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DIACM
Maro de 2012
ndice
Princpio do Ensaio .................................................................................................................... 1
Introduo a Biologia.................................................................................................................. 3
CIDOS NUCLICOS................................................................................................................ 3
ESTRUTURA DA MOLCULA DE DNA .................................................................................... 6
ESTRUTURA DA MOLCULA DE RNA .................................................................................... 8
Cdigo do DNA .......................................................................................................................... 9
DA SEQUENCIA DE DNA SNTESE PROTICA ................................................................... 9
Duplicao / Replicao ........................................................................................................... 11
Transcrio .............................................................................................................................. 12
Sntese de Protenas Traduo ............................................................................................. 13
HIV HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS ......................................................................... 15
ESTRUTURA VIRAL E GENMICA ........................................................................................ 15
REPLICAO DO HIV ............................................................................................................. 16
CARGA VIRAL ......................................................................................................................... 19
DINMICA DO HIV NO ORGANISMO INFECTADO ............................................................... 19
HCV HEPATIT VIRUS C ....................................................................................................... 20
Estrutura Viral e Genmica do Vrus ........................................................................................ 20
REPLICAO DO HCV ........................................................................................................... 22
TRANSMISSO ....................................................................................................................... 23
CARGA VIRAL ......................................................................................................................... 24
Princpio da tcnica .................................................................................................................. 25
Reao de polimerase em cadeia ............................................................................................ 25
Cintica da reao ................................................................................................................... 26
Etapas da reao de PCR ........................................................................................................ 27
Condies da PCR ................................................................................................................... 28
PCR em Tempo Real ............................................................................................................... 29
PCR Multiplex .......................................................................................................................... 29
RT-PCR.................................................................................................................................... 29
PCR em Tempo Real no NAT HIV / HCV de Bio-Manguinhos ................................................. 31
Biossegurana ......................................................................................................................... 32
Componentes e Apresentao do Kit ....................................................................................... 33
Formato do Kit .......................................................................................................................... 33
Componentes e Apresentao do Kit........................................................................................33
Relao dos componentes fornecidos com o produto:............................................................. 33
Relao dos materiais necessrios no fornecidos ................................................................. 34
Indicao das condies adequadas de armazenamento e transporte ................................... 34
Material de reposio ............................................................................................................... 34
Precaues, cuidados especiais e esclarecimentos sobre os riscos decorrentes do manuseio
do produto e seu descarte .................................................................................................... 35
Influncias pr-analticas, tais como, anticoagulantes e temperatura ...................................... 36
Cuidados com as amostras biolgicas ..................................................................................... 36
Plataforma NAT Nacional ......................................................................................................... 37
Fluxo Metodolgico .................................................................................................................. 38
Esquema do Teste ................................................................................................................... 38
NAT Teste de cido Nuclicos .............................................................................................. 39
A) Preparo do Pooling .............................................................................................................. 40
Etapas e Equipamentos: .......................................................................................................... 40
Procedimento ........................................................................................................................... 41
Utilizao do Janus .................................................................................................................. 41
Inicializao do rob (Initialize): ............................................................................................... 42
Elaborado pela DIACM
Aprovado por Linda Khalili Boukai
ii
Reviso: 29/03/2012
iii
Reviso: 29/03/2012
iv
Reviso: 29/03/2012
Siglas
AIDS Sndrome da Imunodeficincia Adquirida
cDNA DNA complementar
DNA cido desoxiribonuclico
EPC Equipamento de proteo coletiva
EPI Equipamento de proteo individual
FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
HCV Vrus da Hepatite C
HIV Vrus da imunudeficincia humana
IL interleucina
mRNA RNA mensageiro
NAT Teste de cidos nuclicos
ORF Open Reading Frame
PCR Reao de Polimerase em Cadeia
RNA cido ribonuclico
rRNA RNA ribossmico
TNF - fator de neurose tumoral
tRNA RNA transportador
v
Reviso: 29/03/2012
Princpio do Ensaio
A Plataforma NAT Multiplex HIV/HCV emprega tcnicas de Biologia Molecular para a
deteco, em tempo real, dos produtos de amplificao gerados numa reao de PCR
(Reao da Polimerase em Cadeia). O diagnstico laboratorial, nesta tecnologia, usado
para a pesquisa de cidos nuclicos especficos baseada na amplificao e deteco
simultnea de sequncias de RNA de HIV (Vrus da Imunodeficincia Humana) e HCV (Vrus
da Hepatite C). O processo de deteco realizado atravs da captao de fluorescncia
emitida pela amplificao do produto, com maior especificidade, devido utilizao de sondas
especficas marcadas com fluorforos para o fragmento alvo na reao.
Esse ensaio consiste na extrao automatizada de cidos nuclicos de um conjunto de
seis amostras biolgicas, chamado pool, juntamente com uma partcula calibradora
biossegura, ocorrendo purificao do material gentico que amplificado enquanto reage
com sondas marcadas (TaqMan chemistry). Estes marcadores utilizam a atividade nuclease
5' da enzima polimerase. O sistema de sondas possui fluorforos especficos (Reporter) e
uma molcula dissipadora de energia (Quencher) (Fig.1). A transferncia de energia ocorre
em virtude do fenmeno FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer. A reao
acontece quando h degradao da sonda, pois o aumento da distncia entre o reporter e a
molcula do quencher causa a emisso de fluorescncia, que pode ser detectada pela leitura
do comprimento de ondas especficas para cada tipo de fluorforo liberado. O monitoramento
do progresso da PCR medida que ela ocorre, em tempo real, possibilitado por meio da
leitura das intensidades da fluorescncia a cada ciclo, uma vez que as intensidades so
proporcionais ao nmero de amplicons gerados. Utiliza-se o fluorforo VIC para HIV, FAM
para HCV e DYE 3 para a partcula calibradora. Abaixo o esquema da reao de amplificao
em tempo real e as sondas utilizadas (Fig. 1).
1
Reviso: 29/03/2012
Fig 1. Processo de liberao do Reporter aps a atividade 5 3 nuclease da enzima DNA polimerase.
2
Reviso: 29/03/2012
Fig. 2: Cada cromossomo formado por uma nica molcula de dupla hlice de DNA condensada com protenas
(histonas). Esse complexo de DNA mais protenas chamado de cromatina. Em uma clula eucaritica, quase
todo o DNA est compactado na cromatina. O DNA "empacotado na cromatina para diminuir o tamanho da
sua molcula, e para diminuir o tamanho da sua molcula, e para permitir maior controle por parte da clula de
tais genes.
3
Reviso: 29/03/2012
A
.
B
Desoxirribose
Ribose
Base
Fosfato
Base
Fosfato
OH
OH
OH
NH2
N
H
N
H
H
H2N
Adenina (A)
N
H
O
H
Pirimidina
N
H
Guanina (G)
NH2
N
H
HN
Purina
HN
N
H
Citosina (C)
N
H
Uracil (U)
Fig. 4. Estrutura das bases nitrogenadas que compem a molcula de DNA e RNA.
4
Reviso: 29/03/2012
Ligao
Fosfodister
Fig. 5: Esquema ilustrativo do segmento de uma cadeia de DNA e RNA mostrando os nucleotdeos (A= adenina,
C = citosina, G = guanina, T = timina, U = uracila) interligados por uma ligao fosfodister.
5
Reviso: 29/03/2012
Fig. 6: Desenho ilustrativo da estrutura em dupla hlice da molcula de DNA proposta por Watson e Crick.
6
Reviso: 29/03/2012
Fig. 7: Esquema ilustrativo mostrando os dois pares de bases do DNA. As bases complementares so adenina e
timina (A -T) e citosina e guanina (C - G). Observe que entre A - T existem duas ligaes de hidrognio, e entre
C - G so trs ligaes de hidrognio.
7
Reviso: 29/03/2012
8
Reviso: 29/03/2012
9
Reviso: 29/03/2012
Fig. 9: Cdigo gentico. Cada conjunto com trs bases (cdon) determina a entrada de um aminocido
especfico ou marca o fim da sntese na cadeia polipeptdica (cdons em cinza com a denominao STOP em
vermelho). O cdon AUG (marcado em laranja) representa a iniciao de uma cadeia de aminocidos, em
eucariotos.
O dogma central da biologia molecular foi sugerido em 1957 por Crick. Essa teoria
estabelece que o fluxo da informao gentica na clula unidirecional, sendo que o DNA
transcrito em RNA, o qual ento traduzido em protena. Entretanto, dois outros eventos
constituem exceo a essa regra. Primeiro, por ocasio da diviso celular, o DNA copiado
em outras molculas de DNA, em um processo conhecido como duplicao do DNA.
Segundo, alguns vrus, que possuem como material gentico o RNA em vez do DNA (como o
caso do HIV), tm sua molcula de RNA copiada e revertida em DNA em um processo
chamado de transcrio reversa (Fig. 10).
Duplicao
DNA
Transcrio
reversa
Transcrio
mRNA
Traduo
Protena
Fig. 10: Dogma central: estabelece que o fluxo da informao gentica na clula unidirecional. A duplicao do
DNA e a transcrio reversa constituem excees a essa regra.
10
Reviso: 29/03/2012
Duplicao / Replicao
Toda clula ao se dividir, tem seu contedo de DNA duplicado na ntegra, transmitindo
assim, todas as caractersticas genticas, esse processo chamado de replicao. Ela ocorre
de maneira semiconservativa, porque quando as duas fitas originais so separadas, cada uma
vai servir de molde para a construo de uma fita nova.
A fita cpia sintetizada pela ao catalisadora da DNA polimerase III, enzima que
utiliza como molde cadeia precursora e incorpora os nucleotdeos de forma sequencial na
nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases (Fig. 11). Como
essa polimerase sintetiza DNA na direo 5 3, a sntese de uma das cadeias
complementares realizada de forma contnua enquanto que a outra sintetizada
descontinuamente. Os fragmentos da cadeia descontnua so ligados pela enzima DNA
ligase. Muitas outras protenas esto envolvidas na estabilizao e manuteno da
integridade das cadeias simples que so precursoras para a sntese da fita dupla, assim como
no reconhecimento dos stios de iniciao. As DNA polimerases possuem alm da funo de
sintetizar polinucleotdeos, atividade exonuclesica chamada de correo de leitura na qual
os nucleotdeos incorporados incorretamente so removidos. Esta propriedade fundamental
para a manuteno da integridade da sequncia original.
