SONDAS GNICAS

I. Definicin
Una sonda es

un

fragmento

tamao (normalmente

entre

de ADN (o
100

raramente ARN)

1000 bases)

de pequeo

usado

en biologa

molecular como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de

secuencia complementaria parecida o igual. En su uso, la sonda se une a la
secuencia diana monocatenaria (ADN/ARN) mediante un mecanismo
de hibridacin que forma una estructura bicatenaria, una de las hebras
pertenece a la sonda, y la otra a la secuencia diana. Esta unin se establece
porque tanto la sonda como la diana tienen secuencias en parte o totalmente
complementarias, formndose pares de bases complementarias
Bioqumicamente una sonda es una molcula de ADN o ARN homologa a
una secuencia de ARN o ADN diana, con la que hbrida de forma estable y
especifica (por asociacin de bases complementarias). La sonda es una
copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN o ADN y se unir
exclusivamente esa secuencia de la que es copia. Esto es lo que se llama
especificidad de la sonda. Una vez que la sonda se une a la secuencia diana
se detecta y cuantifica. La deteccin solo es posible si la sonda se ha
marcado con un grupo detectable. Dependiendo del nmero de estos grupos
incorporados y de la seal que emitan la sonda puede tener diferente
sensibilidad.
II. Tipos de sondas
Distintos tipos de sondas de cidos nucleicos pueden ser utilizadas para la
hibridacin in situ:
1. Sondas de DNA de doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando
tcnicas como nick translation, random priming o PCR, en las cuales el
nucletido marcado es incorporado. PCR y random priming proporcionan
una

buena

actividad

especfica.

Estas

sondas

pueden

ser

desnaturalizadas antes de usar. Cuando se usan para detectar una

cadena simple como mRNA, estas son menos sensibles debido a que la
concentracin de la sonda marcada es reducida.

2. Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas

utilizando primer extension en templados de cadena simple o por PCR
con un nucletido marcado. ste ltimo es el ms usado porque es ms
fcil de llevar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad
de material.
3. El PCR permite una gran flexibilidad en la eleccin de las secuencias
marcadas por el uso de primers. Estas marcas han sido ampliamente
usadas.
4. Oligonucletidos (entre 20 y 40 bases). Son marcados incorporando
oligonucletidos modificados durante la sntesis qumica o adicionando
una

cola

marcada.

Una

de

las

desventajas

es

que

algunos

oligonucletidos marcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad

disminuye.
5. Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso de
una RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de la
sonda es clonada en un vector que flanquear dos sitios distintos de
iniciacin.
6. La cadena de RNA anti sentido (sonda) es sintetizada en direccin
opuesta al gen endgeno. Se recomienda linearizar la sonda de RNA con
enzimas que dejen el extremo 5 cohesivo, porque se ha reportado, que el
extremo 3 romo promueve la sntesis de transcritos anormales.
III. Clases de marcaje para visualizacin de las molculas Dianas.
Para visualizar las molculas diana se utiliza una sonda marcada, bien
radiactivamente, o mediante marcaje inmunolgico. Para el uso de ADN de
doble cadena primeramente es necesario desnaturalizarlo mediante calor o en
condiciones de alta alcalinidad. Esta sonda de cadena simple marcada se une
a la diana; y los lugares de unin se detectan porque los mtodos de marcaje
dejan una seal detectable mediante fotografa. En los mtodos ms
avanzados se utilizan marcajes mediante fluorescencia que emiten seales
detectadas mediante lser, como el utilizado en la PCR a tiempo real.
a. Radiactividad:
Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizado nucletidos que tengan
alguno de sus tomos con un istopo radiactivo.

El istopo ms utilizado es el P32, con alta actividad especfica (9200 Ci/mmol

puro) y emite partculas de alta energa (1'7 MeV) por lo que sondas marcadas
con este elemento tienen un elevado rendimiento y sensibilidad.
El marcaje puede ser en diferentes posiciones. El P32 tiene un periodo de
semidesintegracin relativamente corto, 14 das, lo que obliga a usar las
sondas marcadas dentro del periodo de una semana despus del marcaje, y
adems la emisin de partculas

