Prof. Dr.

Nilson Assuno
Lab. de Radicais Livres em Sistemas
Biolgicos
Lab. de espectrometria de Massas

http://www.unifesp.br/centros/proteomica/disciplina-de-pos-graduacao_espectrometria-de-massas

Tpicos
Introduo de mtodos cromatogrficos

Introduo de espectrometria de massas

Introduo da LC-MS

O que cromatografia?
BBBB
BBBB
BBB
AAAA
AAAA
AAA

Amostra

CCCC
CCCC
CCC

Analitos separados

CLASSIFICAO

Cromatografia
lquida

Fase normal

Fase Reversa

Cromatografia
em coluna

Cromatografia
supercrtica

Excluso
molecular

Inica

Cromatografia
gasosa

Um sistema de HPLC

Definio

A cromatografia um mtodo fsico-qumico que permite a separao de componentes de uma mistura, atravs da
distribuio destes componentes em duas fases, que esto em contato.

Em todas as separaes cromatogrficas, a amostra dissolvida numa fase mvel (lquido, gs ou fluido supercrtico).

A fase mvel ento forada atravs de uma fase imiscvel, fase estacionria, a qual fixa na coluna ou em uma
superfcie slida.

Os componentes que so fortemente retidos pela fase estacionria movem devagar com o fluxo da fase mvel.

Em contraste, os componentes que interagem fracamente com a fase estacionria movem mais rapidamente.

Como conseqncia dessas migraes diferenciadas, os vrios componentes da mistura se separam em bandas
discretas e podem ser analisados qualitativamente ou quantitativamente.

HISTRICO I

Mtodo desenvolvido por Mikhail Tswett (1903);

Amostra: extrato vegetal;

Fase Mvel: ter de petrleo;

Fase estacionria: CaCO3.

EXPERIMENTO DE TSWETT

Cromatografia (chroma: cor; grafein: grafia)

HPLC /CLAE Cromatografia Lquida

de Alta Eficincia

HPLC High Perfomance

(pressure) Liquid
Chromatography
Tipo de cromatografia que emprega uma fase mvel
lquida e uma fase estacionria finamente dividida e
que, para ter um fluxo razovel, opera a presses
elevadas.

HPLC
Critrios de escolha
Uma boa separao representa sempre um
balano entra as foras intramoleculares que se
estabelecem entre amostra e fases estacionria
e mvel.
Usar uma fase estacionria com polaridade
semelhante amostra e uma fase mvel de
polaridade muito diferente.
Alterar a polaridade do solvente (mistura) de
forma a melhorar a separao.

HPLC
Aspectos experimentais
Temperatura estvel para Tempos de Retenes
reprodutveis.
Desgaseificao dos solventes
Limite de deteco: menor concentrao detectvel
Limite de quantificao: menor concentrao determinda
sem ambiguidade
Tailing: arrastamento do pico

http://www.environmentalexpert.com/files/8995/images/vi
als1.jpg. Acesso 12/02/2011 s
21:50.

Fonte:http://portuguese.alibaba.com/produ
ct-free-img/syringe-for-gc-hplc275924568.html.
Acesso 12/02/2011 s
21:58

Fonte:http://www.shimadzu.com.br/
analitica/produtos/cromatografos/lc_
ms/images/uflc11.jpg. Acesso:
16/02/2010 s 15:30.

C
D
Imagem frontal do empacotamento de uma coluna C18,
tamanho de partcula, porosidade 30 nm. Ampliao: A = 3000
vezes; B = 5000 vezes (1015 m); C = 4000 vezes e
D=

 Cromatografia de fase normal

Fase estacionria polar/ fase mvel no polar o soluto
menos polar elui primeiro

Cromatografia de fase reversa

+ de 75% das aplicaes
Fase estacionria no polar / fase mvel polar / soluto mais
polar elui primeiro

 Pr-colunas
Aumento da vida das colunas
Mesma (similar) composio da fase estacionria /
maior granulometria
Remoo de particular e contaminantes dos solventes.
Saturao da fase mvel com a fase estacionria.