Muito da complexidade inerente replicao de DNA advm do fato de que as duas
cadeias da dupla hlice se orientam em direes opostas ( 5 3 e 3 5) e suas cpias
devem, igualmente, apresentar direes opostas. Ainda, h o alongamento de todas as
cadeias cpias individuais que ocorre na direo 5 3. Esse aparente paradoxo foi
esclarecido com a descoberta de que uma fita cpia construda de forma descontnua, a
partir de pores menores que se alongam, individualmente em direo oposta. Essa
construo necessita de duas enzimas a DNA polimerase I para preencher as lacunas e a
DNA ligase para juntar os fragmentos.
11
Reviso: 29/03/2012
Transcrio
Apenas uma das fitas do DNA transcrita dando origem a uma nica sequncia de
mRNA para cada gene (Fig. 12). A indicao de qual fita deve ser transcrita orientado por
uma sequncia especfica chamada promotor, localizada antes da sequncia a ser transcrita,
que reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetizadora de mRNA). Como a RNA
polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosdeo extremidade 3 da
cadeia de RNA em crescimento, a polimerizao ocorre na direo 5 3 (Fig. 11 e 13). Isso
significa que cada molcula de mRNA ser idntica sequncia nucleotdica da fita de DNA
que no transcrita. O mRNA transcrito transportado para os ribossomos (rRNA) no
citoplasma, onde ocorre a sntese protica.
No caso do retrovrus (como o HIV), a informao gentica segue o sentido inverso
de RNA para DNA esse processo conhecido por transcrio reversa e ocorre devido
presena de uma enzima a transcriptase reversa.
12
Reviso: 29/03/2012
Fig. 12: Esquema ilustrativo da transcrio do DNA, ou seja, formao do mRNA a partir de uma fita de DNA.
Cada sequncia de trs bases nitrogenadas representam 1 cdon.
.
Nos organismos superiores, incluindo o homem, uma regio do DNA com a mensagem
para a sntese de uma cadeia polipeptdica , geralmente, interrompido por certas pores
que no tm funo codificante e, portanto, no aparecem representadas na protena. Tais
pores so referidas como ntrons, enquanto as regies que carregam a informao
codificada para a sntese de protenas so os xons. Quando um arquivo ativado, o RNA
copia fielmente tanto os ntrons como os xons; entretanto, antes de o RNA deixar o ncleo,
as pores correspondentes aos ntrons so removidas, em um evento chamado de
processamento do RNA ou splicing. Dessa forma, no RNA mensageiro, aquele que
efetivamente carrega a mensagem para o citoplasma, est presente somente as pores que
correspondem aos xons (Fig. 13).
Fig. 13: Esquema ilustrativo do processo de transcrio do DNA. As partes em cinza mostram as pores
referidas como ntrons que so retiradas aps o splicing atravs da enzima RNA polimerase.
13
Reviso: 29/03/2012
14
Reviso: 29/03/2012
Fig. 14: Representao grfica do processo de sntese de protena, que ocorre no citoplasma celular.
15
Reviso: 29/03/2012
Fig. 15.:Esquema ilustrativo do vrus HIV mostrando o RNA viral, as protenas que compem o envelope viral e a
enzima transcriptase reversa.
16
Reviso: 29/03/2012
As protenas sintetizadas a partir do gene gag compem o ncleo (core) que envolve
o genoma viral. O gene gag traduzido na forma de uma protena precursora Pr55 gag que
posteriormente clivada para compor as protenas p17 (protena de matriz), p24 (protena
estrutural do capsdeo), p9 (protena do nucleocapsdeo que se liga fortemente ao RNA viral)
e p7. O gene pol tambm traduzido na forma de um precursor, Pr160 gag-pol e codifica para as
enzimas virais: Protease (p10), transcriptase reversa Rnase-H (p51/66) e integrase (p32). O
gene vif (p23), parece atuar aumentando a infectividade, mas sua funo ainda no foi
totalmente elucidada. A funo do gene vpr (p15) codifica os ativadores da transcrio. A
protena p14, codificada pelo gene tat, atua como transativador transcricional, interagindo com
fatores de transcrio celulares e a sequncia TAR viral, promovendo a iniciao e elongao
dos transcritos virais. O gene ver (p19), indispensvel replicao viral, age como
transativador ps-transcricional, ligando-se sequncia RRE viral e fatores celulares,
promovendo splicing e/ou transporte do mRNA viral. O gene vpu (p16) influencia a liberao
das partculas virais e aumenta a reciclagem do antgeno CD4+. O gene env codifica a
glicoprotena precursora gp160, que posteriormente clivada para formar a gp41,
transmembranar, e a gp120, glicoprotena de face externa, responsvel pela ligao do vrus
ao receptor celular. Por fim, o gene nef (p27) potencializa a infectividade viral, mantendo altos
os nveis de infeco.
REPLICAO DO HIV
O principal receptor para a entrada do HIV-1 (subcategoria do vrus HIV) na clula do
hospedeiro o linfcito TCD4+. A infeco tem inicio quando uma partcula viral, que contm
duas cpias de RNA HIV, encontra uma clula com uma molcula de superfcie chamada
CD4. A interao do vrus com a membrana celular feita pela ligao da gp 120 ao receptor
CD4 da clula hospedeira, porm co-receptores (quimiocinas CCR5 e CXCR4 - mediadores
ou regulares de processos inflamatrios com habilidade de recrutar e ativar subpopulaes
especficas de leuccitos) ou receptores secundrios so tambm necessrios para a entrada
do vrus na clula.
Quando o gene que codifica o CCR5, apresenta uma deleo mutante, o receptor
celular codificado por esse gene fica estruturalmente alterado. A condio de homozigose
est associada a um efeito protetor infeco pelo HIV-1. A condio de heterozigose, apesar
de no proteger o indivduo da infeco, est associada no progresso, ou perodos de
latncia clnica mais prolongados.
17
Reviso: 29/03/2012
Embora as clulas TCD4+ paream ser o principal alvo para o HIV, outras clulas do
sistema imune com molculas CD4 em suas superfcies tambm so infectadas. Entre elas
esto os moncitos e macrfagos, que podem hospedar grandes quantidades de vrus sem
serem mortos, desse modo, atuam como reservatrios.
Aps a interao da membrana do envelope viral com a membrana celular, ocorre uma
alterao conformacional que expe um peptdeo de fuso a gp41. O capsdeo viral ento
liberado no citoplasma da clula hospedeira.
Por ao da transcriptase reversa do vrus, no citoplasma da clula, a fita de RNA
serve de molde para a transcrio reversa de duas fitas complementares de DNA viral
(cDNA). O cDNA viral (fita dupla) transportado para o ncleo, e incorporado ao genoma da
clula hospedeira pela ao da integrase, e passa a ser denominado provrus (DNA do HIV
incorporado aos genes da clula hospedeira. Em um mesmo organismo o provrus pode, em
algumas clulas, permanecer em latncia e no dar sinal de sua presena. Em outras clulas,
o processo replicativo pode ser lento com multiplicao controlada, ou acelerado levando
lise celular). Para que o DNA proviral produza novos vrus, cpias de RNA devem ser feitas.
O provrus, para se replicar, subverte a maquinaria celular e passa a comandar os
mecanismos enzimticos da clula hospedeira. Isso significa dizer que as enzimas celulares
passam a trabalhar na sntese de RNAs genmicos mensageiros (RNAm) e na sntese de
protenas virais.
As citocinas, protenas envolvidas na regulao normal da resposta imune, podem
tambm regular a transcrio. Molculas como fatores de necrose podem tambm regular a
transcrio. Molculas como fatores de necrose tumoral alfa (TNF-) e interleucinas (IL)-6,
secretados em nveis elevados pelas clulas de pacientes HIV positivos, podem auxiliar na
ativao do DNA proviral.
O mRNA viral transportado do ncleo celular para o citoplasma e comea a traduo
das protenas virais, utilizando a maquinaria celular de sntese protica. O prximo passo a
montagem da partcula viral (protenas e RNAs virais) e o ancoramento da partcula
membrana plasmtica da clula hospedeira. Uma partcula viral imatura formada e ao aderir
membrana celular, adquire um envelope. Ocorre o brotamento do vrus imaturo de forma
intensa
provocando
destruio
da
clula
hospedeira.
Durante
este
ponto
do
amadurecimento feito pela ao da protease viral que cliva as longas cadeias de protenas e
enzimas que constituem o ncleo em pedaos menores. Essa clivagem resulta em partculas
virais infecciosas (Fig. 16).
18
Reviso: 29/03/2012
A.
B.
Figura 16: A: Imagem ilustrativa do HIV (representado pelos crculos verdes) infectando uma clula. B: Infeco
pelo HIV-1 atravs da ligao gp120 (envelope viral) receptores CD4 e CCR5 (clula hospedeira) (Fase 1).
Citoplasma, transcrio reversa da fita de DNA complementar ao RNA viral pela transcriptase reversa (Fase 2).
Ncleo, insero do DNA pr-viral ao DNA da clula hospedeira, (integrase do HIV) (Fase 3). Ativao celular,
transcrio de cpias do RNA viral (RNA polimerase humana), sntese de protenas e glicoprotenas virais bem
como cpias ntegras do RNA genmico do HIV (Fase 4). Por fim, empacotamento do RNA viral seguido de
brotamento da clula hospedeira (Fase 5), dando incio a disseminao da infeco de novas clulas.
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Reviso: 29/03/2012
CARGA VIRAL
O nmero de partculas virais presentes em uma determinada amostra de um indivduo
infectado conhecido como carga viral.
A carga viral plasmtica, detectada na forma de RNA do HIV, reflete a dinmica desse
vrus nos indivduos infectados, quantificando as partculas que esto sendo produzidas e
lanadas na circulao sangunea.