durante largo tiempo puede alterar la

estructura de la sonda.
b. Marcaje no radiactivo
El uso de sondas fras, marcadas con grupos no radiactivos eliminan el
problema de la contaminacin. Todos estos mtodos se basan en la adicin a
la sonda de un grupo qumico reactivo que se detecta despus de la hibridacin
de la sonda con la secuencia diana. Esta deteccin se basa en la formacin de
un producto coloreado visible en soporte donde se produce la hibridacin o en
el soporte donde se produce la formacin de modificaciones en la sonda. El
problema de estos mtodos es el bajo ndice de incorporacin de grupos
detectables y su menor sensibilidad.
IV. Preparacin de la sonda
Para sondas de cadena sencilla, se debe usar la secuencia reversa
complementaria. Cuando las sondas son sintetizadas por transcripcin,
involucra generar mRNA del gen endgeno. Cuando se disean los oligos
marcados, es importante recordar que la secuencia antisentido es la hebra
complementaria reversa de la cadena lder y debe ser leda de 5 a 3.
En general es preferible usar sondas especficas, ya que esto garantiza una
buena hibridacin. Existen situaciones en las cuales esto no puede llevarse
a cabo, por ejemplo, si los genes todava no estn clonados de las especies
usadas para la hibridacin o si la secuencia gnica es muy similar entre
especies. Esto puede favorecer una hibridacin entrecruzada. Para evitar
esto, se requiere una alta selectividad que reduzca la presencia de bases
mal apareadas, aumentando de esta manera la especificidad. Si los modelos
de expresin son los mismos, como se pueden ver con una sonda

homloga, es un experimento alentador, aunque no prueba la especificidad.

La hibridacin entrecruzada provee informacin preliminar muy valiosa.
a. El diseo de la sonda:
1. La hibridacin entrecruzada utiliza sondas largas (>100 pb)
usadas bajo condiciones selectivas especialmente despus de la
digestin con nucleasas, ya que una sonda adems de homloga,
debe ser lo suficientemente amplia para llevar a cabo la
hibridacin.
2. Para sondas pequeas (oligonucletidos de 20-30 pb) es muy
probable que algn gen distinto al de inters tenga una secuencia
idntica.
Alternativamente se puede hacer un screening y ste puede ser
realizado por bsqueda de secuencias en bases de datos.
3. Los mRNA poseen las secuencias poli(T) y poli(U), al transcribirse
a cDNA se evita que la sonda no incluya esta cola, porque
secuencias largas, ricas en GC dan una gran estabilidad a la
sonda por los triples enlaces que se forman entre estas bases.
Se necesitan dos elecciones ms para la preparacin de la sonda: el tipo de
cidos nucleicos y la marca que se incorpora en la sonda. Algunos mtodos
alternativos estn disponibles para la sntesis de la sonda.
b. Eleccin de la sonda:
Las sondas largas de cadena simple (RNA o DNA) proporcionan una alta
sensibilidad en la deteccin de cadena sencilla. Los oligonucletidos son muy
sensibles y la seal puede ser incrementada por el uso de un cocktail de
sondas que flanquearn en regiones distintas.
Para estudios de mRNAs estrechamente relacionados, las sondas especficas,
pueden ser obtenidas por sntesis de oligonucletidos. Se disean primers que
sern usados para la amplificacin del fragmento deseado de DNA en el PCR.
Estos fragmentos pueden ser clonados y usados para sintetizar cadenas
dobles o sencillas de DNA o RNA.
Alternativamente, para el caso de sondas de RNA, pueden ser marcadas
directamente sin clonacin incluyendo el primer marcado en el sitio de