Forno de colunas
TA 150c (temperatura ambiente ou
ligeiramente acima- na maioria das aplicaes)
Maior a temperatura menores os tempos de reteno
Maiores temperatura causam maior degradao da
coluna

Fonte:http://www.stecinstruments.com/produtos/equipamen
tos/analiticos/cromatog_liquida/hplc.htm.
Acesso 12/02/2011 s 21:32.

Interpretao de Resultados

Escala do
detector

mV

70 0

Pico

60 0
50 0
2
40 0
30 0

20 0
6
10 0
0

ch3
0

10

11

12

13

min

Tempo de
corrida
Volume/tempo
morto

Linha de base
Integrao

HPLC - Detectores

Um detector ideal deve ter:

Alta sensibilidade e baixo limite de deteco;

Resposta rpida a todos os solutos;
Insensibilidade a mudanas nas temperatura e na

vazo da fase mvel;

Resposta independente da fase mvel;
Resposta que aumente linearmente com a
quantidade do soluto;
No destruio do soluto;
Segurana e convenincia de uso;
Informao qualitativa do pico desejado.

Ultra Violeta (UV)

 Comprimento de onda:180 600 nm;

Faixa de concentrao - ug/L;

DAD (arranjo de diodos);

Adequado para a grande maioria dos compostos

orgnicos;

Praticamente universal

DAD

HPLC - Detectores
Detectores eletroqumicos
Amperomtrico
O elemento flui pela superfcie do eletrodo onde uma frao das espcies
eletroativas oxidada ou reduzida (15-20%).

Coulomtrico
O elemento flui atravs de um eletrodo de grafite poroso onde praticamente
100% das espcies eletroativas so oxidadas ou reduzidas e portanto a
sensibilidade muito maior
(10-15mol=fentomol) .

vantagens
Alta sensibilidade
Alta seletividade
bons para as anlises
de traos.

Desvantagens
Neste tipo de deteco, a amostra tem que ser constituda de ons ou
compostos que sofram ou oxidao ou reduo

HPLC - Detectores

Anlise Quantitativa
Curva de calibrao (calibrao externa):
Uma tcnica comparativa de padro em relao a
amostra atravs da criao de equaes de 1o ou 2o
grau;
Injeo de padres de concentrao conhecida;
Recomendvel a utilizao de 6 pontos com
repetibilidade e determinao da faixa de anlise.

Parmetros da curva de calibrao:

Desenvolvendo um mtodo

Amostras (padro)

Introduo LC/MS

Espectrometria de Massas

1. Producao de ions oriundos de uma amostra em um fonte de ions;

2. Separar estes ions de acordo com a relacao massa/carga pelo analisador de massas;

3. Eventualmente fragmentar estes ions selecionados atraves de um secundo analisador;

4. Detectar estes ions oriundo do sistema de deteccao e informando em razao a abundancia dos mesmos atraves da conversao
desta intensidade em sinal eletrico;

5. Este processo atualmente e realizado com auxilio de computadores e softaware dependendo da complexidade da amostras
existe uma grande quantidades dos mesmo.

6. A Analise (tratamento de dados) pode ser rapida ou extramente longa.

Espectrometro de Massas
Ionization

Detector

Analiser (m/z)

Source

Analyzer

- EI (GC/MS)
- IC (GC/MS)
- ESI (LC/MS)
- APCI (LC/MS)
- APPI (LC/MS)
- MALDI

Detector

- Quadrupole
- Ion trap
- TOF (time of flight)
- Hybrids (Quad-Tof)
- QqQ

- Electron multiplier
- MCP (microchannel
plate)

Data system

Ion Abundance (%)

100

Inlet

80

60

40

20

Sample
introduction

- HPLC
- GC
- CE

50

100

150

200

250

m/z

Mass spectrum

MM = 180 Da
C9H8O4

Ionizacao negativa
[M-H]- = 179
H
+

Mass Spectrum
Ionizacao positiva
[M+H]+ = 181

Mass Spectrum

179

181

m/z
m/z

Resultado

Natureza das moleculas

(propriedades)
Intensidade do carater ionico;
Constante de Ionizacao (Ka ou Kb);
(pKa=4, pka = 200);
Condicao do meio reacional;
Volatilidade.

