Publicado en Internet el 2010 Jun 17. doi : 10.1371 / journal.pgen.

1000989
Isabelle d'Erfurth,#1 Laurence Cromer,#1 Sylvie Jolivet,1 Chlo Girard,1
Gregory S. Barsh, Editor

LA CICLINA A CYCA1 ; 2 / TAM SE REQUIERE PARA LA

MEIOSIS I DE LA MEIOSIS II TRANSICIN Y COOPERA CON
OSD1 PARA LA PROFASE DE TRANSICIN PRIMERA
DIVISIN MEITICA
Abstracto
La meiosis reduce a la mitad el nmero de cromosomas, ya que sus dos divisiones
siguen una sola ronda de replicacin del ADN. Este proceso consiste en dos
transiciones de clulas, la transicin de la profase de la primera divisin meitica
(meiosis I) y la meiosis I de la meiosis nica transicin II. Mostramos aqu que la
ciclina CYCA1 de tipo A; 2 / TAM juega un papel importante en ambas transiciones
en Arabidopsis. Una serie de mutantes TAM no pudo entrar en meiosis II y esporas
diploides as producidos y gametos diploides funcionales. Estos gametos diploides
tenan un genotipo recombinada producido a travs de la divisin de la meiosis I
sola. Adems, mediante la combinacin de la mutacin tam-2 con Atspo11-1 y
Atrec8, obtuvimos plantas que producen gametos diploides a travs de una divisin
mittica-como que eran genticamente idnticos a sus padres. As tam alelos
mostrado fenotipos muy similares a la de la mutante osd1 descrito anteriormente.
La combinacin de mutaciones Tam y osd1 conduce a un fallo en la profase de la
meiosis I transicin durante la meiosis masculina y para la produccin de esporas
tetraploides y gametos. Esto sugiere que TAM y OSD1 estn involucrados en el
control de ambas transiciones meiticas.
Autor Resumen
En el ciclo de vida de los organismos sexuales, una clula especializada divisin
meiosis-reduce el nmero de cromosomas de dos sets (2n, diploide) a un conjunto
(n, haploide), mientras que la fertilizacin restaura el nmero de cromosomas
originales. La meiosis reduce ploida porque consiste en dos divisiones siguientes
una sola replicacin del ADN. En este estudio, hemos identificado los genes que
controlan la entrada en la primera y la segunda divisin meitica en la planta
modelo Arabidopsis thaliana. Las plantas que carecen de la CYCA1; 2 gen ejecutar
una nica divisin durante la produccin de gametos diploides meiosis funcionales y
plantas poliploides en la siguiente generacin. Al combinar esta mutacin con otros
dos que afectan los procesos meiticos clave, generamos plantas que producen
gametos diploides a travs de una divisin mittica como que son genticamente
idnticos a sus padres. Adems, las plantas que carecen CYCA1; 2 y otro gen
descrito anteriormente (OSD1) se someten a divisiones durante la meiosis
masculina, produciendo granos de polen tetraploides.
Introduccin
La meiosis es un elemento central en el programa de reproduccin de todos los
eucariotas se reproducen sexualmente. El proceso de la meiosis implica dos rondas
de segregacin cromosmica que siguen a una sola ronda de la duplicacin del
cromosoma que lleva a la produccin de gametos haploides. Meiosis difiere de la
mitosis, la divisin celular somtica, en un nmero de maneras. En la meiosis:
Cromosomas homlogos pareja y estrechamente asociar lo largo de una estructura
proteica llama el complejo sinaptonmico (SC). Este proceso culmina en una
subetapa de la profase llamada paquiteno. Crossover se producen entre homlogos
durante la profase.
Los cromosomas homlogos se separan en la anafase de la primera divisin. Para
asegurar la segregacin cromosmica precisa en la anafase I cada homlogo debe
permanecer conectado a la otra a travs de la metafase I. Puesto que el SC
desaparece antes del final de la profase, no puede garantizar la vinculacin de
homlogos en la metafase I. Esta conexin se mantiene hasta que la anafase I por
quiasmas, la manifestacin citolgico de cruces.
La meiosis tiene una segunda divisin sin la sntesis de ADN intermedio. Cromtidas
hermanas, resultantes de la fase S meitica, permanecen asociados hasta la

metafase II y estn separados unos de otros en la anafase II, lo que lleva a la

produccin de cuatro esporas haploides [1], [2].
Para generar esporas haploides la meiocyte debe entrar en la meiosis I, pasar a
travs de la meiosis I de la meiosis II transicin y salida meiosis II. Los errores en
estas transiciones, no son poco comunes y pueden conducir a la formacin
partenognesis o teratoma, o para la produccin de gametos con el nmero
somtica de cromosomas (gametos 2n) [3], [4]. La formacin de gametos 2n se
piensa que es un mecanismo importante para la generacin de poliploides.
Polyploidy ha jugado un papel clave en la evolucin de muchos linajes de hongos,
plantas, invertebrados y vertebrados, y es particularmente frecuente en las plantas
[5], [6]. Gametos 2n son tambin una herramienta importante para el mejoramiento
de las plantas [7].Las ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas (CDK forman
complejos) que son esenciales para la progresin a travs tanto de la mittico y
ciclos celulares meiticas. La transicin de la meiosis I de la meiosis II requiere un
delicado equilibrio en la actividad de ciclina-Cdk: debe ser suficientemente baja
para salir de la meiosis I, pero sin embargo debe mantenerse a un nivel
suficientemente alto para suprimir la replicacin del ADN y promover la entrada en
la meiosis II [8] , [9]. Precisamente cmo se modifica la maquinaria mittica para el
propsito de la meiosis no se entiende completamente. La mayor parte de los
conocimientos actualmente disponibles se origina a partir de los estudios realizados
en los hongos unicelulares, Xenopus laevis o sistemas de ovocitos de ratn.
En oocitos, la entrada en tanto meiosis I y meiosis II es impulsado por Cdc2 /
complejos de ciclina B (los componentes moleculares de la promocin de factor de
maduracin, MPF) [10]. La tasa de sntesis de ciclina B y la degradacin por la APC
(anafase complejo promover) determina el tiempo de las transiciones que ocurren
durante la meiosis [10], [11]. Al final de la meiosis I, Ciclina B es slo parcialmente
degradada [12] y el bajo nivel residual, de la actividad de Cdc2 / ciclina B es
esencial para la entrada en la meiosis II [13]. Esta degradacin parcial ciclina B est
afinado por el inhibidor Erp1 / Emi2 APC [14] - [16]. En Schizosaccharomyces
pombe, MES1 es un jugador clave en la meiosis I de la meiosis II transicin. Como
Erp1 / Emi2, la protena MES1 inhibe parcialmente la degradacin de ciclina por la
promocin de complejos anafase (APC), permitiendo as la entrada en la meiosis II
[17], [18]. En Saccharomyces cerevisiae, la supresin simultnea de dos de los seis
B de tipo ciclinas resultados en una sola divisin reduccional durante la meiosis, con
la produccin de ascas de dos spored (dadas), sugiriendo que las ciclinas
especialista puede ser responsable de la mediacin de la meiosis I de meiosis II
transicin [19] - [21].
Muy poco se sabe sobre el control del ciclo celular meitica en plantas. En el maz,
el mutante alargado produce gametos femeninos diploides porque es incapaz de
someterse a la meiosis II hembra, pero el gen correspondiente no se ha identificado
[22]. El nico gen implicado en la meiosis I de la meiosis II transicin aislado hasta
la fecha es la Arabidopsis OSD1 (omisin de la Segunda Divisin) de genes, la
funcin molecular de los cuales sigue siendo desconocido. Como osd1 mutantes no
pueden entrar en la segunda divisin, tanto en la meiosis masculina y femenina,
gametos 2n funcionales y progenie tetraploide se producen [23]. Para buscar otros
reguladores de la progresin meitica, nos hemos centrado nuestra atencin en las
ciclinas. El genoma de Arabidopsis thaliana contiene 10 de tipo A y 11 ciclinas de
tipo B, pero funciones en el ciclo celular han sido identificados por slo unas pocas
de estas molculas, probablemente debido a la redundancia atena los efectos de
las mutaciones en los genes de ciclina individuales [24], [25 ]. Una excepcin
notable a esta regla es CYCA1; 2, tambin conocida como TAM (TARDANZA
ASNCRONO MEIOSIS). En el tam-1 mutante, una nica sustitucin de un aminocido
(Thr283-Ile) ralentiza la progresin del ciclo celular durante la meiosis masculina
[26], [27]. Aqu, revisamos la funcin de CYCA1; 2 / TAM al aislar una serie de alelos,
incluyendo alelos nulos, y demostrar que CYCA1; 2 / TAM es crucial para la meiosis I
de la meiosis II transicin. Los mutantes tam fallan para entrar en meiosis II, lo que
lleva a la produccin de dadas de esporas y gametos diploides que han
experimentado intercambio gentico. Esto demuestra que la meiosis I de la meiosis
II transicin en las plantas implica una actividad de ciclina-CDK no redundante.