O nvel de RNA do HIV no plasma um marcador clnico importante. O nmero de
partculas virais mais elevado durante a infeco primria e mais baixo na fase
assintomtica. Existe uma relao direta entre a quantidade de HIV detectada e a rapidez com
que a infeco progride. Nveis elevados de replicao do vrus e o aumento da carga viral
esto associados deteriorao acelerada do sistema imune (Fig. 17). O colapso do sistema
imune, que antecede o aparecimento da AIDS, resultado da destruio das clulas CD4+ e
das alteraes imunitrias provocadas pelo vrus.
Fig. 17: Grfico representativo da contagem de linfcitos TCD4+ e da carga viral, ao longo da infeco pelo HIV.
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Reviso: 29/03/2012
Fig. 18: Representao do vrus da hepatite C, que um vrus RNA da famlia Flaviviridae de 50 nm de dimetro.
21
Reviso: 29/03/2012
viral. Esta sequncia conservada, aliada ao fato de conter uma estrutura secundria que a
torna mais resistente digesto por ribonucleases (RNAses), torna esta regio como a melhor
para seleo de primers para a biologia molecular com fins de deteco deste vrus em
amostras provenientes de diferentes regies do mundo.
Uma pequena regio no traduzida na extremidade 3 tambm est presente,
possuindo uma cauda de poli-A caracterstica. Esta pequena regio, no traduzida, apresenta
estruturas secundrias que parecem ser bem conservadas, podendo ter um significado
importante durante a replicao genmica do vrus, pois nela que ocorre a ligao da
sequncia complementar enzima replicase. Porm, observou-se que, quando ocorrem
variaes na sequncia genmica desta regio, pode haver diminuo da eficincia de ligao
da replicase, bem como alterao na replicao viral. Tais fatos podem ser parcialmente
responsveis pelos diferentes nveis de patogenicidade do vrus da hepatite C e tambm pela
sensibilidade ao interferon.
As protenas estruturais do HCV so trs: protena C encontrada na extremidade Nterminal e duas glicoprotenas E1 (GP 33) e E2/NS1 (GP 72), provveis constituintes do
envelope viral. A E1 uma protena matriz e a outra, E2/NS1, provavelmente anloga
glicoprotena principal do envelope dos pestivrus.
As protenas no estruturas NS2, NS3, NS4 e NS5 representam a extremidade carboxiterminal do genoma viral. NS2 e NS4 so protenas hidrofbicas e, portanto devem estar
ligadas membrana da clula hospedeira. NS3 tem pelo menos duas funes; helicase, no
desdobramento do genoma viral durante a replicao, e protease participando na clivagem de
protenas no estruturais a partir do precursor. A protena NS5 contm pelo menos a funo
de RNA replicase RNA dependente, mas deve ser multifuncional.
A anlise filogentica das sequncias genmicas permitiu a caracterizao de 6
gentipos (1 a 6) que so subdivididos em grupos a, b, c, etc. Dentro de um mesmo gentipo
e subtipo podemos ainda ter variaes do HCV, que so denominadas quasispcies. Isso
possvel devido replicao imperfeita do vrus, com o surgimento de pequenas e constantes
mutaes. A maior ou menor diversidade das quasispcies parece estar relacionada com a
presso imunolgica, j que costuma ser pequena nas fases iniciais da doena, com
aminotransferases normais, sendo de alta heterogeneidade nos casos de doena heptica
mais avanada e/ou baixa resposta teraputica.
O tempo de incubao da hepatite C mostra-se bastante varivel, de 1 a 13 meses,
com mdia de 8. Logo aps a contaminao, o melhor marcador e nico disponvel at o
presente a determinao do RNA-HCV, j que os anticorpos surgem apenas 4 a 20
semanas aps o contgio.
Elaborado pela DIACM
Aprovado por Linda Khalili Boukai
22
Reviso: 29/03/2012
REPLICAO DO HCV
O vrus da hepatite C replica principalmente nos hepatcitos do fgado, onde
estimado que cada clula infectada produza diariamente cerca de cinquenta partculas virais
com um total calculado de um trilho de partculas virais geradas. O vrus tambm pode se
replicar em clulas mononucleares de sangue perifrico, contribuindo potencialmente para os
altos nveis de distrbios imunolgicos encontrados em pacientes infectados pelo HCV
cronicamente. O HCV tem uma grande variedade de gentipos e sofre mutaes rapidamente
devido a uma alta taxa de erro por parte do vrus "dependente de RNA-polimerase do RNA. A
entrada nas clulas do hospedeiro ocorre atravs de interaes complexas entre os virions
(partcula viral) e as molculas da superfcie de clulas.
Uma vez dentro do hepatcito, o HCV assume parcelas da mquina intracelular para
replicar. A dinmica de replicao do HCV pode ser deduzida a partir das rpidas taxas de
produo de vrus e emergncia de mutantes. Outra caracterstica da replicao do HCV a
gerao rpida de variantes de vrus. Mesmo dentro de um paciente HCV no existe como
uma entidade nica, mas sim como um enxame de microvariants de predomnio de, um
fenmeno que tem sido referido como quasispecies (para uma reviso ver Holanda et al.,
1992).
A deteco de anticorpos anti-HCV pode ser realizada inicialmente por mtodos de
elevada sensibilidade (100%) e especificidade (entre 99,6% a 99,84%), como o
enzimaimunoensaio (ELISA) e o enzimaimunoensaio de micropartculas (MEIA), que
empregam peptdeos sintticos do VHC. Posteriormente, os resultados reagentes obtidos nos
mtodos de triagem devem ser confirmados por mtodos de elevada especificidade, como o
recombinant immunoblot assay (RIBA) ou Western Blot (WB), a deteco de RNA viral pela
reao em cadeia da polimerase (PCR) qualitativa e quantitativa e a tcnica do cido
desoxirribonuclico (DNA)-branched (bDNA).
23
Reviso: 29/03/2012
TRANSMISSO
Demonstrou-se que o HCV o agente causal de mais de 90% das hepatites pstransfusionais. Assim, todas as pessoas que receberam transfuso de sangue ou
hemocomponentes at o incio dos anos 90, com ou sem histria de hepatite pstransfusional, devem ser avaliadas para provvel contaminao com o vrus da hepatite C. No
Brasil, a partir de 1993, h a obrigatoriedade dos testes sorolgicos (anti-HCV) em candidatos
a doadores de sangue. Assim, a hepatite ps-transfusional tornou-se rara, mas outros meios,
parenterais ou no, continuam a disseminar a doena. Alm dos produtos do sangue,
agulhas/seringas contaminadas ou mesmo a inalao de drogas com o uso de espelhos e
canudos contaminados so vias importantes.
Outras formas parenterais de contaminao so os procedimentos mdicos,
odontolgicos, acupunturistas ou tatuagens. Portanto, qualquer material cortante ou
perfurante pode ser veculo transmissor do vrus de uma para outra pessoa, como o alicate da
manicura, a lmina do barbeiro ou mesmo a escova de dentes, compartilhada por cnjuges ou
filhos. Em nosso meio, demonstramos que dentre os casos eventualmente rotulados como
espordicos por serem afastados transfuso de sangue ou o uso de drogas ilcitas houve uma
porcentagem significativa de pacientes com cirurgias prvias e/ou atendimentos mdicos de
urgncia em prontos-socorros ou ainda a hiptese j confirmada de contaminao mdica
durante o ato cirrgico.
Dentre as formas no parenterais de transmisso da hepatite C torna-se importante
ressaltarmos a possibilidade da transmisso sexual. Embora pouco eficiente, deve-se
examinar e alertar o parceiro sexual, particularmente nos indivduos promscuos, para os
quais mandatrio o uso de preservativos. Aos casais monogmicos de longa data, sem
doenas sexualmente transmissveis, facultativo o uso continuado de preservativos, sendo
possvel a gravidez. A disseminao intrafamiliar tambm pode existir, possivelmente por
compartilharem materiais cortantes ou ento pela exposio de ferimentos abertos. A
transmisso materno-fetal revela-se pouco significativa na hepatite C, podendo ocorrer
particularmente no momento do parto. No existe profilaxia para o recm-nascido, que ter o
anti-HCV da me nos primeiros 6 a 12 meses de vida. Os anticorpos costumam desaparecer
nesse perodo, podendo haver verdadeira contaminao com permanncia do RNA-HCV em
raros casos, principalmente quando a co-infeco HCV e HIV.
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Reviso: 29/03/2012
CARGA VIRAL
Existem vrios mtodos para medir a concentrao do vrus no soro, que uma
avaliao indireta da carga viral. Estes mtodos incluem o PCR (Polimerase Chain Reaction)
quantitativo e em tempo real, que sero discutidos posteriormente. Os nveis de HCV RNA
so normalmente bastante estveis, embora possam variar de forma espontnea, 3 a 10
vezes ao longo do tempo. Esses ensaios quantitativos podem fornecer importantes dados
sobre a natureza da hepatite C. A maioria dos pacientes com hepatite C crnica tm nveis de
HCV RNA (carga viral) entre 100.000 (105) e 10 milhes (107) cpias / mL. Expressos em IU,
estas mdias so de 50.000 a 5.000.000 UI.
As taxas de resposta a um curso de peginterferon e ribavirina so maiores em
pacientes com baixos nveis de HCV RNA. H vrias definies de "baixo nvel" do RNA do
HCV, mas a definio usual de 400.000 UI (~ 1 milho de cpias / mL) ou menos.
No incio da infeco observar-se um aumento no nvel da carga viral e ao redor do 70
dia aps a infeco, h o incio da produo de anticorpos e consequentemente uma
diminuio da carga viral no paciente.
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Reviso: 29/03/2012
Princpio da tcnica
A tcnica explora funo natural da enzima Taq polimerase, esta enzima semelhante
enzima DNA polimerase que capaz de sintetizar DNA a partir de seus precursores no
sentido 5 3. Para catalisarem essa sntese, os precursores de DNA devem estar presentes
sob a forma de deoxirribonucleotdeos trifosfatos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP).
Esta consiste em ciclos de reaes de sntese de regies especficas do DNA (gene ou
parte dele), na qual a cada ciclo o nmero de fragmentos duplicado, havendo assim um
crescimento exponencial do fragmento desejado.