Objetivo do meu experimento

Identificar composto somente?
Quantificar?
Os dois?

Caracteristicas da amostra
Pequenas moleculas (Metabolitos);
Media moleculas (peptideos);
Grandes Moleculas (proteinas, DNA);
Lipideos;
Glicoproteinas, lipoproteinas

 Um

O experimento inicial

grande numero de cientistas tem

desenvolvido a espectrometria de massas, mas
os grandes pioneiros foram E. GOLDSTEIN
que descobriu o raios anodicos (ions em fase
gasoso) e em 1897: J.J. THOMSON discobriu o
eletron
e
determinou
sua
relacao
massas/carga.

1913

Thompson demonstrou um
equipamento que foi considerado o primeiro
especrometro de massas.

A origem

Introduo

LC provm a separao, em fase lquida, de

misturas complexas, porm dificilmente fornece
a identificao positiva de componentes
individuais.

MS uma tcnica que auxilia na elucidao

estrutural de compostos em fase gasosa, porm
dificilmente apropriado para a anlise de
misturas.

LC opera em fase lquida enquanto que MS opera

em fase gasosa, sob alto vcuo.

Introduo
O uso de uma interface necessrio para
ter
compostos
seqencialmente
separados em LC e introduzidos para
anlise no MS.

Um

bom sistema LC/MS pode fornecer

informaes
quali
e
quantitativas,
geralmente com diminutas quantidades de
material.

Cromatografia Lquida

Espectrometria de Massas

Misturas em MS

Combinando LC com MS

Aquisio dos Dados

Velocidade de varredura

Aquisio dos Dados

Nmero de espectros por pico

Melhorando os Resultados
Obter a maior eficincia possvel

Melhorando os Resultados
Apresentao de cromatograma de
on selecionado

Melhorando os Resultados
Monitoramento de on selecionado (SIM)

Sumrio
O

interfaceamento de LC com MS resulta

em um poderoso instrumento de LC/MS
que pode ser usado para anlises de
misturas complexas, originada das mais
variadas fontes.

Aplicaes

de interesse nas reas de

meio ambiente, arqueologia, mdica, e
forense, alm de qumica e bioqumica.

Int.
5

744.5

MS

4
3
2
1

586.3

0
Int.

586.4

MS/MS of m/z 744

2
1.5
528.2
1

186.1

0.5
0

686.3
100

200

300

400

500

600

700

m/z

Cromatografia Lquida Acoplada

Espectrometria de Massas
LC/MS
Espectrometria de Massas
Interfaces
Analisadores de Massas

I. Espectrometria de Massas (MS)

A espectrometria de massas uma
tcnica analtica instrumental utilizada
para a anlise, em fase gasosa, de tomos
ou molculas de uma amostra que so
ionizados e separados de acordo com a
razo massa/carga quando submetidos a
condies especficas de um campo
eltrico e/ou magntico.

I. Espectrometria de Massas (MS)

A determinao da massa molecular;

A caracterizao estrutural;
O estudo da reatividade em fase gasosa;
A anlise qualitativa e quantitativa dos componentes de uma
mistura complexa;

A estrutura de compostos inorgnicos, orgnicos e biolgicos;

A estrutura e composio de superfcie slida;
A razo isotpica de tomos na amostra.

