y 1 ml estriles.
- Estufa regulada a 37C.
Tcnica
- Agitar la muestra de agua problema.
- Sembrar, mediante pipeta estril, 50 ml del agua
en el matraz con 50 ml de caldo lactosado, a concentracin doble, 10 ml del agua en cada uno de
los 5 tubos con 10 ml de caldo lactosado, a concentracin doble, y 1 ml en cada uno de los 5
tubos con 9 ml de caldo lactosado, a concentracin sencilla.
- Incubar a 37C durante 24-48 horas.
Resultado e interpretacin
Se consideran tubos positivos aquellos en los que
se observa enturbiamiento y aparicin de gas en
al menos una dcima parte del volumen de la
campana de fermentacin.
La ausencia de gas a las 48 horas se considera
como prueba negativa.

Figura 5.6. Equipo de filtracin a vaco

A. Filtro de celulosa de 045 m de dimetro de
poro.
B. Depsito para la muestra o medio.
C. Depsito para la muestra o medio filtrados.
D. Sistema de vaco.
100 ml de agua.

d) Mtodo de los tubos mltiples

MTODO DEL NMERO MS PROBABLE (NMP)
Mediante el mtodo de los tubos mltiples o
nmero ms probable (NMP) se puede determinar
el nmero de microorganismos a partir de diferentes tipos de muestras (aguas, suelo, etc.) a
partir de una muestra sembrando distintos
volmenes de la muestra a analizar o diluciones
decimales obtenidas a partir de sta, en series de
tres o cinco tubos que contienen medio de cultivo
lquido.
Aplicaremos esta tcnica al recuento de coliformes totales en una muestra de agua de bebida envasada.
Material
- Muestra de agua.
- Matraz con 50 ml de caldo lactosado, a concentracin doble, provisto de un tubo para valorar la
24

Para calcular el NMP de coliformes totales, se

determina a partir de tabla adjunta (pg. 26) en
funcin del nmero de tubos positivos en cada
serie. Los resultados se expresan como nmero
ms probable (NMP) por 100 ml de muestra.

Forma

Borde

Puntiforme

Entero

Puntifor
me
Circular
Circular
Rizoide

Entero

Ondulado

Ondulad
o

Rizoide

Elevacin

Superficie

Plana
Plana

o
LisaLisa
o rugosa

Elevada
Elevad

Mate
o
Mate o
brillante

Convexa
Convex

Seca o
cremosa
Seca
o

Lobulado
Irregular

Irregular
Filamentosa

Filamentos
a

Lobulad
o
Filamentoso
Filamentoso

Crateriforme
Crateriform

Invasiva oo
Invasiva
superficial

Acuminada
Acumina

Figura 5.6.
Aspectos ms comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio
slido.

25

TABLA PARA NMP

(COLIMETRA)

26