Hoje, a PCR se constitui no mtodo diagnstico de rotina para isolar rapidamente
sequncias especficas a partir de uma mistura complexa de sequncias genmicas ou de
DNA complentares (cDNAs), DNA gerados a partir de uma sequencia de um RNA
mensageiro.
Elaborado pela DIACM
Aprovado por Linda Khalili Boukai
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Reviso: 29/03/2012
Cintica da reao
A PCR realizada em trs etapas, repetidas em ciclos. Cada etapa desenvolvida a
uma temperatura apropriada para sua maior eficincia, as etapas so:
Fig 20. Representao grfica da separao das fitas do DNA durante o processo de desnaturao (95C), na
qual ocorre o rompimento das pontes de hidrognio.
Iniciador 1
Iniciador 2
Fig 21. Representao do anelamento dos pares de iniciadores complementares aos flancos da sequncia alvo
na faixa de 55C a 65C, durante a PCR.
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Reviso: 29/03/2012
Taq DNA
Polimerase
3
Fig. 22. Representao da etapa de extenso da fita no sentido 53 com incorporao de deoxinucleotdeos
presentes no meio pela Taq-polimerase.
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Reviso: 29/03/2012
Condies da PCR
Inibidores da PCR podem ter origem na prpria amostra ou nos reagentes usados na
coleta e no preparo desta. Substncias tais como grupamentos heme presentes no sangue
total, produtos da lise das clulas vermelhas, bilirrubina, bile e sais inibem a PCR ou podem
ainda degradar o cido nucleico de amostras biolgicas como clulas do sangue perifrico,
tecido animal e fluidos corporais, incluindo, fluido crebro-espinhal, material de bipsia, entre
outros.
Uria, detergentes (SDS), acetato de sdio, heparina, fenol entre uma grande
variedade de compostos orgnicos e inorgnicos podem ser inibidores da reao de PCR por
interferir no funcionamento da DNA polimerase na reao. Como exemplo, podemos citar o
magnsio (Mg+2), que um ction presente na reao de PCR que se liga DNA polimerase,
sendo um co-fator essencial para a atividade da enzima. Esta concentrao precisa ser tima,
pois em falta na reao, acarretar formao de menor quantidade de produtos, e, em
excesso, reduzir a fidelidade do resultado por formao de produtos inespecficos (aumento
da taxa de erro). Por este motivo, substncias quelantes de ctions divalentes como o EDTA
podem interferir reduzindo a atividade da enzima.
O tempo e a temperatura de armazenamento da amostra podem tambm impactar
significativamente na recuperao dos cidos nucleicos e na eficincia dos procedimentos
subsequentes.
Os laboratrios de biologia molecular precisam ter uma estrutura que permita um
perfeito fluxograma de trabalho, com reas dedicadas. Cada estao possui seus prprios
equipamentos, as superfcies devem ser lisas e construdas de forma a facilitar a limpeza.
Programas de qualidade devem incluir verificao peridica dos equipamentos, como
manutenes mensais, trimestrais e ou semestrais usualmente realizadas pelas empresas
parceiras. Manutenes dirias e semanais so executadas pelos operadores. Nestas
manutenes esto inclusos os procedimentos de limpeza, descontaminao e algumas
outras verificaes, dependendo do equipamento.
Finalmente, o resultado da PCR baseado na presena ou no do produto amplificado
em eletroforese em gel de agarose, ou na visualizao de resultados grficos captados em
sistema ptico.
Para garantir que um resultado negativo ou no, deve-se ter a certeza de que a
ausncia de bandas, ou de fluorescncia, devido ausncia de DNA molde, e no falhas
na reao. Para tanto, deve-se considerar utilizar um controle interno de amplificao nas
reaes. Os controles nas reaes de PCR so verificados a partir da amplificao de uma
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Reviso: 29/03/2012
PCR Multiplex
A PCR Multiplex uma reao onde vrias regies diferentes de DNA (ou c-DNAs) so
amplificadas ao mesmo tempo. Isto possvel devido a utilizao simultnea de diversos
pares de iniciadores especficos para cada locus a ser identificado sem que eles possam
hibridizar entre si. Se a temperatura de anelamento for semelhante e os diferentes amplicons
produzidos apresentarem tamanhos distintos, possvel que o diagnstico atravs de uma
PCR multiplex seja realizado. A vantagem a economia de reagentes e tempo, visto que,
duas reaes ou mais podem ser realizadas conjuntamente.
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Reviso: 29/03/2012
Fig. 23. Grfico representando uma amostra positiva para um alvo especfico, na qual a fluorescncia gerada
pela amplificao do produto e as trs fases da PCR em tempo real.
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Reviso: 29/03/2012
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Reviso: 29/03/2012
Biossegurana
Materiais biolgicos tais como sangue, soro e clula so potencialmente infectantes e
muitas vezes esto contaminados com agente etiolgicos diferentes do que se est
pesquisando, ou ainda desconhecidos. Por isso fundamental que medidas de biossegurana
adequadas sejam adotadas nos laboratrios onde h manipulao desses materiais.
Equipamentos de Proteo Individual (EPI) devem ficar em lugar de fcil acesso aos
funcionrios do laboratrio.
culos de segurana, protetor facial e mscara descartvel usadas sempre que
houver possibilidade de aerossis.
Jaleco longo de mangas compridas e punho retrtil, preferencialmente descartvel
deve ser usado somente dentro da rea do laboratrio.
Luvas descartveis devem ser resistentes, de material sinttico (vinil) ou latex para
manipulao de matrias potencialmente infectantes. As luvas descartveis, usadas
para os procedimentos da tcnica PCR devem ser isentas de talco.
Pipetas automticas devem estar calibradas e validadas.
Props descartveis
Calados fechados e de material resistente.
Equipamento de Proteo Coletiva (EPC) so utilizados para minimizar a exposio dos
funcionrios ao risco e em caso de acidentes, reduzir suas conseqncias.
Chuveiro de emergncia e lava-olhos devem estar instalados prximos ao ambiente
laboratorial.
Extintores de incndio.
Centrifugas com rotor provido de tampa.
Cabines de segurana biolgica classe II devem ser posicionadas longe de portas,
janelas e de equipamentos que de alguma forma promovam a movimentao do ar,
empurrando ar no filtrado, diretamente para a superfcie de trabalho, podendo assim
contaminar o material que est sendo manipulado.
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Reviso: 29/03/2012
Formato do Kit
Componentes e Apresentao do Kit
Relao dos componentes fornecidos com o produto:
MDULO
Controles
Extrao
Amplificao
COMPONENTES
VOLUMES
Controle Positivo
Controle Negativo
Partcula Calibradora
Tampo de Lise
01 Frasco com 33 mL
Carreador de RNA
01 Frasco liofilizado
Tampo de Lavagem 1
01 Frasco com 83 mL
Tampo de Lavagem 2
01 Frasco com 68 mL
Tampo de Eluio
Fluido TE
Placa de Vcuo
01 Unidade de 96 poos
Placa de Eluio
01 Unidade de 96 poos
Placa de Reao
01 Unidade de 96 poos
Protease
01 Frasco liofilizado
Solvente de Protease
01 Frasco com 6 mL
Recipientes Descartveis
02 Unidades
Placa ptica
01 Unidade
Selo ptico
01 Unidade
Tubo de 5 mL
01 Unidade
Manual de Instruo
01 Unidade
Carto Bio
01 Unidade
Mistura de PCR
Enzima RT
gua/DEPC
Sondas
Iniciadores
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Reviso: 29/03/2012
Material de reposio
gua destilada
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Reviso: 29/03/2012
O teste deve ser usado somente para monitoramento in vitro e uso profissional,
de acordo com as instrues fornecidas no kit;
Utilizar equipamento de proteo individual (EPI) tais como luvas descartveis (sem
talco) e jaleco em todas as etapas do teste;
Os tubos com amostras devero ser colocados em saco vermelho duplo (descarte
de risco biolgico) e encaminhados para um local apropriado para resduos. De acordo
com a poltica de descarte de cada hemocentro;
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Reviso: 29/03/2012
A coleta das amostras de sangue perifrico deve ser feita, preferencialmente, em tubo
PPT contendo anticoagulante K2 EDTA e gel de poliester para separao de plasma e
frao celular do sangue total. Coletar 5 mL de sangue total;
Centrifugar o tubo at oito horas aps a coleta 800g (em uma centrfuga com 100
mm de raio, corresponde a 2700 rpm) por 10 minutos;
No congelar o tubo aps a coleta, pois o gel pode se desprender e alterar a carga
viral do paciente;
No devero ser aceitas amostras que no forem coletadas no tubo BD PPT contendo
anticoagulante K2 EDTA e gel de polister;
A temperatura do espao fsico destinado ao teste deve ser monitorada e mantida entre
15 e 25C.
37
Reviso: 29/03/2012
38
Reviso: 29/03/2012
Fluxo Metodolgico
(a) Preparo amostras em pool de seis ou individual (quando um pool de amostras
apresentar resultado positivo, as amostras que formaram o pool sero testadas
individualmente (teste single);
(b) Extrao e Purificao de cido nuclico da amostra biolgica (plasma);
(c) Amplificao do cido nuclico;
(d) Deteco do mesmo por PCR em tempo real.
Esquema do Teste:
Amostra
Biolgica
Extrao
MDx
Pool
Janus
Amplificao
ABI 7500
Deteco
ABI 7500
Mistura de PCR
Janus
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Reviso: 29/03/2012
40
Reviso: 29/03/2012
Etapas e Equipamentos:
A. Preparo do Pool - JANUS
B. Extrao - BioRobot MDx
C. Preparao e pipetagem da reao de PCR - JANUS
D. Amplificao e deteco Termociclador ABI 7500
E. Processamento de Dados e resultados
A) Preparo do Pool
Para realizar o preparo do pool, com 6 amostras, equivalente a uma placa com 96
poos, utiliza-se 100 L de cada uma das 552 amostras primrias. Cada amostra primria
deve ser coletada em tubos dedicados ao NAT de flebotomia a vcuo do tipo PPT (K2 EDTA,
com gel de polister para separao de plasma e frao celular do sangue total). A
transferncia feita, gerando tubos secundrios (tubos de poliestireno de 15 ml), onde ser
adicionada a partcula calibradora.