iniciacin de la RNA polimerasa. Finalmente las sondas de DNA de doble

cadena son recomendadas para blancos de doble cadena y esto puede ser
suficientemente sensible para detectar abundancia de cadena sencilla.
c. Tamao de la sonda:
Las sondas largas pueden emitir una seal ms fuerte debido a que incorporan
mayor nmero de nucletidos marcados dentro de ella. Sin embargo, las
sondas que son tan largas dan seales dbiles, debido a que la sonda penetra
menos eficientemente en el tejido. La mejor estrategia es usar una secuencia
larga como templado para la sntesis de la sonda pero asegurar que la sonda
generada es lo suficientemente pequea para poder penetrar. Muchos
procedimientos estn basados en que la sonda de 50-150 bases porque emiten
seales ptimas para la hibridacin en secciones de ciertos tejidos. Se ha
encontrado que las sondas de RNA que miden por arriba de 1 kb proveen
seales ptimas para la hibridacin in situ, en embriones fijados en para
formaldhedo. La penetracin est influenciada por el tamao de la sonda
aunque tambin depende de la naturaleza del tejido, de la forma de fijacin y si
el pre tratamiento ha sido realizado para remover las protenas celulares.
El tamao de la sonda puede ser controlado durante la reaccin de sntesis:
a. Sondas de DNA, sintetizadas por nick translation, el largo est
determinado por la cantidad de DNasa en la reaccin.
b. Sondas marcadas por random priming el tamao est determinado por
la concentracin del primer.
c. Primers que puedan ser elegidos para deteminar el tamao de la sonda
sintetizada por PCR.
d. Sondas largas de DNA pueden ser cortadas parcialmente por incubacin
a altas temperaturas.
e. Sondas largas de RNA son parcialmente cortadas por hidrlisis alcalina
limitada. Si el tamao de la sonda es cortada por hidrlisis hay que
revisar el tamao de la sonda, porque si sta es muy pequea, sta no
hibridar bajo condiciones selectivas standard, dando una baja seal.
d. Estabilidad de la sonda y la interaccin con su blanco:
En experimentos de hibridacin los puentes entra la sonda y la secuencia
blanco juega un rol importante. El largo decrementa la estabilidad en el

siguiente orden RNA-RNA, DNA-RNA, DNA-DNA. La estabilidad de los hbridos

est influenciada por las condiciones de hibridacin, por la concentracin de
formamida, sales y la temperatura.
e. Sondas de doble cadena contra cadena sencilla:
Un nmero de reacciones competentes ocurren durante la hibridacin in situ
con sondas de doble cadena. Las sondas de cadena sencilla proveen las
siguientes ventajas:
a. La sonda no se agota porque no se autoliga.
b. No son cadenas largas porque deben penetrar en la seccin de tejido o
en los cromosomas.

La gentica molecular trata de establecer cul es la estructura y secuencia de

los genes normales, para poder estudiar y comprender las mutaciones de los
mismos y sus efectos en el individuo.
ENZIMAS DE RESTRICCION
Son endonucleasas capaces de reconocer secuencias especficas de bases en
el DNA bicatenario y cortarlo en ese punto. Su papel biolgico consiste en la
degradacin de cualquier DNA extrao. El DNA propio no es escindido gracias
a un sistema de proteccin conocido como modificacin mediante el cual las
bases nitrogenadas estn metiladas en los puntos susceptibles de ser cortados
por la enzima.
EL METODO DE SOUTHERN
Una vez fragmentado el DNA a estudio mediante enzimas de restriccin, se
procede a la separacin de estos fragmentos mediante electroforesis.
El DNA es una molcula con carga negativa debido a los grupos fosfato, por lo
que, colocado sobre un gel de agarosa y aplicando un campo elctrico, migrar
hacia el polo positivo.
La velocidad de migracin depende del tamao del fragmento, de forma que los
ms pequeos avanzan ms deprisa.

Si, adems, se pone en el gel un marcador o conjunto de fragmentos de DNA

de tamaos conocidos, podemos determinar el tamao de cualquier secuencia
de DNA.
Incluso, bajo determinadas condiciones, es posible separar fragmentos del
mismo tamao que difieren en la composicin de sus bases.
Una vez separados los fragmentos, se desnaturaliza el DNA con una solucin
alcalina, obtenindose secuencias monocatenarias.
Este DNA desnaturalizado se transfiere a un filtro y se fija a l mediante
radiacin ultravioleta o calentamiento.
Posteriormente, se introduce el filtro en una solucin que contiene un
fragmento de DNA monocatenario o sonda, cuya secuencia de bases es
complementaria a la del gen que queremos analizar.
Bajo determinadas condiciones ambas secuencias complementarias se unen.
Si la sonda introducida est marcada radiactivamente podremos detectar a qu
fragmento del filtro es complementaria la sonda y si aqul presenta el tamao y
la secuencia normal o ha sufrido alguna mutacin.
Un procedimiento anlogo se utiliza para el estudio del RNA: mtodo Northern
y para el estudio de protenas: mtodo Western.
POLIMORFISMOS

EN

EL

TAMAO

DE

LOS

FRAGMENTOS

DE

RESTRICCION
Existen casos en los que no se conoce la secuencia del gen implicado en una
enfermedad gentica y, por lo tanto, no se dispone de una sonda especfica.
Mediante el estudio de un rbol familiar se puede relacionar la presencia de
una determinada enfermedad con la presencia de un polimorfismo concreto.
Los polimorfismos, variaciones al azar en la secuencia del DNA, pueden
producir variaciones de los sitios de corte para una enzima de restriccin,
dando lugar a fragmentos de restriccin de distinta longitud a los obtenidos en
otro sujeto.