Adems, la combinacin de mutaciones Tam y osd1 conduce a un fracaso de la

transicin de la profase de la primera divisin meitica (meiosis I) durante la
meiosis masculina y para la produccin de productos de un solo meiticas esporas y
granos de polen tetraploides. Esto demuestra que CYCA1; 2 / TAM y OSD1 tambin
estn involucrados en la profase de la meiosis I transicin. Se discuten las
implicaciones de estos resultados para el control de las transiciones meiticas.
Adems , aprovechando de una estrategia gentica se utiliz previamente para
investigar la funcin OSD1 [ 23 ] , se combinaron tam mutantes con mutaciones
que afectan a la recombinacin homloga ( Atspo11-1 ) y la segregacin
cromosmica ( Atrec8 ) , esencialmente la conversin de la meiosis en una mittico
-like divisin. El tam / lnea Atspo11-1 / Atrec8 , llamado MIME - 2 , produce gametos
diploides que son genticamente idnticos a sus padres, apomeiosis imitando , un
elemento clave de la apomixis o reproduccin asexual a travs de semillas . Sin
embargo , mimo -2 tambin dio lugar a la produccin de diploides y aneuploides
gametos , probablemente debido a la baja penetrancia de mutaciones tam
comparacin con osd1 mutaciones.
RESULTADOS
Los Mutantes tam Produce gametos diploides
La Arabidopsis TAM (Tardy asncrono Meiosis) gen ha sido implicado en el control de
la progresin meitica [26], [27]. El tam-1 mutante muestra la progresin del ciclo
celular lenta durante la meiosis masculina, aunque s con el tiempo, al igual que de
tipo salvaje, producir ttradas. Sin embargo, previo a este estudio, slo un alelo
mutante con una mutacin puntual que conduce a una sustitucin de aminocidos
en la protena haba sido estudiado. Como esta mutacin puntual es sensible a la
temperatura y probablemente corresponde a un alelo hypomorphic, volvimos a
visitar el papel del gen de TAM por aislar y caracterizar tres mutantes de insercin
independientes procedentes de colecciones pblicas mutantes y tres mutaciones
puntuales adicionales (Figura 1A y la Figura S1). El tam-2 (sail_505_C06 [28], [29])
insercin de T-DNA se encuentra en el cuarto exn (ATG + 1130 pb) y se acompaa
de una gran delecin (correspondiente a la mitad de la secuencia de codificacin de
TAM, todo el promotor TAM regin y la primera 52 pb de la prxima gen, At1
g77400), el tam-3 (SALK_080686 [30]) insercin de T-ADN se encuentra en el
sptimo intrn (ATG + 1690 pb) y el tam-4 (CSHL_ET12273 [31] ) de insercin Ds
est en el primer exn (ATG + 62 pb). Los tam-tam-2 y 3 mutaciones estn en el
fondo de Columbia (Col-0), mientras que la mutacin tam-4 est en la Landsberg
erecta (Ler) de fondo (Figura 1). Adems, tres mutaciones puntuales se aislaron en
un metanosulfonato de etilo (EMS) pantalla de mutagnesis qumica. La mutacin
tam-5 es una G a A en el nucletido 378 de transicin en la secuencia de
codificacin que crea un codn de parada ) La mutacin tam- 6 tambin es un G
para una transicin en la posicin -1 del sitio 3 ' empalme entre intrn 2 y el exn 3.
Los tam- tam- 5 y 6 alelos son tanto recesiva y no se complementan entre s. La
mutacin tam- 7 es un G para una transicin en la posicin -4 del sitio 3 ' empalme
entre intrn 1 y el exn 2. mutaciones sitio de empalme proximales similares se han
observado en otros mutantes de Arabidopsis incluyendo det1-1 y det1-3 [ 32 ] . El
alelo tam- 7 es dominante y por lo tanto no podra ser utilizado para la
complementacin gentica de los otros alelos tam . Los tres alelos ccsme tam estn
en el fondo de Columbia ( Col- 0 ) . Los alelos de ADN- T se utilizan preferentemente
para el anlisis detallado Los mutantes tam muestran sin defectos durante el
desarrollo somtico. En Arabidopsis, la meiosis masculina produce un grupo de
cuatro esporas, organizado en un tetraedro, llamado una ttrada Cada espora da
lugar a un grano de polen. En estos seis mutantes tam independientes, los
productos de la meiosis masculina eran en su mayora dadas de esporas en lugar
de ttradasAdems de dadas equilibradas los mutantes tambin produjeron fuertes
tradas y productos desequilibrados junto con un nmero muy pequeo de ttradas.
Pruebas de complementacin con tam-2, tam-tam-3 y 4 mutantes confirmaron que
estas mutaciones eran allica. A diferencia de la temperatura descrito
anteriormente sensible tam-1 mutante, estos seis mutantes expresan el fenotipo