Quando ocorrer resultado positivo para o pool todas as 6 amostras que o compem
sero obrigatoriamente re-testadas individualmente (single).
41
Reviso: 29/03/2012
Procedimento
1) Utilizao do Janus
Na rea de trabalho, abrir o programa com duplo clique no cone WinPREP for JANUS
(Fig. 28).
Fig. 28: Detalhe do cone do programa WinPREP for JANUS na rea de trabalho.
Quando encher o galo com gua destilada, prestar ateno se o conector esta bem
encaixado ao sistema para evitar falhas no seu reconhecimento.
42
Reviso: 29/03/2012
Fig.29: Tela do programa WinPrep, com as opes selecionadas em azul que precisam ser clicadas para a
inicializao do rob.
Fig. 30: Detalhe do cone do programa JANUS Application Assistant na rea de trabalho.
43
Reviso: 29/03/2012
44
Reviso: 29/03/2012
B
Fig. 30: Mangueiras do equipamento Janus. Essas so verificadas com relao a presena de bolhas. A) As
setas indicam bolhas no sistema; B) Visualizao das mangueiras localizadas no brao robtico.
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Reviso: 29/03/2012
Ateno ao sentido dos tubos primrios nas estantes. A leitura dos tubos feita de
trs (fundo do aparelho) para frente. Sendo assim, o tubo n 1 aquele que est na
ltima posio na estante 1A (Fig. 34).
Fig. 31: A) Estante com os tubos primrios do equipamento Janus, numerados de 1 a 9. possvel notar que a
estante 10 est vazia (s utilizada para abertura de pool) e as estantes 11 e 12 esto com os tubos secundrios.
B) Esquema ilustrativo mostrando a posio dos tubos primrios na estante do Janus. Notar que a numerao
comea de trs para frente (sensor do brao do laser) para frente (frente do equipamento).
46
Reviso: 29/03/2012
Fig. 32: Posio correta dos tubos nas racks. As etiquetas com os cdigos de barras devem sempre ficar
voltadas para a janela esquerda das racks. A Tubos Primrios. B Tubos secundrios.
Fig. 33: Mesa de trabalho do equipamento Janus. Setas azuis apontam para os locais onde so colocadas as
caixas de ponteiras de 175 L.
47
Reviso: 29/03/2012
Fig. 34: Suporte para os flaconetes de partcula calibradora na mesa do Janus. Os dois flaconetes de partcula
calibradora devem ser posicionados nas duas primeiras posies no lado esquerdo.
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Reviso: 29/03/2012
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Reviso: 29/03/2012
Na aba Gather, ir aparecer todos os itens que sero utilizados neste protocolo. Clicar
em Next Step ou ir diretamente para a aba 4.Run.
Fig. 36: Lista dos itens que so necessrios para a realizao do protocolo de Pooling de Amostras.
50
Reviso: 29/03/2012
Na aba Place est indicado localizao correta de cada um dos itens. Clicar em Next
Step.
Fig. 37: Tela indicando as posies de cada item necessrio ao protocolo de pooling de amostras.
51
Reviso: 29/03/2012
Na aba Run para executar a rotina. Ao selecionar Start dentro da janela principal.
Abrir uma janela Status (Fig. 41), a finalidade desse passo informar para o equipamento o
nmero de ponteiras a serem utilizadas. Dentro da aba Reset Tip Boxes, clicar no primeiro
item Disposible Tips1 e selecionar Fill nas opes do lado direito. Proceder da mesma forma
at o ltimo Disposible Tips. Ao final clicar em OK (seta azul). Sero 9 caixas de tip no total,
apesar de nesta etapa o equipamento utilizar somente 7 caixas, encher todas as caixas nesta
etapa. O valor correto 96/0.
Fig. 38: Tela onde informado para o equipamento o nmero de ponteiras a serem utilizadas em suas devidas
posies.
Abrir a janela onde ser includo o quantitativo de amostras a serem realizadas na rotina
(Fig.42). No campo Nmero de amostras possveis positivas dever ser informado o
quantitativo de amostras em single (seta verde), no campo nmero de amostras primrias
dever ser informado o quantitativo de amostras que sofrero o pooling (seta vermelha). Aps
incluir essas informaes clicar em Mapa de amostras. O Software ir mostrar o desenho
das racks. Aps carregar o equipamento conforme o exposto no mapa, clicar em Atualizar
(seta azul). O equipamento far a leitura dos cdigos de barras dos tubos.
52
Reviso: 29/03/2012
Fig. 39: Tela do Mapa de amostras, nesta tela aparecer o perfil de preenchimento da primeira carregada, os
perfis das outras carregadas iro aparecer ao final de cada etapa.
Aps a leitura dos cdigos de barras, o software ir indicar se h tubos faltando, tubos
extra e duplicatas de cdigos de barras dos tubos secundrios. Quando h qualquer problema
de leitura dos cdigos de barras, essa janela de gerao de mapa aparecer novamente.
Clicar em Atualizar (seta azul) para abrir a janela de releitura (Fig. 43).
53
Reviso: 29/03/2012
A coluna Lane (Fig. 43) informa qual a rack onde o tubo no foi lido, a coluna Posio
informa qual a posio da rack se encontra o tubo que no foi lido. Para fazer a releitura
selecionar a linha com a falha na leitura, ler o cdigo de barras com o leitor manual ou digitar
o mesmo. Quando reler todos os cdigos, certifique-se de que as racks esto todas
posicionadas corretamente na mesa de trabalho do equipamento Janus e selecione Atualizar.
Aps o trmino da primeira etapa de preparo de 23 pools de seis amostras (a partir de 138
tubos primrios). Retirar as estantes contendo os tubos primrios A e carregar o equipamento
com as estantes B. Retirar as estantes contendo os tubos secundrios TS1A e TS2A e
carregar o equipamento com as estantes TS1B e TS2B. Clicar em Next
Aps o trmino desta etapa, substituir as estantes conforme descrito acima seguindo o
sequencial C e posteriormente as racks com a letra D.
N Amostras
Pools
552
516
480
444
408
372
336
300
264
N Amostras
Singles
-6
12
18
24
30
36
42
48
54
Reviso: 29/03/2012
Caso haja necessidade da realizao de duas rotinas no mesmo dia, utilizando apenas
uma plataforma, devem-se seguir as seguintes orientaes:
- Iniciar a segunda rotina aps ter passado uma hora de durao no MDx da primeira rotina.
- O protocolo da Reao de PCR da primeira rotina pode ser efetuado logo aps o pooling da
segunda, no haver conflito de informaes, desde que os cdigos de barras dos tubos
secundrios sejam diferentes.
* Se ao trmino da etapa de extrao da primeira rotina no MDx, o Janus ainda estiver realizando
o pooling das amostras da segunda, colocar a placa de RNA da primeira, no freezer a -80C at o
momento de iniciar a reao de PCR Setup. CERTIFIQUE-SE que a placa esteja totalmente
descongelada.
- Iniciar a reao de PCR da segunda rotina, apenas quando estiver faltando 20 minutos para
terminar a reao de amplificao da primeira, no equipamento ABI7500.
55
Reviso: 29/03/2012
56
Reviso: 29/03/2012
B) EXTRAO
A extrao totalmente automatizada pelo Biorob MDx (Qiagen) (Fig. 36) e utiliza
tecnologia com alta recuperao de cido nuclico, baseada nas propriedades de ligao
seletiva da membrana de slica. As amostras so lisadas com tampo de lise e protease sob
condies desnaturantes (a temperatura de 56C). O etanol auxilia na precipitao do
material. O carreador permite a perfeita ligao do lisado membrana de slica. O material
gentico absorvido pela membrana atravs de uma etapa de vcuo. O cido nuclico ligado
membrana, passa por trs etapas de lavagem sob vcuo para a purificao. A primeira
realizada com a adio do Tampo de Lavagem 1 e subseqente vcuo (o equipamento pede
a verificao visual de cogulos), em seguida realiza-se a adio do Tampo de Lavagem 2 e
vcuo (as condies de sal e pH dos tampes de lavagem garantem a retirada das diferentes
impurezas e dos inibidores de PCR das amostras), posteriormente adiciona-se etanol e
realizado mais um vcuo. Antes da eluio, a membrana de slica passa por uma secagem
onde o etanol restante ajuda na desidratao da placa.
Aps todas essas etapas o produto final eludo livre de albumina srica, outras
protenas, nucleases, sais inorgnicos e orgnicos e outros possveis interferentes.
PROCEDIMENTOS
2. Utilizao do MDx:
Ligar o computador do equipamento de extrao MDx.
57
Reviso: 29/03/2012
58
Reviso: 29/03/2012
Power
Pump
System
Waste
Vacuum
Fig. 45: Parte de trs do equipamento MDx. Mostrando em detalhes as 5 luzes verdes. Que so: Power
(energia), Pump (bomba), System (sistema), Waste (descarte), Vacuum (vcuo).
Preparar o equipamento MDx, seguindo as instrues do software QIAmp One for all MDx
cV98 para preparo dos reagentes e da mesa de trabalho.
59
Reviso: 29/03/2012
Na tela abaixo (Fig.50) ler o cdigo de barras do carto BIO, que vem dentro de cada
mdulo de extrao. (Fig. 51).
Figura 47: Janela do programa QIAsoft MDx, para a leitura do cdigo de barras do Carto Bio que vem dentro do
mdulo de extrao do kit NAT.
.
Figura 48: A) Leitor de cdigos de barras que fica ao lado do computador. B) Carto Bio com o cdigo de barras.
60
Reviso: 29/03/2012
A.
B.
Fig. 49: A) Tela com Instrues gerais mostrando a etapa de reposio de gua destilada do sistema.
B) Inserido fotografia do galo de gua destilada, dentro do armrio embaixo do equipamento.
A..
B.
Fig. 50: A) Tela com Instrues gerais mostrando a etapa de descarte de gua do sistema (sem risco
biolgico). B) Inserido fotografia do galo de descarte de gua.
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Reviso: 29/03/2012
A.
B.