II. O Espectro de Massas

Processo de ionizao e/ou fragmentao
Separao dos ons
Deteco e anlise
Amostra
Sistema de
introduo
de amostra

Fonte
de ons

Analisador
de massas

Sistema
de vcuo

Detector

Proc. de
dados

Etil benzeno: MM = 106 Da

C6H5CH2CH3 + e- C6H5CH2CH3 + + 2e-

Informaes do Espectro de
Massas
Separao dos ons pela razo massa/carga
Pico do on molecular
Pico do on base (100%)

Padro de fragmentao
Razo isotpica

III. Fontes (Processos) de

Ionizao
Tipo
Nome e Sigla
Bsico
Fase Gasosa Impacto Eletrnico (EI)
Ionizao Qumica (CI)
Ionizao de Campo (FI)
Dessoro
Dessoro de Campo (FD)
Ionizao electrospray (ESI)
Ionizao/dessoro laser
assistido por matriz
(MALD/I)
Bombardeamento de tomos
rpidos (FAB)
Ionizao termospray (TS)

Agente Ionizante
eltrons energticos
ons gasosos
eletrodo alta voltagem
eletrodo alta voltagem
alto campo eltrico
feixe de laser

feixe tomos
acelerados
alta temperatura

Impacto Eletrnico
A amostra passa por uma cortina de eltrons acelerados por um
campo de 70 eV

E = 70 eV 7 103 kJ mol-1

Energia de ligao tpica 200 - 600 kJ mol-1

Fragmentao

Impacto Eletrnico

Impacto Eletrnico
Alta produo de ons - boa sensibilidade
Fragmentao auxilia na identificao
Requer amostra voltil

Pico on molecular nem sempre evidente

Uso de Ionizao Qumica (CI):
produo de on molecular e a fragmentao
mais amena

Reprodutibilidade de fragmentao

Ionizao Presso Atmosfrica (API)

Ionizao Electrospray (ESI)

Ionizao Qumica Presso Atmosfrica (APCI)

Vantagens API
Informao sobre a massa molecular (MM) dos

compostos, inclusive grandes biopolmeros.

Sensvel; MM obtida com baixos nveis de

analitos.

A tcnica compatvel com molculas volteis,

no volteis, polares e apolares.

Excelente para confirmao de compostos

conhecidos.

Ionizao por Electrospray (ESI)

Ionizao

presso
temperatura ambiente

atmosfrica

Aplicao de campo eltrico de vrios kV

promove a ionizao das gotculas do spray

Um contra fluxo de gs secante reduz o

tamanho das gotculas at o seu colapso
eletrosttico

Produo de ons com elevado nmero

cargas

Interface ESI

Processo de Ionizao

Aplicaes do ESI
Anlise de compostos polares e com elevada massa

Molecular Por Exemplo: Saponinas

H3C

CH3

OH
CH3

CH3

OH

O
O

H3C

HO

O
O
O

HO

O
O
H
O

OH

OH

H3C

OH

0 447.5
sep1124Fs 8 463.5
(0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23))
0
100
sep16rFs
9 (0.448) Cm (7:18-3:5)

691.9 727.6 769.8

882.0

896.0 909.4

1187.7

1445.2
1395.1 1434.1

1230.1

1470.0
Scan ES1350.1
4.20e5
Scan ES1349.6 1351.2
1314.1
2.21e5
1391.9
1272.2
1308.1
1352.2
1394.0
1271.6
1271.9
1356.1
1230.1
1392.0
1272.9
1395.1 1434.1
1230.1
1230.8
1187.7
1188.0
1398.0 1470.0
1436.0 1488.1
1146.0

100
%

Monitoramento da composio de fraes

obtidas de extratos de Sapindus saponaria
% 447.5463.5
499.7 520.7
0
sep16rFs
9 (0.448) Cm (7:18-3:5)
0