dada a temperaturas normales de crecimiento (20 C). Adems, la etapa de dada

en tam-1 no parece ser terminal, como meiosis siempre progresa a ttrada de
produccin [27], mientras que el tam-2, tam-3, tam-4, tam-5, tam-6 y tam -7
producido sistemticamente su mayora diadas. Esto sugiere que el tam-1 mutante
presenta solamente un retraso en la progresin de la meiosis, mientras que los
otros mutantes no progresan ms all de la etapa de dada (como se confirma por
anlisis de polen, ver ms abajo). Este fenotipo es una reminiscencia del fenotipo
del mutante osd1, produce esporas directamente despus de la meiosis I. Sus
gametos son tanto diploide y su descendencia poliploide. Por lo tanto, se determin
los niveles de ploida entre la descendencia de tam-2 diploides y tam-4 mutantes.
En la progenie de mutantes homocigotos autofecundadas, se observ tetraploides,
triploides y diploides plantas de vez en cuando (Tabla 2). Si se utiliza el polen de
tam-tam-2 o 4 plantas mutantes para fertilizar una planta de tipo salvaje, casi toda
la progenie resultante eran triploides, con slo unas pocas plantas diploides
identificados (Tabla 2). Si tam-tam-2 o 4 vulos mutantes fueron fecundados con los
granos de polen de tipo salvaje aislamos diploides y triploides plantas (Tabla 2). Por
lo tanto, la frecuencia de esporas diploides, era alta en los tam-2 y tam-4 mutantes,
tanto para el macho (~ 90%) y hembra (~ 30%) linajes. Tam mutantes producidos
slo ligeramente menos semillas que las lneas de tipo salvaje correspondientes (36
4 semillas / silicua en tam-2; 4 en tipo salvaje Col-0; 43 4 en tam-4; 52 3 de
tipo salvaje Ler), pero muchos (> 50%) de las semillas producidas por tam-2
mutantes y unos pocos (<10%) de los producidos por tam-4 mutantes se
marchitaron. Este hallazgo no fue inesperado, porque tam mutantes producen
semillas triploides con un exceso del genoma paterno que se asocia con la
produccin de semillas arrugada, en particular en el Col-0 de fondo [33]. La tasa de
germinacin de semillas producidas por tam-2 fue del 63% (n = 264), lo que sugiere
que la proporcin de semillas triploides puede ser subestimada en tam-2 progenie
Hemos caracterizado los mecanismos que subyacen a la produccin dada en
mutantes TAM, mediante la investigacin de comportamiento de los cromosomas
durante la meiosis masculina utilizando una tcnica de propagacin meiocyte
(Figura 2 y Figura 3). En el tipo salvaje, los diez cromosomas aparecieron como
temas al leptoteno, fueron sometidos a la sinapsis en zygotene y estaban
completamente synapsed, a lo largo de la SC en pachytene (Figura 2). Despus de
la desaparicin de la SC en diplotene los cinco bivalentes resultantes condensan,
revelando la presencia de quiasmas (Figura 2B). Los bivalentes organizados en la
placa de metafase I (Figura 2C) y homlogos segregados a los polos opuestos en la
anafase I (Figura 2D y 2E). Los dos conjuntos de cinco homlogos alineados en las
dos placas de metafase II (Figura 2F). La segunda ronda de la segregacin en la
anafase II (Figura 2G) llev a la formacin de cuatro conjuntos de cinco
cromosomas, que decondensed para formar los ncleos de esporas (Figura 2H).
Meiosis I en los mutantes TAM era indistinguible de la del tipo salvaje. Se
observaron todas las etapas de la profase, incluido el pleno sinapsis en paquiteno y
quiasmas en diacinesis (Figura 3B ) . Los bivalentes observaron a diacinesis ,
condensan y alineados en la placa metafsica . Hemos cuantificado la frecuencia
chiasma mediante el estudio de la forma de metafase I bivalentes , tal como se
describe en [ 34 ] , [ 35 ] , y no se encontraron diferencias entre los tam- 2 ( 9 0,8
quiasmas por clula , n = 70 ) y el tipo salvaje ( 9,1 1 quiasmas por clula , n =
53 ) . Los bivalentes segregados en anafase I y decondensed en telofase I. Sin
embargo , no se encontraron cifras meiosis II (entre 1000 > meiocytes varones por
cada tam- tam- 2 , 3 y tam- 4 , a partir de la profase de la formacin de esporas ) ,
en consonancia con la produccin dada en mutantes tam resultantes de la
ausencia de una segunda divisin meitica . Se observaron figuras Tanto tpico
meiosis I y meiosis II durante la meiosis hembra ( comparar Figura 4 y Figura 5 ),
consistente con la produccin observada de ~ 70 % haploides gametos femeninos
en mutantes TAM y la nocin de que megasporas diploides hembra tambin se
producen sin esperar por segunda divisin meitica .
Si gametos diploides son, en efecto generan saltarse la segunda divisin meitica
por, cualquier heterocigosidad de los padres en los centrmeros se debe perder en
los gametos diploides tam , porque la hermana centrmeros cosegregate en la

divisin I. A la inversa , tambin esperara heterocigosidad para aumentar hacia los