Figura 51: A) Tela com Instrues gerais mostrando a etapa de descarte biolgico (Vacuum Trap) e do frasco
de condensao. B) Inserido fotografia do galo de descarte biolgico.
Fig. 52: Sistema de reposio e descarte de lquidos. Setas indicam as conexes dos gales que precisam ser
verificadas.
.
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Reviso: 29/03/2012
Figura 56: Tela com instrues para colocar o saco de descarte de ponteiras.
Figura 57: Tela com instrues para reconstituio dos tampes e do etanol.
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Reviso: 29/03/2012
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Reviso: 29/03/2012
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69
Reviso: 29/03/2012
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Reviso: 29/03/2012
Figura 69: Tela com instrues para montagem da mesa de trabalho, placa de eluio.
71
Reviso: 29/03/2012
Figura 71: Tela com instrues para montagem das amostras na mesa de trabalho.
72
Reviso: 29/03/2012
Figura 7253: Fotografia das racks do MDx. Setas azuis apontam para a posio onde sero encaixados os tubos
secundrios do controle negativo. Setas vermelhas apontam para as posies onde sero encaixados os tubos
secundrios de controle positivo. As outras posies correspondem s amostras.
Controle
Negativo
Controle
Positivo
Posio 5
1 tubo
secundrio
Figura 543: Esquema ilustrativo das 12 racks do MDx. Em azul representa a posio dos tubos do controle
negativo e em vermelho a posio dos tubos dos controles positivos.
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Reviso: 29/03/2012
Fig.75: Janela de checagem de cogulos. A caixa de texto diz: Verifique a placa de vcuo. Voc pode ver algum
poo com cogulo?
74
Reviso: 29/03/2012
Figura 76: Janela para o usurio marcar a posio do(s) poo(s) com cogulo.
75
Reviso: 29/03/2012
Figura 78: Tela com instrues para descarte dos materiais da mesa de trabalho.
Figura 79: Tela com instrues para retirada dos acessrios lavveis da mesa de trabalho.
76
Reviso: 29/03/2012
77
Reviso: 29/03/2012
Figura 81: Tela com instrues para descarte dos tampes e etanol.
78
Reviso: 29/03/2012
Figura 84: Tela com instrues para retirada do saco de descarte de ponteiras.
79
Reviso: 29/03/2012
80
Reviso: 29/03/2012
Fig. 86: Desenho Ilustrativo das posies dos reagentes. Circulo A: Iniciadores, Crculo B: Sondas, Crculo C:
Enzima RT, Crculo D: Mistura de PCR, Crculo E: gua DEPC.
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Reviso: 29/03/2012
82
Reviso: 29/03/2012
Na aba Gather, ir aparecer todos os itens que sero utilizados neste protocolo. Clicar
em Next Step ou ir diretamente para a aba 4.Run.
Fig.88: Listagem de todos os itens necessrios para realizao do protocolo de Reao de PCR.
Na aba Place est indicado a localizao correta de cada um dos itens. Clicar em Next
Step (seta verde).
Fig. 89: Tela indicativa das posies de cada item necessrio para reao de PCR.
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Reviso: 29/03/2012
Abrir uma janela Status, dentro da aba Reset Tip Boxes, verifique se o Disposible Tips 8
e 9 esto completos (96/0). Se estiver, selecione OK; se no estiver selecione cada um,
clique em Fill e em OK.
Figura 91: Tela onde informado para o equipamento o nmero de ponteiras a serem utilizadas em suas devidas
posies.
84
Reviso: 29/03/2012
Abrir a tela para ser inserido o cdigo de barra da placa de PCR (seta azul). Ler o cdigo
de barras da Placa de reao (ptica) com leitor manual do equipamento Janus. Clicar em
OK (seta vermelha) (Fig. 92).
Fig. 92: Tela que solicita a insero do cdigo de barras da placa de reao (ptica) com o auxlio do leitor
manual do Janus.
Abrir a tela para ser inserido o cdigo de barra da placa da Qiagen (seta azul). Ler o
cdigo de barras com o leitor manual do JANUS. Clicar em OK (seta vermelha) (Fig. 93).
Fig. 93: Tela que solicita a insero do cdigo de barras da placa de eluio com o auxlio do leitor manual do
Janus.
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Reviso: 29/03/2012
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Reviso: 29/03/2012
Aps a mistura de PCR ser transferida para a placa de Reao, aparecer uma janela
no software do JANUS solicitando a placa de eluio. Retirar a tampa da placa e verificar se
esta se encontra totalmente descongelada. Selecionar OK na janela emitida.
Aps o JANUS transferir o RNA para a placa de reao, vedar esta placa com o selo
ptico, com o auxlio da esptula (ABI).
Observar a placa para ver se h bolhas nos poos. Se houver, fazer movimentos firmes
de cima para baixo com a placa para retirar as bolhas.
Colocar a placa de reao no equipamento de deteco ABI 7500 Real Time PCR
System.
D) Amplificao e Deteco
Amplificao
A metodologia de amplificao especfica do alvo com sondas marcadas com
fluorescncia usada para determinar a presena de: HIV, HCV e da partcula calibradora de
forma discriminatria. O equipamento utilizado na etapa de amplificao e deteco o ABI
7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems/LifeTechnologies).
Deteco
A tcnica possibilita a dosagem dos produtos de PCR durante o transcorrer da mesma
em tempo real. Isto conseguido atravs de uma sonda de DNA sinttico que tem duas
modificaes em suas extremidades. A emisso de luz diretamente proporcional massa de
produto de PCR que est sendo sintetizado, possibilitando a dosagem em tempo real.
87
Reviso: 29/03/2012
Aps a inicializao do software, ir aparecer uma caixa de texto pedindo para escolher o
usurio. Selecionar NAT. Clicar OK.
88
Reviso: 29/03/2012
Fig.100: Tela do programa 7500 Software. Imagem mostra a rea EXPORT selecionada.
89
Reviso: 29/03/2012
Abrir a janela abaixo; selecionar somente a opo RESULTS e alterar a opo File type
para *.txt. No campo Export File Name estar o cdigo de barras da placa, apagar o _data.
em Export File Location aparece o diretrio onde o arquivo ser gravado.
90
Reviso: 29/03/2012
91
Reviso: 29/03/2012
Nesta etapa, basta clicar direto em OK (seta vermelha), uma vez que ele no utiliza
nenhuma ponteira (tip).
Clicar em Gerar, seta vermelha. Ao final da consolidao dos dados a opo Fechar
estar habilitada, selecion-la para encerrar o protocolo, seta verde.
92
Reviso: 29/03/2012
Para gerar o laudo, d um clique em Processa Rotina, seta vermelha (Fig. 109).
93
Reviso: 29/03/2012
Nesta tela sero mostradas todas as rotinas para gerao dos laudos (Fig.110).
Digite o nmero do lote utilizado para realizao da rotina, no campo Lote. Selecione a
rotina desejada e clique em Sim.
Aparecer o status do processamento da rotina (Processo Finalizado. Rotina OK ou
Rotina Invlida) e a pergunta se o usurio deseja gerar nova rotina (Fig.111).
Se houver a necessidade de gerar nova rotina, clicar em Sim, seta vermelha e refazer o
processo (Fig.111).
94
Reviso: 29/03/2012
Nesta tela, o usurio poder visualizar o contedo de uma rotina gerada selecionando a
data em que a mesma foi gerada. Em seguida clicar em Visualizar (Fig.113).
95
Reviso: 29/03/2012
Clicar duas vezes na rotina para visualizao do laudo em PDF (Fig. 114).
Procedimento
Liberar o resultado das amostras.
Repetir a amostra. Se confirmar o resultado, acionar a
assistncia tcnica de BM relatando o fato.
Controle interno OK
individualmente.
96
Reviso: 29/03/2012
Flebotomia
para
sorologia
Flebotomia
para NAT
BioM
Execuo de
sorologia
Descarte da bolsa
Execuo do
NAT BioM
Convocao do doador
+
NAT
HCV
NAT
HIV
Bolsa em
quarentena
+
pos+
ELISA
HCV
Bolsa em
quarentena
pos+
Caracterizao virolgica
molecular da amostra:
UFRJ
pos+
ELISA
HIV
pos+
Convocao
do doador de
sangue
Acompanhamento sorolgico do
doador de sangue
-soroconverso?-
ELISA
HCV
pos+
ELISA
HIV
pos+
Liberao da bolsa
Descarte da bolsa
Convocao do doador
Confirmatrio:
Western blot HIV ou
RIPA HCV
97
Reviso: 29/03/2012
98
Reviso: 29/03/2012
Fig. 117:Grficos representativos de controle interno OK e amostras no detectveis para HIV e HCV. A Anlise pelo Amplification Plot: Curva vermelha representa o controle interno ultrapassando a linha do Threshold.
B Anlise pelo Multicomponent plot: Curva rosa representa o controle interno com curva padro de
positividade, linha verde representa o HIV, linha azul o HCV e linha vermelha a referncia passiva (ROX).
Fig.118: Grficos representativos de controle interno No OK. A - Anlise pelo Amplification Plot: tracejado
vermelho representa o controle interno que no sofreu amplificao. B Anlise pelo Multicomponent plot: linha
rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha azul o HCV e linha vermelha a referncia
passiva (ROX), no se observa presena de curva.
99
Reviso: 29/03/2012
B
.
Figura 119: Grficos representativos de controles negativos dentro do padro esperado. A- Anlise pelo
Amplification Plot: Curva referente a partcula calibradora. B- Anlise pelo Multicomponent Plot: linha rosa
representa o controle interno, linha azul o HCV e linha vermelha a referncia passiva (ROX).
B
.
Figura 120: Grficos representativos de controles negativos positivando. A- Anlise pelo Amplification Plot: A curva
verde ultrapassando a linha do threshold representa que houve amplificao para HIV. B- Anlise pelo
Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha azul o HCV, linha vermelha a referncia passiva
(ROX) e a linha verde representa o HIV. Nesta anlise, houve amplificao para HIV, presena de uma discreta
curva.
100
Reviso: 29/03/2012
Nos controles positivos o Ct ideal para HIV e HCV de 24 ( 2.47) (Fig. 121). Qualquer
valor fora deste intervalo, mnimo de 21,53 e mximo de 26,47, a rotina sair como invlida no
laudo.