691.9 727.6 769.8

896.0 909.4
966.1 1002.1
881.9 923.9

882.0

749.4

603.9

100
sep1162Fs
13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49))
100
%

749.4
749.5
750.5

749.5
750.5

503.5
0
455.3
603.3
665.4
sepFreu2026Fs
10
(0.494)
Cm (7:13)
0
sepha1149Fs
28 (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8))
100
100
sep1112Fs
14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9))

%
100
%

455.3

503.5
603.3

665.4

0
%
440.7471.8
sepha1149Fs
0 411.3 28 (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8))
605.5 645.3 689.7
450473.4500 528.6550
600
650
700
100400
0
sep1124Fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23))
%
100
0
%
400

450

749.6

924.6 967.1
923.6 924.5
863.6 881.9
965.7 1008.0 1042.2
882.0
836.9
945.0
967.6 1019.9 1041.8
863.9 883.1

500

550

600

463.5

499.7
411.3 473.4 520.7
528.6

650

749.6
749.4

745.9
750

800

1141.0
1097.3 1154.6

966.1
945.1 966.6
864.0 882.0

700
750
800
691.9 727.6 769.8

603.9
605.5
645.3 689.7

0
0
sep1162Fs
13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49))
sep1124Fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23))
100
100

1338.7

1407.4

1338.7

1407.4

1265.3 1298.9

1436.0 1488.1

Scan ES1.81e5
Scan
ES3.90e5

1468.4

Scan ES3.90e5
Scan
ES3.46e5
Scan ES2.24e5

966.1
965.7
1288.0
882.0
1246.2
945.1 966.6
945.0
967.6
1041.8
883.1
863.9
1097.3 1154.6 1203.8 1265.3
1289.0 1330.0
1019.9
1246.91298.9
1468.4
864.0 882.0
1204.5
1004.1 1037.9 1080.0
1386.8 1407.4
1290.0 1330.6
1247.8
1162.1
1205.7
Scan ESm/z
1387.9
1445.23.46e5
850
900924.1950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 14001402.1
1450

850

900

882.0

Scan ES-

1004.1 1037.9 1080.0

950

896.0 909.4

1000

1050

0
sep16rFs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5)
sep1112Fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9))
100
100
%
%

1398.0

1146.0
1141.0

1.81e5

1392.0

924.0
923.6924.1
924.5

749.4

440.7471.8
447.5

924.6966.1967.1
1002.1
881.9 923.9
1041.8
863.6 881.9
1008.0 1042.2
836.9

Scan ES2.21e5
Scan
ES-

966.1
965.6 966.5
924.0
924.0

603.4

471.4

1272.2 1314.1
1271.6
1356.1
1230.1
1272.9
1230.8
1188.0

966.1
924.0 965.6 966.5

499.7 520.7
%
603.9
0
603.4
471.4
sep1162Fs
13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49))
0
sepFreu2026Fs
10 (0.494) Cm (7:13)
100
100

%
%

1041.8

1100

1350.1
4.20e5
1349.6 1351.2
1407.4
1391.9
1386.8
1308.1
1352.2
1394.0
1271.9
1434.1 m/z
1395.11450
1150 12001230.1
1250 1300 1350 1400
1187.7
1470.0

Scan ESScan ES-

966.1 1002.1
881.9 923.9
1041.8

749.4
745.9

966.1
924.0 965.6 966.5

2.21e5
1272.2 1314.1
1288.0
2.24e5
1271.6
1246.2
1356.1
1230.1
1392.0
1272.9
1203.8
1246.9 1289.0 1330.0
1204.5 1230.8
1188.0
1398.0
1290.0 1330.6
1162.1
1436.0 1488.1
1146.0 1205.7 1247.8
1387.9 1402.1
1445.2
Scan ESScan ES1.81e5

1350.1
4.20e5
1349.6 1351.2
1391.9 2
1308.1
1352.2
1394.0
1271.9
1395.1 1434.1
1230.1
1407.4
1338.7
1141.0
1187.7
1470.0