telmeros , debido a la recombinacin entre el locus correspondiente y el
centrmero. Pusimos a prueba esta hiptesis de dos maneras , mediante la lnea de
etiquetado fluorescente ( FTL ) Sistema ttradas Arabidopsis proporcionar
informacin directa sobre el contenido gentico de los granos de polen ( Figura 6 ,
Figura 7 , Figura 8 ) y por genotipo masculino y femenino tam- 2 triploide
descendencia para marcadores moleculares polimrficos
osd1, tam, tam / osd1, MIME y mime-2 gametos masculinos y femeninos
diploides.
El sistema FTL es un ensayo visual basado en el uso de construcciones de reportero
protenas fluorescentes de codificacin producidos en el polen del mutante cuarteto
(qrt1-2) [38]. En este mutante, los granos de polen de cada meiosis permanecen
unidos fsicamente. Hemos llevado a cabo cruces para generar plantas tanto con la
qrt1-2 y tam 2-mutaciones, heterocigotos para una o dos transgenes reportero que
confieren fluorescencia polen. Como controles, se utiliz tanto de tipo salvaje y osd1
plantas mutantes. En primer lugar, utiliz un transgn FTL situado cerca del
centrmero del cromosoma 5 (FTL3253 codifica AmCyan) [39]. En tipo salvaje
(fondo qrt1-2) plantas de control, todos ttradas consistieron en dos y dos granos
de polen no fluorescentes fluorescentes (Figura 6A), lo que refleja la segregacin de
las cuatro cromtidas, dos de los cuales lleva el transgen (n = 120) . En los osd1-1 y
tam-2 mutantes, se observ principalmente diadas de polen (Figura 6B-6E).
Adems, en ambos mutantes, la gran mayora de dadas (91%, n = 526 y n = 738,
en osd1-1 y tam-2, respectivamente) consisti en un grano de polen fluorescente y
un grano de polen no fluorescente (Figura 6B y 6C). Por lo tanto, en estas dadas,
uno de los granos de polen contena las dos cromtidas hermanas que llevan el
transgn, mientras que el otro grano de polen hered los otros dos cromtidas
hermanas. Este patrn de segregacin es plenamente coherente con la ausencia de
una segunda divisin meitica. En una pequea proporcin de dadas (9% tanto en
osd1-1 y tam-2 mutantes) tanto granos de polen eran fluorescente, lo que indica la
recombinacin entre el transgn y el centrmero A continuacin, llev a cabo el
mismo experimento con dos transgenes vinculados FTL situadas a cierta distancia
del centrmero del cromosoma 5 (FTL1273 DsRed2, FTL993 ECFP) [39]. En el tipo
salvaje (fondo qrt1-2), se observ ttradas sin (Figura 7A) y con (Figura 7B)
recombinacin de los marcadores como se describe en un estudio anterior [36]. La
frecuencia de recombinacin entre los dos marcadores, medida como el porcentaje
de cromtidas no parentales deducida a partir de la distribucin de fluorescencia,
fue del 32%. En tanto el osd1-1 y tam-2 mutantes, se observ en los patrones de
segregacin dadas que reflejan cruzar entre los dos marcadores (29% (n = 262) y
22% (n = 367), respectivamente) y entre los marcadores y el centrmero (22% y
22%, respectivamente) (Figura 7C-7J). La frecuencia de heterocigosidad en los loci
marcador FTL en granos de polen diploides se determin (Figura 8). La frecuencia
de heterocigosidad fue baja prxima al centrmero y aumenta con la distancia
desde el centrmero. Todos estos resultados son consistentes con el tam y osd1
granos de polen diploides resultantes de una nica primera divisin de la meiosis
que incluye recombinacin, sin segunda divisin [23]. Para la confirmacin de este
anlisis gentico, genotipo descendencia triploide generado a partir de los gametos
masculinos y femeninos de la mutante tam-2. Introdujimos primera polimorfismos
genticos en tam-2 (Col-0 fondo) cruzando este mutante a la n-0 adhesin. En la
generacin F2, se utiliz PCR para seleccionar plantas homocigotas para la
mutacin tam-2 pero heterocigotos para una serie de marcadores de microsatlites.
Estas plantas se cruzaron, como padres masculinos o femeninos, con las plantas de
un tercer fondo gentico (Landsberg erecta, Ler). Genotipado de la progenie
triploide resultante para los marcadores moleculares trimorfas revel la
composicin gentica de los gametos 2n producidos por el mutante. El alelo Ler
estaba presente en todas las plantas (trados por el tipo salvaje Ler de gametos
haploides), mientras que la presencia / ausencia del / No-0 alelo Col-0 en los
triploides se corresponde con el genotipo de los gametos mutantes 2N. Todos los
gametos diploides ensayadas tenan las caractersticas genticas pronosticadas,
similares a las de los gametos diploides producidos por el mutante osd1 (Figura 8).

Los marcadores fueron homocigotos en el centrmero, pero muestran la

segregacin en otros loci, debido a la recombinacin. Estos resultados confirmaron
que la ausencia de una segunda divisin meitica era de hecho responsable de la
produccin de ambos gametos 2n masculinos y femeninos en tam-2.
Volviendo meiosis en mitosis
Nuestros alelos tam muestran fenotipos muy similares a la de la mutante osd1, sin
segunda divisin meitica, lo que lleva a la produccin de macho diploide viable y
gametos femeninos. Por lo tanto, los gametos diploides tam difieren de apomeiotic
(mitosis similares) gametos en que son genticamente diferentes de la planta
madre [40], [41]. Hemos demostrado anteriormente que, mediante la combinacin
de la mutacin osd1 con el mutante Atspo11-1, lo que elimina la recombinacin, y
la mutacin Atrec8, que modifica la segregacin de cromtidas, es posible convertir
la meiosis en una divisin-mitosis como (apomeiosis). Llamamos a esta MIME
mutante triple para "la mitosis en lugar de la meiosis" [23]. Hemos investigado si la
mutacin tam podra reemplazar la mutacin osd1 para convertir la meiosis en
mitosis, construyendo el / Atspo11-1 / Atrec8 mutante triple tam-2, lo que hemos
llamado MIME-2. Durante la meiosis masculina, mimo-2 plantas generan
mayormente diadas (91,2% 446/489), con slo un pequeo nmero de productos
desequilibrados. Las observaciones de comportamiento de los cromosomas durante
la meiosis masculina y femenina mostraron que el proceso de divisin se pareca a
la mitosis: 10 univalentes alineados en la placa de la metafase, con la separacin
de las cromtidas hermanas en la anafase (Figura 9). La progenie autofecundada de
MIME-2 plantas era sobre todo tetraploide, con algunas aneuploides (Tabla 2).
Retrocruzamiento mime-2 plantas, como el progenitor femenino, sobre las plantas
de tipo salvaje como resultado principalmente en triploides con unas pocas plantas
aneuploides (Tabla 2), mientras que las plantas de retrocruzamiento MIME, ya que el
progenitor masculino, en el tipo silvestre, generado una mezcla de mayora plantas
triploides, diploide y plantas aneuploides (Tabla 2). Por lo tanto, la divisin de la
mitosis, como observ en MIME-2 plantas da lugar a gametos diploides funcionales,

tam / osd1 doble mutante Saltar Divisin II en Femenino La meiosis

y Skip Ambas divisiones en masculino meiosis

Nuestros alelos tam muestran fenotipos muy similares a la de la mutante osd1, sin
segunda divisin meitica, lo que lleva a la produccin de macho diploide viable y
gametos femeninos. Luego combinamos tam-2 y las mutaciones osd1-1. El doble
mutante era casi estril, produciendo muy pocas semillas por autofecundacin.
Cruces recprocos con tipo salvaje revelaron que tam-2 / osd1-1 doble mutante era
una mujer frtil, pero masculina estril. Si vulos-tam 2 / osd1-1 mutante fueron
fecundados con los granos de polen de tipo salvaje aislamos plantas casi
exclusivamente triploides (Tabla 2). Observacin de la meiosis femenina en el doble
mutante revel I meiosis normal, pero una ausencia de meiosis II (Figura 10). El
anlisis gentico de los gametos femeninos, realizados como anteriormente,
mostraron que todos los vulos diploides ensayadas tenan las caractersticas
genticas predichos para una ausencia de segunda divisin meitica (Figura 8).
Estos resultados muestran que tam-2 / osd1-1 dobles mutantes muestran el mismo
fenotipo meiosis femenina como mutantes individuales, con meiocytes femeninos
en su defecto para entrar en la meiosis II, lo que lleva a la produccin de vulos 2n.

