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SANGRE PERIFRICA
En el anlisis del sistema inmune es necesario evaluar las clulas que se desarrollan y activan en
forma especfica o inespecfica, en cada tipo de respuesta. De all el inters por separar las clulas y
evaluarlas en forma diferenciada.
En muchos de los experimentos in vivo e in vitro que llevan a cabo los inmunlogos son precisas
poblaciones linfocitarias puras. Las principales fuentes de linfocitos de animales de
experimentacin son el timo, el bazo y los ganglios linfticos perifricos. En los estudios llevados a
cabo en seres humanos la fuente de linfocitos ms cmoda es la sangre perifrica, pero tambin se
pueden obtener clulas del bazo, las amgdalas o los ganglios linfticos mediante procedimientos
quirrgicos. Hay que tener en cuenta que las poblaciones celulares obtenidas a partir de cada una de
estas zonas es diferente de las dems en lo que respecta a la madurez de los linfocitos y a la
proporcin relativa de los diversos tipos de clulas que contiene. La inmunologa dispone de varios
mtodos para la separacin rpida de poblaciones linfocitarias, dentro de ellas contamos con la
separacin en gradientes de densidad, la formacin de rosetas, la separacin celular por medio de
partculas magnticas, Identificacin de linfocitos por Inmunofluorescencia y la identificacin por
Citometra de flujo. Nosotros en la prctica realizaremos la tcnica de separacin por gradientes de
densidad, la cual se basa en que los linfocitos son menos densos que los eritrocitos y los
granulocitos, y se utiliza para separar conjuntamente todos los linfocitos sanguneos.
Materiales:
Microscopio ptico
Gradillas para Tubos
Cmara de Neubauer
Lminas Portaobjeto
Reactivos:
1. Solucin de Ficoll Hipaque
ii.
Por venipuntura, extraer la sangre en una jeringa que contenga heparina a concentracin de
10 U.I. por ml, mantener en agitacin lenta a temperatura ambiente. No dejar transcurrir
ms de 4 horas antes de procesar la muestra.
Otra forma es obteniendo por venipuntura sangre venosa en un tubo con EDTA, mezclar y
puede ser conservada a temperatura ambiente hasta por 48 horas.
Mdula sea:
Por puncin medular o de cresta iliaca, extraer 2 5 ml de mdula sea en una jeringa que contenga
10 ml de PBS y 150 UI de heparina. Esta dilucin es indispensable para obtener una adecuada
separacin de clulas mononucleares. Las muestras de mdula que no son diludas en el momento
de su obtencin deben rechazarse. La agitacin y tratamiento hasta el procesamiento es igual que
para sangre perifrica.
Mtodo:
1. Dilur la muestra de sangre perifrica heparinizada o con EDTA 1:2 (2 ml de sangre + 2 ml
de PBS ). Las muestras de mdula sea ya diludas no deben diluirse nuevamente.
Tubo con 2 ml de
sangre ms 2 ml de
PBS y luego
aadimos Ficoll, que
es la parte
Al separar el Halo
con clulas
mononucleares,
separamos y lo
lavamos 2 veces
con PBS. Al ltimo
En
el
microscopio
observamos las clulas con
Azul de tripan que sirve
para ver si es VIABLE,
solo las clulas muertes se
vern de color azul.
Interpretacin
Observaremos como los componentes de la muestra se ubicaran a diferentes niveles dentro del tubo
segn su propia densidad. La capa de mononucleares obtenida es bastante pura y contiene linfocitos
y monocitos, los que se pueden distinguir por su morfologa, antgenos de superficie, capacidad
fagoctica, actividad enzimtica, adherencia.
Notas:
La separacin por gradiente de densidad fue una de las primeras metodologas utilizadas para este
fin.
Esta metodologa tiene la particularidad que adems de separar grupos celulares, permite mantener
una buena viabilidad celular para realizar otros anlisis.
No olvides que la muestra de sangre debe ser colocada en zona, es decir por las paredes del tubo y
de inmediato debe ser centrifugada.
CUESTIONARIO
1.- En qu consiste la separacin celular por medio de partculas magnticas?