Estos polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin (PLRF) se

heredan segn las leyes de Mendel.
Si el polimorfismo se encuentra en el mismo cromosoma que el gen en
cuestin, se dice que estn ligados y la distancia entre ellos se mide por la
frecuencia con la que ocurre recombinacin durante la meiosis gamtica.
Cuanto menor sea esta distancia, mayor ser la probabilidad de que ambos
rasgos (enfermedad y polimorfismo) se transmitan unidos a la descendencia.
Si ambos genes se encuentran muy separados en el mismo cromosoma se
heredan como si se encontraran en cromosomas distintos, debido a la alta
probabilidad de que se produzcan entrecruzamientos entre dos loci distantes.
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
Es un mtodo de sntesis enzimtica in vitro para conseguir grandes cantidades
de DNA. Es necesario conocer la secuencia de pares de bases que se desea
analizar. Comprende 3 etapas bsicas:
Desnaturalizacin de las cadenas del DNA mediante calentamiento (90-95
C).
Unin de dos oligonucletidos iniciadores o cebadores, que flanquean la
secuencia concreta de DNA que interesa replicar (45-60 C).
Sntesis del fragmento entero mediante copiado de la secuencia de DNA
molde por una DNA polimerasa (Taq) (72 C).
Puesto que el producto sintetizado en un ciclo sirve como molde para el
siguiente ciclo, el nmero de copias de DNA diana se duplica en cada ciclo.
Este proceso se lleva a cabo en un tubo que se introduce en un termociclo
capaz de variar la temperatura a gran velocidad para que se produzcan
alternativamente cada uno de los tres pasos.
Hibridacin "In Situ" Fluorescente (FISH)
Es una tcnica molecular que permite localizar un determinado fragmento de la
secuencia de los cidos nucleicos y pone de manifiesto la presencia o ausencia
de secuencias gnicas especficas. Se puede aplicar sobre ncleos interfsicos

de extensiones celulares o cortes de tejido o directamente en cromosomas. La

posibilidad de poder utilizar las tcnicas de FISH sobre clulas que no estn
dividindose es importante en aquellas neoplasias con baja tasa de divisin
celular, como en los sndromes linfoproliferativos crnicos. Para ello utiliza
sondas marcadas con fluorocromos. Dependiendo del tipo de sonda utilizada
es posible evaluar la presencia de reordenamientos en los ncleos.
Las sondas son pequeas secuencias de cadena sencilla de ADN,
complementarias a la secuencia de inters del cido nucleico. Podemos utilizar
distintos tipos de sondas:

ADN satlite: estas sondas hibridan con las regiones o satlites u

otras secuencias repetitivas de la regin centromrica del cromosoma.
Son de utilidad para detectar alteraciones cromosmicas numricas.
Como hemos dicho anteriormente, esta tcnica puede aplicarse sobre
clulas en divisin o ncleos interfsicos, por tanto podemos detectar
anomalas cromosmicas numricas sin necesidad de tener clulas en

metafase.
Las sondas de pintado cromosmico contienen una librera de
secuencias genmicas que abarcan todo un cromosoma o una
determinada regin. Con estas sondas podemos detectar alteraciones
estructurales o numricas de los cromosomas, pero slo en clulas en

metafase. Es muy til cuando tenemos cromosomas de mala calidad.

Las sondas de secuencia nica (locus especfico), hibridan con
secuencias cromosmicas muy concretas, correspondiente a una banda
cromosmica o a un gen. Con estas sondas podemos visualizar
alteraciones estructurales o numricas tanto en ncleos en interfase
como en metafase. Podemos detectar la presencia de clulas tumorales
residuales con una anomala caracterstica de estirpe o subtipo, como la
t(9;22) en la leucemia mieloide crnica, la t(15;17) que afecta al
PML/RAR en la leucemia mieloide aguda.

Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son los 13, 18, 21,
X e Y, que son los ms propensos a sufrir anomalas. Estn relacionados a
enfermedades como el sndrome de Patau (13), el sndrome de Edwards (18),
el sndrome de Down (21), el sndrome de Turner (X) y el sndrome del

superhombre (Y), entre otros. Sin embargo, como son posibles marcados
adicionales del cromosoma, otros cromosomas pueden ser visualizados con
esta tcnica. FISH usa segmentos de una nica hebra de ADN que son
tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un
cromosoma especfico; estos segmentos de ADN son llamados sondas. En un
principio se empleaban sondas de carcter radiactivo, pero este tipo de
marcaje fue reemplazado por los fluorforos por mayor seguridad, eficacia y
facilidad de deteccin.
La tcnica FISH puede realizarse a los cromosomas en metafase o
en interfase.
3.3.1.-Protocolo bsico
El primer paso de la tcnica consiste en la desnaturalizacin del DNA para
separar la doble hlice. A la muestra desnaturalizada se le aade entonces la
sonda de inters (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero, las
sondas hibridan a las regiones especficas para las que han sido diseadas.
Despus, se tien los ncleos con un color de contraste inespecfico
(generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con molculas
fluorescentes denominados fluorforos (mtodo directo) o no fluorescentes que
se detectan con anticuerpos fluorescentes (mtodo indirecto). Por ltimo, se
visualiza la muestra preparada bajo un microscopio de fluorescencia.

3.3.2.- FISH en Metafase:

Cuando las clulas estn en metafase, sus cromosomas se encuentran
condensados a modo de preparacin para la divisin celular. Para detenerlas
en

metafase,

se

emplea colchicina,

los microtbulos encargado de separar

un

agente

despolimerizante

de

las cromtidas hermanas de un

cromosoma, impidiendo as el avance de la divisin celular.

Este tipo de FISH se utiliza para detectar microdeleciones especficas,
translocaciones o para identificar material extra de origen desconocido. Los
tipos de sondas usadas son:

Los csmidos son secuencias nicas que hibridan con fragmentos

pequeos. Se emplean en estudios de microdeleciones.

Las sondas satlites estn formadas por secuencias altamente repetidas
que se encuentran cerca de lo centrmeros. En la mayora de los casos
son especficas de cada cromosoma. Se usan para determinar

aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores.

Las sondas completas consisten en la suma de varias sondas que
hibridan en distintas zonas del cromosoma y as marcar el cromosoma
completo. Se usan para ver translocaciones.

3.3.3.- FISH en Interface:

No siempre es posible tener ncleos fijados en metafase para realizar el FISH,
y los resultados obtenidos no sern tan especficos. Sin embargo, el FISH en
interface tiene la ventaja de que no es necesario cultivar previamente las
clulas durante diversos das antes de poder analizar sus cromosomas.
Adems, cuando las clulas se encuentran en interface, la cromatina est en
torno a 10 000 veces ms descondensada que en metafase, lo cual permite
una mayor resolucin a la hora de detectar anomalas pequeas. Se emplea
sobre todo para la deteccin de aneuploidias o grandes deleciones,
duplicaciones. No es posible distinguir entre un cariotipo normal y un cariotipo
que presente una translocacin equilibrada. Adems, puede ser empleado en el
anlisis de tumores slidos, que se dividen con muy poca frecuencia.

3.3.4.-Otras variantes de FISH:

FISH en hebra
Este tipo de FISH (tambin llamado "Fiber FISH" o "Halo FISH") se
aplica sobre hebras de ADN desproteinizadas (es decir, desprovistas de
las histonas encargadas de su compactacin). Esta tcnica permite
detectar

pequeas

reorganizaciones

porque

admite

una

mayor

resolucin (permite incluso la visualizacin de genes individuales). La

tcnica puede ser usada para detectar deleciones en clones y para

estimar huecos en los proyectos genoma.