Un ciclina A media la meiosis I Transicin meiosis II

Mostramos aqu que uno de los diez conocidos ciclinas tipo A en Arabidopsis ,
CYCA1 ; 2 / TAM, se requiere para la transicin entre la meiosis I y meiosis II . No
fenotipo ha sido reportado para los mutantes que carecen de cualquiera de los otros
CYCA , probablemente debido al alto nivel de redundancia [ 24 ] . Por el contrario,
ninguno de los otros ciclinas fueron capaces de compensar CYCA1 ; 2 en la meiosis I
de la meiosis de transicin II. CYCA1 ; 2 puede tener una funcin especialista o
patrn de expresin , requerido para esta transicin, que no puede ser suministrado
por cualquiera de las otras ciclinas de Arabidopsis. Alternativamente, la falta de

CYCA1 , 2 puede disminuir ciclina genrico / actividad del complejo CDK , causando
la meiosis I- meiosis II transicin a fallar.

CYCA1; 2 y OSD1 estn involucrados en la profase de la meiosis I

Transicin en Male meiosis

Tanto cyca1; 2 / tam y los mutantes osd1 descritos anteriormente no pueden entrar
en la meiosis II y producir esporas despus de la meiosis I. Sorprendentemente,
meiocytes varones que carecen tanto OSD1 y CYCA1; genes 2 / TAM no logran
entrar en la divisin meitica I, produciendo esporas directamente despus de la
profase . Esto muestra que, adems de su funcin crucial en la conduccin meiosis I
de la meiosis II transicin, estos dos genes estn implicados en la profase de la
meiosis I transicin. Esto sugiere que ambos contribuyen a una actividad de
promover la entrada en la meiosis I y la entrada en la meiosis II, ms probable una
actividad de CDK. La funcin molecular de OSD1 es actualmente desconocido, sin
embargo, se ha propuesto por analoga a Erp1 / Emi2 y MES1 que puede inhibir la
actividad de APC, promoviendo as la actividad de CDK [23]. TAM / CYCA1; 2 siendo
una ciclina, puede promover directamente la actividad de CDK. Creemos que la
meiosis I de la meiosis II transicin se altera fcilmente, porque se requiere
regulacin fina de los niveles de actividad de ciclina / CDK para asegurar tanto la
salida de la meiosis I y meiosis II entrada en [8]. As, una disminucin moderada de
la actividad CDK en osd1 y cyca1; 2 / tam mutantes individuales puede causar fallo
de entrar en la meiosis II sin perjudicar la profase de la meiosis I transicin. En
contraste el agotamiento coincidente de OSD1 y CYCA1; 2 / TAM, puede disminuir
an ms la actividad CDK, perjudicando entrada en la meiosis I.
Desafortunadamente la medicin directa de la actividad CDK durante la meiosis en
Arabidopsis Actualmente no es posible. La combinacin de osd1 y / o cyca1; 2
mutantes / tam con otros mutantes que afectan a la actividad de CDK puede ayudar
a probar este modelo. En S. cerevisiae , la eliminacin simultnea de dos ( de los
seis posibles) ciclinas de tipo B ( CLB1 y Clb3 o CLB1 y clb4 ) conduce a un fracaso
para entrar en la meiosis II [ 20 ] , [ 21 ] . Sin embargo , aunque la actividad Clb3 es
especfico de meiosis II, este no es el caso para CLB1 y clb4 [ 19 ] , y la CLB1 Clb3
clb4 mutante triple apenas esporula , lo que sugiere que las tres protenas tienen
funciones en la progresin de la meiosis distintas de la meiosis I- meiosis II
transicin , similar a OSD1 y CYCA1 ; 2 / TAM .

Diferente de Control de Masculino y Femenino La meiosis

En el osd1 / tam doble mutante , meiocytes masculinos no pueden entrar en la

meiosis I despus de la profase , mientras meiocytes femeninos proceden a la
meiosis I y dejar de entrar en la meiosis II revelando una notable diferencia en el
control de la progresin de la meiosis masculina y femenina . Sugerimos que otras
ciclinas pueden compensar en parte la ausencia de CYCA1 ; 2 , durante la meiosis
femenina , y que la meiosis I de la meiosis II transicin puede ser impulsado por
diferentes mezclas de ciclinas en la meiosis masculina y femenina. Esta posibilidad
es apoyada por el cyca1 ; 2 / tam mutantes individuales siendo dbilmente
afectados en el linaje femenino, en comparacin con el linaje masculino y osd1
masculina y el linaje femenino . Un anlisis de los efectos sobre la meiosis del
agotamiento de otras ciclinas , ya sea solos o junto con TAM / CYCA1 ; 2 , se
requiere para poner a prueba esta hiptesis.

Las ciclinas Planta y meiosis

El genoma de Arabidopsis codifica 50 ciclinas o ciclinas putativos [25]. Dos de estas

ciclinas, SDS y CYCA1; 2 / TAM, se han implicado directamente en la meiosis. CYCA1;
2 / TAM es un tipo de ciclina A implicado en la progresin del ciclo celular [27] [25 y
este estudio], mientras SDS forma un grupo afuera, y juega un papel especfico en
la recombinacin con ninguna evidencia para cualquier papel en la progresin del
ciclo celular [49 ], [50]. SDS es necesario para crossovers polarizacin entre
cromosomas homlogos en la meiosis y no entre cromtidas hermanas, como en la
mitosis [50]. Un mutante hypomorphic viable de CDKA muestra defectos meiticas
potencialmente correspondientes a una combinacin de los sds y defectos tam [51]
(por ejemplo, defectos de recombinacin y progresin), en consonancia tanto con
SDS y TAM / CYCA1; 2 est implicado en la activacin CDKA. En el trigo, los genes
Cdc2 / CDKA son componentes esenciales del locus Ph1, que es responsable de la

prevencin de la recombinacin entre los cromosomas homeologous [52]. Esto

sugiere que la actividad de la ciclina / CDK puede regular finamente varios eventos
meiticos.
PLoS One. 2012; 7(4): e36338.
Published online 2012 abril27. doi: 10.1371/journal.pone.0036338
Raphael Ioannoni,1 Jude Beaudoin,1 Luis Lopez-Maury,2 Sandra Codlin,2 Jurg
Bahler,2 and Simon Labbe1,*
Juan Mata, Editor

CUF2 ES UN FACTOR REGULADOR NOVELA MEIOSIS ESPECFICO DE MEIOSIS MADURACIN

Fondo

La meiosis es la forma especializada del ciclo celular por el cual las clulas diploides
producen los gametos haploides requeridos para la reproduccin sexual. La
iniciacin y la progresin a travs de la meiosis requiere que la expresin de los
genes meiticas se controla con precisin a fin de proporcionar los productos
gnicos correctas en los momentos correctos . Durante la meiosis , cuatro grupos
de genes temporales son o bien inducidos o reprimidos por una cascada de factores
de transcripcin.