Separacin Inmunomagntica
Estas tcnicas se basan en el uso de anticuerpos unidos a la superficie de unas esferas formadas por
un material superparamagntico (es decir, que solo son magnticas en presencia de un campo
magntico) recubierto de un polmero. Los anticuerpos se unen de manera especfica a un antgeno
presente en la superficie de un tipo celular concreto y, mediante un simple imn, se pueden separar
las clulas unidas a los anticuerpos de las dems. Existen en el mercado dos sistemas de separacin
de clulas basados en el uso de esferas metlicas unidas a anticuerpos: Dynabeads y MACS.
a. Dynabeads (Life technologies)
Son unas esferas de poliestireno en cuyo interior hay partculas superparamagnticas que contienen
hierro, homogneamente distribuidas. Su tamao es uniforme, con un dimetro de 4,5 micras
(comparable al tamao de una clula). Sobre su superficie se pueden unir covalentemente diversos
ligandos biorreactivos: anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios, estreptavidina,
oligonucletidos, etc.
2.- Qu es el Ficoll?
El Ficoll es un polmero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que
permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y
que floten las clulas mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugacin
nos ser fcil obtener las clulas mononucleares de sangre perifrica.
3.- Qu es el Hipaque?
3.a) Hypaque meglumina
Marca del diatrizoato de meglumina, es un agente de diagnstico, radiopaco y soluble en agua. Es
un derivado triyodado del cido benzoico con 47.06% de yodo unido orgnicamente. Est
constituido por un anin yodado (diatrizoato) y un catin radiolcido (meglumina). Es una solucin
acuosa estril con 60 g de la sal meglumnica del cido diatrizoico por cada 100 ml de solucin. La
solucin es transparente, incolora o amarillo plida, y el pH ha sido ajustado entre 6.5 y 7.7 con
cido diatrizoico o solucin de meglumina. Es una solucin relativamente termoestable y puede ser
autoclavada sin que se produzcan efectos deletreos, pero debera ser protegida de la luz fuerte. La
solucin al 60% contiene edetato de calcio disdico 1:10.000 como agente estabilizador
secuestrante. Cada 1 ml contiene aproximadamente 282 mg de yodo unido orgnicamente. La
viscosidad de la solucin es 6.17 cp a 25 C y 4.12 cp a 37 C. Es hipertnica a la sangre, con una
osmolalidad de 1.415 mosm/kg (determinado por VPO). Una solucin al 13% (p/v) es isotnica. Es
un slido microcristalino, incoloro, muy soluble en agua. Qumicamente corresponde a 3.5diacetamida-2, 4, 6-triyodobenzoato de meglumina (C11H9I3N2O4.C7H17NO5) con un peso molecular
de 809.13.
3.b) Hypaque-76
Marca de diatrizoato de meglumina y diatrizoato sdico, es un agente de diagnstico, radiopaco
soluble en agua. Se presenta bajo la forma de una solucin acuosa estril al 76 %, que contiene 66%
(p/v) de diatrizoato de meglumina y 10% (p/v) de diatrizoato sdico. Es un derivado triyodado del
cido benzoico con 37% (p/v) de yodo unido orgnicamente. Cada ml contiene 370 mg de yodo y
3.68 mg (0.16 mEq) de sodio. Est constituido por un anin yodado radiopaco -diatrizoato- y los
cationes radiolcidos, meglumina y sodio. Es el yodo unido orgnicamente del anin la parte de la
molcula que opacifica las estructuras internas para visualizacin por medio de los rayos X y la
fluoroscopa. La solucin es hipertnica a la sangre, con una osmolalidad de 2016 mosm/kg
(determinado por VPO). La viscosidad es de 9 cp a 37 C. El pH ha sido ajustado entre 6 y 7.7
usando Na2CO3 con HCI o NaOH. El pKa es 3.4 para el cido diatrizoico. Se ha agregado edetato
de calcio disdico al 0.01% como agente estabilizador secuestrante. La solucin es transparente,
incolora o amarillo plida. El diatrizoato meglumina corresponde al 1-deoxi-1-(metilamino)-Dglucitol-3.5-diacetamida-2,4,6-triyodobenzoato (sal). El diatrizoato sdico corresponde al 3.5
-diacetamida-2,4,6- triyodobenzoato monosdico.
INTRODUCCIN
CONCLUSIN
La separacin por gradiente de densidad fue una de las primeras metodologas utilizadas
para este fin.
Esta metodologa tiene la particularidad que adems de separar grupos celulares, permite
mantener una buena viabilidad celular para realizar otros anlisis.
No olvides que la muestra de sangre debe ser colocada en zona, es decir por las paredes del
tubo y de inmediato debe ser centrifugada.
La muestra usada debe ser fresca.
Los glbulos rojos de carnero pueden ser lavados en solucin salina fisiolgica hasta que no
se observe hemlisis o sea el sobrenadante debe ser incoloro y transparente.
La formacin completa de las rosetas se da a las 18 24 horas a una temperatura de 2 8
C (refrigeracin)
Realiza el clculo de los linfocitos T de la muestra trabajada.