A
B
.
Fig. 121: Grficos representativos de controles positivos dentro do padro esperado. A- Anlise pelo
Amplification Plot: h duas curvas ultrapassando a linha do threshold referentes a HCV e HIV. B- Anlise pelo
Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha azul o HCV e
linha vermelha a referncia passiva (ROX), houve absoro elevada de fluorescncia tanto para HIV quanto para
HCV.
101
Reviso: 29/03/2012
B
.
Fig. 56: Grficos representativos de amostras positivos para HCV. A- Anlise pelo Amplification Plot: A curva
referente ao HCV est ultrapassando a linha do threshold . B- Anlise pelo Multicomponent Plot: linha rosa
representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha vermelha, referncia passiva (ROX) e a linha
azul o HCV. Nesta anlise, observa-se absoro de fluorescncia mais alta para HCV apresentando uma curva
caracterstica de positividade.
A
.
B.
Fig.123: Grficos representativos de amostras positivos para HIV. A- Anlise pelo Amplification Plot: A curva
referente a HIV est ultrapassando a linha do threshold . B- Anlise pelo Multicomponent Plot: linha rosa
representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha vermelha referncia passiva (ROX) e a linha
azul o HCV. Nesta anlise, observa-se absoro de fluorescncia mais alta para HIV apresentando uma curva
caracterstica de positividade.
102
Reviso: 29/03/2012
B
.
A
.
Fig.124: Grficos representativos de poos da placa vazia ou presena de bolhas. A- Anlise do poo pelo
Amplification Plot: no h uma curva com perfil esperado ultrapassando a linha do threshold. B- Anlise pelo
Multicomponent Plot: No houve amplificao. C- Perfil da corrida pelo Amplification Plot: perfil fragmentado das
curvas que apresentando poos vazios.
103
Reviso: 29/03/2012
B
.
Figura 125: Grficos representativos de amostras com backgrounds para HIV e HCV. A- Anlise pelo Amplification
Plot: A curva referente a HCV est ultrapassando a linha do threshold fora do padro esperado. B- Anlise pelo
Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha vermelha,
referncia passiva (ROX) e a linha azul o HCV. No houve absoro considervel de fluorescncia para HCV.
- Na figura 126, mostra o perfil de uma corrida de PCR ideal. Na figura 127, mostra um perfil de
curvas com background.
A.
Fig. 126: Viso do grfico no Amplification Plot apresentando curva ideal, ou seja, dentro do padro esperado
para o Kit NAT.
104
Reviso: 29/03/2012
A.
B.
C.
Fig. 127: Grfico representativo de uma curva com background. A- Perfil de uma rotina apresentando uma curva
fora do padro esperado para o Kit NAT, viso no Amplification Plot: B- Anlise de uma amostra com background
pelo Amplification Plot: A curva referente ao HIV est ultrapassando a linha do threshold fora do perfil esperado.
C- Anlise pelo Multicomponent Plot: linha rosa representa a partcula calibradora, linha verde representa o HIV,
linha vermelha, referncia passiva (ROX) e a linha azul o HCV. No houve absoro considervel de
fluorescncia.
105
Reviso: 29/03/2012
Conservao e Estocagem
Armazenamento do Kit
Visando otimizao dos resultados e a manuteno da qualidade do produto NAT, devese observar e armazenar os mdulos na temperatura adequada conforme descrio no rtulo.
Estas temperaturas devero ser monitoradas, periodicamente, para garantir o timo grau
de eficincia do ensaio. O uso de instrumentos de medio de temperatura com calibrao,
atualizada, recomendvel.
Condies de Transporte
O transporte deve ser efetuado respeitando as condies ideais de temperatura, sendo
os mdulos controle e de amplificao transportados em gelo seco (-80C a -60C), mas
devero ser armazenados nas temperaturas indicadas, no rtulo externo, desde o ato do
recebimento at a utilizao do conjunto.
O transporte da embalagem final contendo o mdulo de extrao deve ser transportado
em bubina de gelo. Os mdulos de Amplificao e controle devem ser transportados em gelo
seco (-80C a -60C). Para controle de temperatura de transporte do Kit, enviado dentro da
caixa um termmetro (Tag), que acionado em Bio-Manguinhos e parado no ato do
recebimento no cliente.
Aps o recebimento, solicitamos que seja encaminhado a Bio-Manguinhos uma pesquisa
de satisfao de entrega, com informaes do recebimento dos Kits e acessrios.
106
Reviso: 29/03/2012
107
Reviso: 29/03/2012
PROCEDIMENTOS DE MANUTENES
EQUIPAMENTO MDx
Devem ser realizados os seguintes procedimentos de manuteno para garantir uma
operao confivel da estao de trabalho BioRobot MDx:
Manuteno diria
Manuteno semanal
Manuteno mensal
108
Reviso: 29/03/2012
Frequncia
Dirio
Dirio
Semanal
Semanal
Semanal
Mensal
Mensal
Mensal
Mensal
Semestral
Dirio
Semanal
109
Reviso: 29/03/2012
Fig. 131 Caixa de dilogo com instruo para a realizao das tarefas.
110
Reviso: 29/03/2012
MANUTENES DIRIAS
Liquid containers cleaning Limpeza dos recipientes de lquidos
1. Esvaziar o recipiente de lquido do sistema (galo sob a estao de trabalho) e o frasco de
lquido do sistema (garrafa que fica no carrossel de reagentes). Ao abrir o recipiente de lquido
do sistema, desconectar primeiro a tubulao e depois remover a tampa.
Enxaguar o recipiente e o frasco completamente com gua deionizada/destilada e reabasteclos com nova gua deionizada/destilada. Aps reabastecer o recipiente de lquido do sistema
com gua deionizada/destilada, fechar primeiro a tampa e depois conectar a tubulao.
2. Executar o Flush System e o Flush Dispenser.
3. Esvaziar o sifo a vcuo (vacuum trap) e o descarte/lixo ( Waste Container).
4. Limpar e lavar os gales, os sifes e as tampas do vacuum trap e do Waste Container
com detergente e enxaguar com gua.
Middle (Meio) ou Right (Direita) para mover o brao robtico para a posio adequada na
mesa de trabalho.
2. Borrifar toda a estao Tip-Disposal com desinfetante a base de etanol (ou lcool 70%) e
secar com papel toalha.
Worktable cleaning Maintenance Limpeza da mesa de trabalho
1. Selecione Tool (Ferramenta)
Left (Esquerda), Middle (Meio) ou Right (Direita) para mover o brao robtico para a
posio adequada na mesa de trabalho.
2. Limpar com gaze umedecida em lcool 70%, toda a mesa de trabalho. Certifique-se que ao
final do procedimento toda a mesa de trabalho estar limpa e seca.
111
Reviso: 29/03/2012
MANUTENES SEMANAIS
Bar Code Reader Windows Cleaning Maintenence Limpeza da janela do leitor de
cdigos de barra
1. Inspecionar a janela do leitor do cdigo de barra do:
Sistema de localizao da amostra
Sistema de localizao da placa da Qiagen (porttil e interno)
Sistema de localizao de tampo
2. Se a janela estiver suja, limpar a superfcie gentilmente com gaze seca.
112
Reviso: 29/03/2012
Fig. 136 Tela com instrues dos procedimentos. Cdigos de barras da rack 015.
113
Reviso: 29/03/2012
Ostras telas aparecero como guia de montagem. Deve-se seguir o comando indicada
nas janelas de dilogo de cada tela exibida no software.
Ao final do procedimento ser indicado se o protocolo passou ou falhou (Fig. 137). Se
passar, seguir com as orientaes de limpeza indicada pelo software. Se falhar, repetir o
procedimento totalizando trs vezes e enviar os arquivos gerados para Bio-Manguinhos.
A tela final do protocolo, aps a limpeza da mesa, indica o diretrio onde os arquivos
gerados foram gravados no computador (Fig.138).
114
Reviso: 29/03/2012
115
Reviso: 29/03/2012
(Esquerda), Middle (Meio) ou Right (Direita) para mover o brao robtico para a posio
adequada na mesa de trabalho.
2. Retire todos os objetos removveis da mesa de trabalho. Alm disso, retirar a estao para
descarte de ponteiras:
MANUTENES SEMESTRAIS
Uma janela aparece a cada 6 meses informando que a manuteno preventiva est para
vencer. O procedimento de manuteno preventiva deve ser realizado por um Especialista
da Assistncia Tcnica QIAGEN.
116
Reviso: 29/03/2012
Mensal Background
A calibrao do equipamento ABI 7500 dever consistir nesta ordem: ROI > Background >
Optical > Dyes (ROX, FAM, VIC, Dye 3).
Retirar a caixa contendo todas as placas de calibrao que sero usadas do freezer e
deixar a temperatura ambiente para descongelar
A) Calibrao ROI:
117
Reviso: 29/03/2012
B) Calibrao Background
C) Calibrao ptica
118
Reviso: 29/03/2012
D) Calibrao do Dye
* No momento em que o software solicitar cada placa de Dye, preparar e carregar as placas
da seguinte forma:
- Executar o mesmo procedimento relatado acima para as outras calibraes.
Verificar se a placa da Dye condiz com o Dye que esta sendo pedido pelo
software.
5. Na janela do Run selecionar a opo START RUN, e em seguida NEXT.
6. Aparecer uma caixa de dilogo de anlise (analysis) informando o status da calibrao,
se passou (passed) ou no (failed).
7. Clicar em NEXT.
8. Clicar em FINISH
9. Preparar e correr a prxima placa que o software pedir.
Elaborado pela DIACM
Aprovado por Linda Khalili Boukai
119
Reviso: 29/03/2012
E) Calibrao do DYE 3
Selecionar na lateral esquerda DYE (seta vermelha), Custom Dye Calibration (retngulo
laranja) e Start Calibration (seta laranja).
Na Figura 141 no campo 2. Select a dye or create a new dye (retngulo vermelho),
selecionar New Dye e digitar DYE 3 ( necessrio digitar exatamente dessa forma: letras
maisculas e espao entre a palavra e o nmero).