Principales conclusiones

En este informe de una novela regulador de tipo puo cobre, Cuf2 , se muestra que
se expresa exclusivamente durante la meiosis . El perfil de expresin de la cuf2 +
mRNA revel que fue inducida durante la meiosis - fase media . Ambos cuf2 +
mRNA y los niveles de protena no estn regulados por la adicin de cobre o
inanicin. La transcripcin de cuf2 + requiere la presencia de un Mei4 funcional +
gen que codifica un factor de transcripcin clave que activa la expresin de
numerosos genes meiticas medias. Los anlisis microscpicos de clulas que
expresan una protena Cuf2 -GFP funcional revelaron que Cuf2 co -localizada con
ambos cromosomas homlogos y cromtidas hermanas durante las divisiones
meiticas . Las clulas que carecen Cuf2 mostraron una expresin elevada y
sostenida de varios de los genes meiticas medio que persistieron incluso durante
finales de la meiosis. Por otra parte, las clulas que llevan alelos interrumpieron
cuf2 / cuf2 muestran una morfologa anormal de las membranas preespora y una
reduccin dramtica de la viabilidad de las esporas .
introduccin
La meiosis es un tipo especializado de la divisin celular por el cual se reproducen
sexualmente organismos diploides generan gametos haploides [ 1 ] . La
gametognesis comienza con la fase S pre- meitica durante el cual se replica el
ADN , generando de ese modo pares de cromosomas homlogos . Posteriormente,
estos cromosomas homlogos se someten a recombinacin gentica , un proceso
que se sabe que contribuyen a la diversidad fenotpica dentro de una poblacin
dada [ 2 ] . Los cromosomas homlogos y cromtidas hermanas son entonces
separados sucesivamente , generando cuatro conjuntos de cromosomas haploides
que son heredables a la siguiente generacin . En la etapa terminal de la meiosis ,
un programa de diferenciacin se induce con el fin de generar cuatro gametos
maduros listos para la fertilizacin. Considerando estas caractersticas meiticas se
han caracterizado ampliamente , los mecanismos moleculares que controlan la
progresin meitica y la maduracin de los gametos en eucariotas superiores
permanecen menos bien entendidos.
Gametos haploides estn presentes en nmeros muy pequeos en la mayora de los
mamferos, por lo que los estudios moleculares que requieren cantidades
sustanciales de material muy ardua [3]. Una dificultad adicional viene del hecho de
que ambos modelos animales y clulas de tejido de co-cultivo no son fciles de
sincronizar con respecto a su entrada en la meiosis [4], [5]. En consecuencia, el uso
de organismos modelo ha resultado ser una solucin prctica para el estudio de los
mecanismos moleculares que iniciar y controlar la meiosis [6], [7]. Entre estos
modelos, la levadura de fisin Schizosaccharomyces pombe se ha vuelto
particularmente atractiva para el estudio de los aspectos moleculares clave de la

meiosis, desde su inicio a travs de la generacin de clulas haploides maduras [8].

Clulas de S. pombe se someten esencialmente meiosis de una manera anloga a
la de las clulas de la lnea germinal en eucariotas superiores, excepto que los
gametos se diferencian en esporas que estn encerrados en un asca. Cada ascus
contiene cuatro esporas haploides que son altamente resistentes a las condiciones
adversas del medio ambiente [9]. La disponibilidad de nitrgeno provoca la decisin
de seguir o bien el mittica o meitica la va en S. pombe. En condiciones ricas en
nitrgeno, las clulas crecen mitticamente porque la quinasa Pat1 inhibe la
iniciacin de la meiosis mediante la fosforilacin tanto el factor de transcripcin
Ste11 y el inductor meitica mei2 [10]. Por el contrario, en condiciones de nitrgeno
de hambre, el factor de transcripcin Ste11 se activa e induce la expresin del tipo
de apareamiento loci [11]. Como consecuencia, las clulas haploides de tipos de
apareamiento opuesto el conjugado, formando cigotos diploides. Una cascada de
factores de transcripcin a continuacin, permite la expresin de mei3 +, que
codifica para un inhibidor de la quinasa Pat1 [12]. Una vez, Mei3 inhibe Pat1, este
ltimo se vuelve incapaz de fosforilar sus protenas diana, incluyendo Ste11 y mei2.
Como Ste11 activo fomenta mei2 + expresin, no fosforilado mei2 acumula y
desencadena el inicio de la meiosis cigticos [10]. Los cigotos se pueden volver a
un medio rico en nitrgeno antes de compromiso de la meiosis y se reanudar el
crecimiento vegetativo, la formacin de colonias de clulas diploides.
Convenientemente, estas clulas se sometern a meiosis azygotic en respuesta a
un choque hambre de nitrgeno de una manera ms sncrono de meiosis cigticos
[13]. El alelo pat1-114 codifica una versin termosensible de la quinasa Pat1. En
consecuencia, las clulas que albergan la mutacin muestran un crecimiento
sensible a la temperatura y se someten a pat1-114 meiosis y esporulacin a la
temperatura restrictiva (34 C), evitando as la va de la inactivacin Mei3
dependiente de Pat1. La ventaja de la meiosis inducida pat1-es que es ms sncrono
de meiosis azygotic [13].

Resultados

Protena S. pombe Cuf2

Anlisis de secuencias de ADN genmico de la Genome Project S. pombe revel un
marco de lectura abierto (SPCC584.02) que codifica una protena no caracterizada
la que aparece un homologa extendida en su extremo N al extremo N del factor de
transcripcin de cobre de deteccin de S. pombe Cuf1. Debido a que esta regin
comn fue compartido por las dos protenas, la SPCC584.02 locus fue nombrado
cuf2 +. El segmento de cido 60 amino N-terminal de Cuf2 muestra 42% de
identidad de secuencia y 62% de similitud de secuencia con el segmento de cido
amino Cuf1 61 (Fig. 1). Un dominio de coordinacin de cinc putativo (residuos 1-40)
se encuentra dentro de esta regin de Cuf2 y puede ser parte de un dominio de
unin al surco menor del ADN que es similar a los encontrados en los factores de
transcripcin metalloregulatory cobre caracterizadas previamente [25]. Tales
reguladores estn involucrados principalmente ya sea en la desintoxicacin de
cobre o de cobre vas de adquisicin. En particular, las protenas ACE1 y AMT1 de
las levaduras S. cerevisiae y C. glabrata, respectivamente, promover la
desintoxicacin de cobre a travs de la induccin de la transcripcin de genes de la
metalotionena y poseen un dominio de tales [26]. En las levaduras S. cerevisiae y
S. pombe, las protenas MAC1 y Cuf1, respectivamente, promueven la adquisicin
de cobre a travs de la induccin de los genes de cobre transporte [20], [27].
Similar a ACE1, AMT1, Mac1 y Cuf1, Cuf2 alberga una conservada (R / K) motivo
GRP (Fig. 1) que se sabe que est implicado en la unin directa de los nucletidos
situados dentro del surco menor de hlice de ADN [18] , [24]. Curiosamente, la
regin N-terminal de Cuf2, residuos especficamente 11-53, contena 9 aminocidos
bsicos (Arg16, Arg19, Arg28, Arg34, Arg36, Arg38, Lys44, Arg46 y Lys49) que estn
altamente conservadas en Cuf1 y cuya presencia ( subrayado aminocidos) se ha
demostrado que se requiere para la focalizacin de Cuf1 al ncleo [28]. Los
primeros N-terminal de residuos de cido 60-amino de Cuf2 tambin compartieron
una fuerte homologa de secuencia con las secuencias terminales N de las protenas
ACE1 y AMT1. Sin embargo, Cuf2, como es el caso de Cuf1 no poseer la segunda
mitad del cobre dominio regulador ACE1 / AMT1 en el que se encuentran dos muy