FISH inverso
Es una tcnica que se usa mucho para determinar la procedencia de
un cromosoma marcador. Este tipo de FISH tiene la peculiaridad de ser
el ADN problema el que se marca. El procedimiento consiste en recortar
un fragmento de cromosoma o dicho cromosoma marcador de una porta
donde se encuentran todos los cromosomas fijados. Se encuentran
teidos con Giemsa o con una sonda, esto sirve para marcar ese ADN y
convertirlo en una nueva sonda. A continuacin, ponemos los
cromosomas de un donantes sin anomalas (generalmente procedente
de sus linfocitos y de un varn para contemplar todas las opciones, es
decir, tener los cromosomas X e Y) en un porta y aadimos la sonda
preparada. Esperamos ver que hay hibridacin de la sonda (cromosoma
marcador)

con

alguno

de

los

cromosomas

del

donante

por

complementariedad en su secuencia. As, podemos determinar que ese

cromosoma marcador procede del cromosoma con el que hibrida. Una
vez identificado, el cromosoma marcador pasara a ser llamado un
cromosoma derivativo.

FISH on a chip:
Esta nueva tcnica conlleva numerosas ventajas, como la necesidad de
utilizar menor cantidad de reactivos, el empleo de un menor nmero
tiempo de anlisis (ya que en menos de una hora se pueden analizar los
ncleos, frente a las 2-3 horas que precisa el procedimiento de FISH
convencional), su rapidez para la obtencin de resultados, su alta
sensibilidad o su menor coste, con comparacin con la tcnica
convencional de FISH.
La principal aplicacin de este novedoso sistema es en el campo del
diagnstico clnico, sobre todo en el estudio de enfermedades
neuronales, como es el caso de la enfermedad del Alzheimer en su
estado temprano, aunque no se descarta su uso en otros campos como
en la industria alimentaria.

Se emplea un chip microfludico con estrechos canales, por los que se

hace pasar la suspensin celular purificada por capilaridad, lavada
previamente con PBS. Una vez adheridas o fijadas las clulas a los
canales

por

calor,

digerimos

las

clulas

mediante

la

adicin

de proteinasa K y desnaturalizamos su material gentico, nuevamente

por un incremento de temperatura. Tras estos pasos, ya pueden ser
aadidas las sondas y reactivos necesarios, que difundirn a lo largo de
todo el canal, pudiendo observar los ncleos bajo el microscopio en el
mismo chip y de manera ordenada.
FISH on chip es una tcnica muy til para detectar anomalas
cromosmicas (aneuploidas), entre otros defectos. En el caso
del Alzheimer, es habitual utilizar muestras de linfocitos procedentes de
sangre perifrica, fibroblastos o muestras de orina.

FISH multicolor
Es una adaptacin del FISH que permite la visualizacin de los 23 pares
de cromosomas a la vez, teidos con diferentes sondas fluorescentes.
A nivel comercial slo hay 5 colores distintos posibles, por lo que se
puede usar la sonda de un color concreto o combinar dos tipos de
sondas para crear un nuevo color. El sistema de deteccin del equipo
empleado debe estar adaptado a los 5 colores. Un programa informtico
se encarga de analizar las imgenes y formar el cariograma: organiza
los cromosomas de acuerdo a la emisin de las sondas que tiene
integradas y las combina hasta dar las 23 combinaciones. Se utiliza con
frecuencia en el estudio de clulas tumorales. El poder de dicho mtodo
reside en su habilidad para:

Determinar rpidamente si hay algn cromosoma adicional en

el cariotipo y de qu cromosoma se trata, porque su color permitir
identificarlo.

Determinar si est presente algn cromosoma translocado y qu

cromosomas estn implicados en la translocacin por la combinacin de
dos colores asociados a cromosomas diferentes en un mismo
cromosoma.

Rpida identificacin de material cromosmico de un cromosoma que

haya sido insertado en otro cromosoma por la variacin del color del
fragmento insertado respecto al color de todo el cromosoma.

Identificacin

de

cromosomas

pequeos

fragmentados

que

frecuentemente implican el problema de averiguar su origen, como es el

caso de los cromosomas marcadores.
Estas aplicaciones del SKY se deben a que cada cromosoma est
teido completamente de un nico color (de una nica sonda) y por eso,
viendo el color que van a tener todos los cromosomas de la muestra
podemos saber que anomala presenta el paciente.
Sin embargo, aunque se pensaba que iba a desbancar al cariotipo
tradicional, tiene una serie de desventajas que han frenado su uso,
especialmente el uso clnico. Estas son:

El elevado precio.