Figura
18: Conjunto de espectro de massas
924.6 das
967.1 fraes eludas com MeOH/H O (1:1).
%
749.5
%
881.9
863.6
1008.0 1042.2
Debaixo
para cima:
12,750.5
24, 49
e 62.
603.4 frao
447.5 471.4
836.9 896.0 909.4
691.9 727.6 769.8
463.5
0
0
sepFreu2026Fs 10 (0.494) Cm (7:13)
sep16rFs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5)
100
100

%
%

882.0

924.0
923.6 924.5
882.0

965.7

1272.2 1314.1
1271.6
1356.1
1230.1
1272.9
1230.8

Scan ESScan ES3.90e5

2.21e5
1392.0

Ionizao Qumica Presso

Atmosfrica (APCI)
Bastante similar a ESI
Indicado para obteno de MM de compostos
conhecidos (confirmao de sntese de
biblioteca combinatria), porm induo de
fragmentao tambm possvel

Compatvel com grande faixa de fluxos de

fase mvel

Robusto para desenvolvimento de mtodo

Interface APCI

Principais Diferenas entre

APCI e ESI
Mecanismo de Ionizao:
Enquanto ESI tem voltagem aplicada ponta
do spray, APCI apresenta um nebulizador
aquecido e pneumaticamente assistido. A
voltagem (~3 kV) aplicada a uma agulha de
metal na sada do spray.

A descarga Corona ioniza as molculas do

solvente que por sua vez ionizam os analitos
por transferncia de prtons formando [M+H]+
ou [M-H]-

Principais Diferenas entre

APCI e ESI
Razo de Fluxo:

APCI tolera fluxos na ordem de 0,2 a 2,0

mL/min, enquanto que ESI opera no
mximo at 1,0 mL/min.

ESI melhor indicado para fluxos to

baixos quanto 5 L/min, compatvel com
acoplamentos capilares (LC ou CZE).

Principais Diferenas entre

APCI e ESI
Fragmentao:
Devido ao uso de aquecimento, APCI pode
produzir alguma fragmentao, enquanto que
ESI pode at formar alguns ons pseudomoleculares.

APCI no produz cargas mltiplas, portanto

no adequado para compostos de alta MM.

Sensibilidade:
Sem ser uma regra, APCI tende a render
melhor sensibilidade para solutos menos
polares.

Dessoro/Ionizao Laser
Assistida com Matriz (MALD/I)
Processo de ionizao branda.
Apropriado para biomolculas de elevado
peso molecular.

Pulso de laser incide sobre uma amostra

co-cristalizada com uma matriz apropriada
- derivados de cidos benzicos.

Anlise protemica.

Espectro MALD/I

IV. Analisadores de Massas

Setor magntico (B)
Duplo foco (EB ou B2)
Quadrupolo (Q)
Tempo de vo (TOF)
Captura de ons (MSn)
Ciclotron de ons (ICR)

Resoluo em MS

m
RS
m
RS = 4000 400,0 e 400,1 (40,00 e (40,01)

A resoluo necessria depende da aplicao

Analisador tipo Setor Magntico

m Bre

z
2V

Analisador Quadrupolar (Q)

Analisador de varredura
Normalmente mais barato e robusto que
setor magntico

Conjunto de 4 plos de sinais opostos,

que alternam sinais de radiofreqncia
entre pares, permitindo que apenas um
on atinja o detector de cada vez.

Analisador Quadrupolar (Q)

Analisador Quadrupolar (Q)

Tempo de Vo (TOF)
ons so produzidos em pulsos e injetados no
tubo de deslocamento

Tempo de Vo (TOF)
Separao dos ons temporal e depende da
energia cintica dos fragmentos

t f d d (1 2)V m
v
z

m
1,9 V t 2 d 2
z

Analisador Trap Inico (ion trap)

Compacto & robusto
Funcionamento similar ao quadrupolo
Capacidade de efetuar MS tandem temporal