conservadas Cys -X- Cys secuencia de motivos [ 20 ] . La ausencia de estos dos

pares de Cys en Cuf2 hace improbable la formacin de dominio regulador de cobre
ACE1 / AMT1 -como que consta de dos lbulos separados por una hendidura en la
que un centro de Cu4S6 se lleva a cabo en presencia de iones de cobre [ 18 ] . Por
otra parte , en oposicin a Cuf1 y Mac1 , Cuf2 no contena un dominio rico en Cys
(Cys -X- Cys -X ( 3/4 ) Cys -X- Cys -X2 - Cys -X2 -His ) situado cerca de su C terminal
que podra sentir y coordinar iones de cobre [ 29 ] - [ 31 ] . De hecho , la regin C
-terminal de Cuf2 careca de cualquier motivo potencial que podra unirse a iones de
cobre. Sin embargo, debido a que algunas caractersticas de Cuf2 eran una
reminiscencia de los factores de transcripcin de cobre regulador, la cuf2 + gen fue
aislado para su posterior anlisis .

cuf2 + se expresa exclusivamente durante la meiosis

Los experimentos iniciales utilizando clulas que proliferan en la mitosis no

detectaron la cuf2 + transcripcin independientemente del estado de cobre ( Fig.
2A ) . Por el contrario , como se esperaba , los niveles de transporte de cobre CTR4
+ ARNm ( ensayados como control ) fueron arriba ( ~ 10 veces) y abajo ( ~ 3 veces)
regulada despus del tratamiento con el tetratiomolibdato quelante de cobre
( TTM ) y el cobre , respectivamente , en comparacin con condiciones basales (Fig.
2A) . El cuf2 + transcripcin se detect por primera vez en los estudios de todo el
genoma en el que las clulas se cambiaron de mitosis para la meiosis [ 14 ] .
Despus de la entrada de clulas en meiosis, el perfil de expresin de cuf2 + revel
que alcanz un mximo de 5 h despus de la induccin meitica , lo que indica que
cuf2 + era un gen meitica medio potencialmente implicados en el proceso de
diferenciacin [ 14 ] . S. pombe cells growing mitotically carry an active Pat1 kinase
which inhibits cells from entering meiosis. Cells harboring the pat1-114 mutation
show a temperature-sensitive growth and undergo meiosis at the restrictive
temperature of 34C. The use of the pat1-114 temperature-sensitive mutant
permits the synchronization of cells in terms of their entry into the meiotic program
[12]. To further investigate the expression profile of cuf2+ during meiosis, a pat1114/pat1-114 diploid strain that was pre-synchronized in G1 mitotic-phase by
nitrogen starvation at 25C was used. The temperature was then shifted to 34C so
as to inactivate Pat1 and allow the cells to undergo synchronous meiosis. The
results obtained were consistent with data reported by others [14], namely that the
expression of cuf2+ peaked between 4 and 6 h after meiotic induction (Fig. 2B). A
homozygous pat1-114/pat1-114 cuf2/cuf2 diploid strain was generated to
validate the signal corresponding to the cuf2+ RNase protection product (data not
shown). In all of the experiments the cuf2+ transcript was found to be absent in the
disruption strain (cuf2/cuf2), irrespective of the copper status (data not shown).
To examine if copper availability had any effect on the expression of cuf2+ during
the meiotic program, the cells were either left untreated or were treated with either
the copper chelator TTM (50 M) or CuSO4 (50 M) prior to the temperature shift
(34C). Aliquots of cultures were taken every 2 h following meiotic induction, and
the steady-state levels of cuf2+ mRNA were analyzed by RNase protection assays.
Results showed that the steady-state levels of cuf2+ mRNA under basal (untreated),
copper-starved (50 M TTM) or copper replete (50 M CuSO4) conditions were
primarily increased between 4 and 6 h following meiotic induction (Fig. 2B). In
response to 50 M copper, the cuf2+ mRNA levels were induced within 4 h, but
were down-regulated to a lesser degree over time and were maintained at a level
1.4-fold above the basal mRNA levels detected in untreated cells (Fig. 2B). To
ascertain whether or not the steady-state levels of Cuf2 protein followed those of
the cuf2+ mRNA, a pat1-114/pat1-114 cuf2/cuf2 strain in which a functional
cuf2+-TAP fusion allele was returned into the genome by integration was used. The
results showed that, under basal, low or high copper conditions, Los niveles de
protena Cuf2-TAP aumentaron de una manera similar a la de los niveles cuf2 +
transcripcin, aunque cabe sealar que los niveles de estado estacionario de la
protena Cuf2 mantuvo presente durante un periodo de tiempo que lo hizo el mRNA
(Fig. 2C) por ms tiempo. Para asegurar que las condiciones de crecimiento de
clulas basales (, TTM 50 M o CuSO4) no tuvo ningn efecto negativo sobre la
progresin meitica y la esporulacin, se realiza una serie de anlisis microscpicos.

pat1-114 / pat1-114 clulas diploides se indujeron de forma sincrnica en la meiosis

y Hoescht 33342 esta en 0,5 g / l cada hora para alcuotas de cultivos celulares para
visualizar el ADN y controlar la progresin meitica. En condiciones basales y de
cobre, meiosis I producido principalmente entre 3,5 y 6 h despus de la induccin
meitica, meiosis II entre 6,5 y 8 h (Fig. 2D) y la esporulacin despus de 8 h (datos
no mostrados). Aunque la progresin meitica de clulas bajo condiciones de
inanicin de cobre leves (50 mM TTM) se redujo en aproximadamente 1 h en
comparacin con las clulas no tratadas (basal), la formacin de esporas se observ
claramente en el extremo de la meiosis (datos no mostrados). A nivel mundial, las
clulas que fueron cultivadas bajo basal, baja o elevada (50 mM) concentraciones
de cobre muestran cambios significativos en su capacidad para proceder meiosis ya
que no haba ningn defecto aparente de temporizacin en su progresin (Fig. 2D).
Tomados en conjunto, estos resultados indican que, bajo basal, las condiciones de
cobre repleta de cobre-agotado y, la cuf2 + gen se expresa de manera efectiva pero
transitoriamente durante la meiosis. Adems, la protena Cuf2 se produce
principalmente durante las divisiones meiticas, con niveles reducidos de protena
que persisten hacia el final del programa meitica.