Menor definicin que el FISH convencional. Slo se pueden ver

cromosomas y traslocaciones grandes, sin poder observar bandas.

Aplicaciones
4.1.- Aplicaciones
Esta tcnica ha resultado ser muy til en el campo de la medicina reproductiva,
con aplicacin en el diagnstico gentico preimplantatorio (DGP). Resulta una
forma muy precoz de diagnstico que, apoyndose en las tcnicas de
reproduccin asistida, posibilita el estudio de embriones antes de ser
transferidos al tero materno y, por consiguiente, antes de que se lleve a cabo
la implantacin embrionaria.
Para el anlisis de anomalas cromosmicas embrionarias, tanto numricas
como estructurales, puede utilizarse la tcnica DGP-FISH. Para este fin se
requiere una biopsia embrionaria, mediante la cual se extrae una clula del
embrin en cultivo "in vitro".

Seguidamente, se procesa la muestra de tal manera que quede fijado el ncleo

en interface y se hibrida con sondas especficas para el estudio cromosmico
de la patologa que se sospecha pueda estar presente en el embrin.
4.2.- Anomalas
4.2.1.- Anomalas numricas

Alteraciones en cromosomas sexuales: Alta frecuencia de mosaicismo

en pacientes implica que, en muchos casos, slo se den defectos leves
en el desarrollo. Gran relevancia en Medicina Reproductiva por ir
asociado, en mayor o menor grado, a problemas de fertilidad. Tales son

los casos de sndrome de Klinefelter, trisoma X y monosoma X.

Edad materna avanzada, aborto de repeticin de causa desconocida y/o
fallo de implantacin: Ms de la mitad de los casos son debidos a
alteraciones en los cromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y. En estos
casos, la seleccin de aquellos embriones normales para los
cromosomas citados, aumenta las probabilidades de conseguir una

gestacin a trmino.
Factor masculino grave: Con este estudio embrionario, se pueden evitar
las alteraciones cromosmicas surgidas en la descendencia de aquellos
grupos de pacientes con calidad seminal baja y que tienen que recurrir a
la tcnica de microinyeccin intracitoplasmtica del espermatozoide
(ICSI).

4.2.2.-Anomalas estructurales
Surgen espontneamente, en la mayora de los casos, como consecuencia de
un fallo de meiosis durante la oognesis o espermatognesis, en los casos en
que los padres presentan cariotipos normales. Algunas veces, algn miembro
de la pareja puede ser portador de una anomala estructural equilibrada, que
podra transmitir a su descendencia. De esta manera, por medio del estudio
gentico especfico de embriones de la pareja portadora, podran distinguirse
aquellos embriones desequilibrados cromosmicamente de los equilibrados.
Una vez hecha esta seleccin de embriones, podran transferirse con total

tranquilidad al tero materno los embriones que no presentan la alteracin

gnica.
Una aplicacin adicional del FISH en interfase es obtener mayor informacin
sobre la organizacin de los cromosomas en el ncleo interfsico (los llamados
territorios cromosmicos).
Adems de ser til para realizar diagnsticos preimplantatorios, el FISH tiene
aplicacin en medicina para detectar enfermedades y determinar el pronstico
de las mismas, as como para evaluar la remisin de algunas enfermedades,
como el cncer. Con FISH es posible diagnosticar enfermedades incapaces de
ser detectadas por otros mtodos tradicionales que implicaban el anlisis de
cromosomas en metafase. Adems su utilizacin es mucho ms sencilla que
los mtodos citogenticos ms habituales, los cuales requieren clulas en
divisin, as como un mayor esfuerzo en tiempo y trabajo para la preparacin
manual y anlisis de las muestras.
Tambin puede utilizarse para la deteccin directa de patgenos a partir de
sangre o restos de tejidos de un paciente. Esto supone una gran ventaja
teniendo en cuenta que muchos microorganismos no son cultivables en
condiciones de laboratorio.
El FISH tambin se usa para comparar genomas de dos especies biolgicas y
deducir relaciones evolutivas. Asimismo, se puede usar en el rea de la
Ecologa Microbiana para identificar microorganismos dentro de un biofilm, as
como para observar su distribucin y localizacin dentro del biofilm o realizar
ensayos de colocalizacin utilizando sondas de distinto color para cada
microorganismo.