No campo 6, marcar o quadrado (retngulo azul). Essa ao habilitar a opo Next
(retngulo verde). Selecionar Next at aparecer Start Run (estar escrito num retngulo
verde, no canto superior esquerdo).
120
Reviso: 29/03/2012
Esta calibrao realizada com a placa de TAMRA, pois as sondas possuem o mesmo
comprimento de ondas.
121
Reviso: 29/03/2012
BACKUP JANUS:
Os arquivos que podem sofrer backup no computador do Janus so:
Atualmente os arquivos .csv que podem ser apagados na pasta Bin so:
BCMap_(id da corrida)_Scan1
BCMap_(id da corrida)_Scan2
BCMap_(id da corrida)_Scan3
BCMap_(id da corrida)_Scan4
BCOutput_(id da corrida)_Scan1
BCOutput_(id da corrida)_Scan2
BCOutput_(id da corrida)_Scan3
BCOutput_(id da corrida)_Scan4
Extract1
Extract2
PlateTransfer_(id da corrida)_WellMap
PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap1
PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap2
PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap3
PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap4
Test_numero do dataset_rpt
A pasta Bin encontra-se: Meu computador> C:\ > Packard > Janus > Bin
122
Reviso: 29/03/2012
BACKUP MDx:
Fazer uma cpia (CD ou DVD) da pasta USER DATA que se encontra:
Meu Computador (My Computer) > C:\ > Arquivos de Programa (Program Files) >
QIAsoft MDx > User Data .
Nesta pasta esto os relatrios de execuo, os arquivos de log, os relatrios de
manuteno e tambm os relatrios de protocolos de servio realizado pelos engenheiros.
Aps a cpia, todos os arquivos podem ser apagados de dentro dessa pasta.
Executar a limpeza do disco: Iniciar > Programas > Acessrios > Ferramentas do
Sistema > Limpeza de disco (disk cleanup)
Executar a desfragmentao de disco: Iniciar > Programas > Acessrios >
Ferramentas do Sistema > Desfragmentador de disco (Selecionar o drive C:/)
123
Reviso: 29/03/2012
Meu Computador > C:\ > Arquivos de Programa (Program Files) > QIAsoft MDx > User
Data > Log Files
Dentro da pasta Log Files esto os 3 arquivos da corrida que precisam ser enviados.
Procurar pela data da corrida.
Se for pedido para correr algum protocolo de manuteno, os arquivos precisaro ser
enviados. Eles so encontrados no seguinte caminho:
Meu Computador > C:\ > Arquivos de Programa (Program Files) > QIAsoft MDx > User
Data
124
Reviso: 29/03/2012
3 Arquivos do Janus: Sero enviados todos os arquivos com a data correspondente a rotina
rodada. Os mesmos so encontrados no caminho no computador do Janus:
Para o envio dos relatrios de cada corrida efetuada, enviar os seguintes arquivos:
1 Arquivo Word com o relatrio da corrida
2 Arquivo eds que se encontra dentro do computador do ABI 7500
3 Arquivo PDF do laudo da rotina, que se encontra no seguinte caminho:
125
Reviso: 29/03/2012
126
Reviso: 29/03/2012
127
Reviso: 29/03/2012
128
Reviso: 29/03/2012
Colagem correta das etiquetas dos tubos secundrios (colar em cima do valor de 2 mL
no tubo);
Verifique sempre se a etiqueta com o cdigo de barras est voltada para a janela das
racks;
Verificao de bolhas nos microtubos da partcula calibradora, aps mixagem, pois elas
atrapalham o sensor de lquido, fazendo-o entender como nvel de aspirao o contato
com a bolha;
suporte do
controle de temperatura (INHECO) e das racks (qualquer dvida basta colocar a seta
do mouse sobre a mesma);
129
Reviso: 29/03/2012
130
Reviso: 29/03/2012
Colagem correta das etiquetas dos tubos secundrios (colar em cima do valor de 2 mL
no tubo);
Verifique sempre se o cdigo de barras est virado para a janela esquerda das racks.
Cheque o posicionamento das etiquetas dos gales para que nenhuma etiqueta cubra
o sensor, impedindo deteco de lquido;
Verifique a mesa de trabalho para se assegurar de que todas as peas removveis (ex:
peas do sistema de vcuo, suporte da protease) esto corretamente encaixadas;
Dentro da torre tcnica, certifique-se que os cdigos de barras dos rtulos dos
reagentes estejam virados para a janela do carrossel para que seja possvel a leitura
dos mesmos;
131
Reviso: 29/03/2012
Se todas as conexes estiverem Ok, restaurar o Windows para o ltimo dia em que o
equipamento funcionou corretamente. Para isso entrar no caminho: INICIAR>
PROGRAMAS> ACESSRIOS> FERRAMENTAS DO SISTEMA> RESTAURAO
DO SISTEMA.
Aps o trmino da PCR, ao analisar a rotina, certifique-se de que toda a placa esteja
selecionada.
132
Reviso: 29/03/2012
DESCONTAMINAO
Ambiente
1. Limpar as pipetas com lcool 70% e se necessrio com hipoclorito
2. Limpar as bancadas com lcool 70% e se necessrio com hipoclorito
3. Trocar as luvas antes de pipetar os controles negativos e positivos do kit NAT.
4. Possuir preferencialmente duas pipetas, uma para pipetar os controles negativos e a outra
o positivo, caso no possua, pipetar os controles negativos primeiro e posteriormente os
controles positivos.
5. Limpar com lcool 70% suporte de transporte da placa de PCR.
6. Diminuir o fluxo de entrada e sada na sala de PCR.
Janus
1. Limpar as agulhas com lcool 70%.
2. Limpar com lcool 70% o suporte preto da placa de PCR que fica na mesa de trabalho.
MDx
1. Realizar diversas vezes Flush and Wash.
2. Fazer a limpeza com etanol 70% na mesa de trabalho do MDx.
3. Desinfetar a bacia onde as peas do MDx so colocadas de molho.
4. Limpar a pea extensora do MDx.
5. Se necessrio, limpar a pea extensora do MDx com Hipoclorito (1:1. Ex.: 50mL de
hipoclorito para 50 mL de gua deionizada) por 15 minutos. Posteriormente, lavar bastante em
gua corrente e colocar a pea de molho no detergente fornecido por Bio-Manguinhos.
6. Se necessrio, aumentar a concentrao do detergente que colocado na bacia de
lavagem. Para cada 3 litros de gua pode ser usado 5 mL de detergente.
7. No caso de contaminao do local, as tips que sobram no MDx devem ser descartadas e a
cada rotina, utilizar somente tips novas. Seguir esse procedimento at resolver o problema de
contaminao.
8. Se o problema persistir, por favor, entrar em contato com o atendimento ao cliente de BioManguinhos (08000-210 310)
133
Reviso: 29/03/2012
ABI
Caso durante a calibrao background seja observado algum poo com suposta
contaminao, seguir o seguinte procedimento:
1. Desligar o equipamento;
2. Abrir a tampa do equipamento;
3. Levantar o pino e empurrar a frente, expondo assim o bloco;
4. Limpar o poo contaminado com gua (com uma pipetada calibrada, dispensar 200 L de
gua, aspirar e dispensar e aspirar novamente e secar com um papel que no solte pelos o
poo);
5. Colocar novamente a placa background, caso o poo ainda esteja contaminado, dispensar
e aspirar 200 L de lcool e repetir o passo 4 com gua, certifique-se que o poo esteja
completamente seco;
6. Colocar novamente a placa background, caso o poo ainda esteja contaminado, dispensar
e aspirar 200 L de hipoclorito 2%, e repetir o passo 5 e o 4 com gua, certifique-se que o
poo esteja completamente seco;
7. Caso a contaminao persista, favor entrar em contato com o suporte de Bio-Manguinhos
(08000-210 310).
134
Reviso: 29/03/2012
a) O tempo de 30 minutos para exposio costuma ser suficiente para uma desinfeco
eficaz. Como a exposio prolongada luz UV prejudicial sade, deve-se garantir
que as salas no sejam usadas durante os perodos de desinfeco. Recomenda-se a
colocao de avisos e o trancamento das salas durante o perodo de uso da luz UV;
b) Recomendamos que a cada 5,7 m2 de sala seja efetuada a instalao de uma lmpada
UV;
c) A distncia recomendada para ambientes de at 2,44 m (8 ps) da lmpada at a
superfcie alvo.
135
Reviso: 29/03/2012
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
- Ascher, M. S. & Wilber, J. C. Immunofluorescence for Serodiagnosis of Retrovirus Infection.
Arch.Pathol.Lab.Med. 114: 246-248, 1990.
- BioManguinhos BioRobot MDx User Manual_v1.1_7/10
- Farah, S.B. DNA, Segredos e Mistrios. 2 ed. So Paulo, Sarvier, 2007
- Gallo, D.; Hoffman, M. N.; Yeh, E.T.; George, J. G. & Hanson, C. V. Comparison of
Indirect Immunofl uorescence and Membrane Fluorescence Assays for the Diferentiation of
Antibodies to Human Immunodeficiency Virus Types 1 and 2 J. Clin. Microbiol. 30: 2275-2278,
1992.
- Manual de Instrues NAT LATED. Verso setembro 2010.
- Rossetti, Ma L. Doenas Infecciosas Diagnstico Molecular 1 edio. Ed Guanabara
Koogan; 2005.
- Sandstrom, E. G.; Schooley, R. T.; Ho, D. D.; Byington, R.; Sarngadharan, M. G.;
MacLaren, M. E.; Essex, E.; Gallo, R. C. & Hirsch, M. S. Detection of Human anti-HTLV-III
Antibodies by Indirect Immunofluorescence Using Fixed Cells. Transfusion, 25/41: 308-12,
1986.
- Sullivan, M. T.; Mucke, H.; Kadey, S. D.; Fang, C. T. & Williams, A. E. Evaluation od an
Indirect Immunofl uorescence Assay for Confi rmation of Human Immunodeficiency Virus Type
1 Antibody in U.S. Blood Donor Sera. J. Clin. Microbiol., 30: 2509-2510, 1992.
136
Reviso: 29/03/2012