Se requiere que el Mei4 + gen para cuf2 + expresin gnica

Estudios de todo el genoma de los efectos globales de las eliminaciones de los

factores de transcripcin-meiosis especficos han revelado que el regulador de la
transcripcin Mei4 es necesaria para la induccin de muchos de los genes
especficos meiosis media [15]. Para evaluar de forma independiente o no Mei4 era
necesario para la expresin de la mitad meitica cuf2 gen +, ensayos de proteccin
de RNasa en los experimentos meiosis sncronos se llevaron a cabo usando un pat1114 / pat1-114 mei4 / mei4 cepa diploide y los resultados se compararon con los
obtenido con un / cepa control pat1-114 pat1-114. En el caso de pat1-114 / pat1114 clulas de control, cuf2 + exhibieron un perfil de expresin gnica dependiente
del tiempo meiosis medio tpico, alcanzando un mximo 4 h despus de la
induccin meitica (Fig. 3). Por el contrario, cuf2 + mRNA estuvo ausente en pat1114 / pat1-114 mei4 / mei4 clulas de todo meiosis (Fig. 3). Adems, no se
detect la cuf2 + transcripcin en el mutante pat1-114 / pat1-114 mei4 / mei4
bajo todas las condiciones ensayadas, incluyendo basal, y cobre repleto y
condiciones de cobre-empobrecido (datos no mostrados). La observacin de que la
pat1-114 / pat1-114 mei4 / mei4 supresin cepa mostr una prdida de cuf2 +
gen expresin indica que la expresin meitica dependiente de cuf2 + mRNA
requiere Mei4.

Localizacin subcelular de Cuf2 durante la meiosis

Basado en el hecho de que Cuf2 era una protena especfico de meiosis, el siguiente
paso fue la elucidacin de su localizacin subcelular durante el programa meitica.
Por lo tanto, una secuencia codificante de GFP se fusion en marco con el extremo 3
'del gen cuf2 +. Cuando la protena de fusin Cuf2-GFP se expres en la meiosis,
que complementa la deficiencia de formacin FSM y provoc la baja regulacin de
varios genes meiticas medias en una manera similar a la de cualquiera de los de
tipo salvaje (sin etiqueta) o el TAP eptopo de etiquetado Cuf2 (datos no
mostrados). En otra serie de experimentos, un cuf2 + GFP alelo funcional se integr
en h- cuf2 y H + cuf2 clulas. Despus del apareamiento, h- / h + cuf2 / cuf2
cuf2 + GFP / cuf2 + GFP clulas diploides se cultivaron de manera que se someten
a la meiosis sincrnica azygotic. Despus de la induccin de la meiosis en
condiciones basales, la protena fluorescente Cuf2-GFP se detect por primera vez
en anafase tarda I / metafase II, y co-localizada con los cromosomas homlogos
que se haban sometido a la primera divisin meitica (Fig. 4). En la anafase
temprana II, las clulas meiticas muestran Cuf2-GFP

Un subconjunto de genes meiticas fase media muestran una

expresin elevada y sostenida en las clulas que carecen Cuf2

Sobre la base de las observaciones que Cuf2 co-localizado con el material

cromosmico (Fig. 4) y contena una regin de unin al ADN putativo, la hiptesis de
que Cuf2 podra participar en la regulacin de los genes meiticas durante el
proceso de diferenciacin sexual. Esta posibilidad se investig usando un enfoque

de microarrays para determinar si los genes especfico de meiosis se expresaron

diferencialmente en funcin del estado de Cuf2. Un pat1-114 / pat1-114 cuf2 /
cuf2 cepa mutante y / cepa control pat1-114 pat1-114 fueron pre-sincronizada en
G1 por el hambre de nitrgeno, y luego se incubaron a 34 C para inactivar la
quinasa Pat1. Estas condiciones se establecieron para iniciar y proceder a travs de
la meiosis sincrnica en condiciones basales. Microarrays se hibridaron con sondas
derivadas a partir de ARN aislado de cualquiera de cuf2 / clulas o clulas de
control (cuf2 + / +) cuf2 mutantes cuf2. El anlisis de los perfiles de expresin
gnica de datos obtuvieron nueve horas despus de la induccin meiticas revel
que 247 genes se expresan en niveles ms altos en los / cuf2 clulas mutantes
cuf2 (promediando 1.5 veces) (Figura 5A;. Tabla S1). Por el contrario, los datos
tambin revelaron que 298 genes se expresan en niveles ms bajos en los / cuf2
clulas mutantes cuf2 (promediando 1.5 veces) (Fig. 5A). La razn por la que
elegimos el punto de tiempo de 9 horas para los experimentos de microarrays se
bas en el hecho de que queramos dejar el tiempo del proceso de traslacin y el
producto proteico (Cuf2) se lleve a cabo y operar despus de la produccin de los
cuf2 + transcripciones en cuf2 + cuf2 / + clulas.

Supresin de cuf2 + conduce a defectos FSM

Los resultados mostrados anteriormente revelaron que los niveles de expresin de

varios genes meiticas fase intermedia se mantuvieron, incluso durante los
momentos finales de meiticas en ausencia de Cuf2 (Fig. 5 y la Tabla S2). Una
posible explicacin de esto es que Cuf2 podra ser requerida especficamente para
los procesos de regulacin a la baja que normalmente se produjeron slo durante
los pasos divisiones. La ausencia de Cuf2 provocara errores que puedan poner en
riesgo la calidad y cantidad de forespores. Para probar esta posibilidad la
diferenciacin meitica en clulas diploides h + / h- cuf2 / cuf2 se compar con la
de h + / h- cuf2 + / + cuf2 clulas de control (Fig. 7A). Ambas cepas fueron presincronizadas en G1 por inanicin de nitrgeno y fueron luego sincrnicamente
inducidas a experimentar meiosis azygotic. En el caso de las clulas de control, 4
FSMs se detectaron 8 a 9 h despus de la induccin meitica (Fig. 7A). La presencia
de FSMs se confirm usando una protena Psy1 GFP-etiquetado como Psy1 es un
marcador FSM bien establecida [34]. Se observ un nmero anormal de FSMs en el
caso de las clulas mutantes cuf2 / cuf2. Especficamente, ~42% de las clulas
mutantes exhiben ms de 4 FSMs por ASCUS (Fig. 7, A y B, grupo ii), mientras que
~ 18% de las clulas muestra 3 FSMs por ASCUS (Fig. 7, A y B, grupo iii). Muchos /
cuf2 clulas cuf2 mostraron FSMs de varios tamaos (~ 15% de las clulas),
incluyendo FSMs alargadas con pequeos brotes que forman una forma que
recuerda a un shmoo (Fig. 7, A y B, Grupo IV) como se inform anteriormente [35].
Para confirmar que el meitica defecto maduracin FSM era debido a la inactivacin
de cuf2 +, una h cepa + / h- cuf2 / cuf2 fue creado en el que de tipo salvaje cuf2
+ GFP / cuf2 + GFP alelos fueron devueltos por la integracin y expresaron bajo el
control de el promotor cuf2 +. En estos experimentos, se observ la formacin FSM
normal cuando la cepa se someti a meiosis azygotic de una manera similar a la
observada en las clulas de control