Qu es la cromatografa?

Qu es la cromatografa?

???

Fase
Fija

Fase
Mvil

Consiste en un solido o
un liquido fijado a un solido
por donde el cual pasa
la fase mvil

Consiste en un liquido o
un gas que es arrastrado
a travs de la fase estacionaria

Tipos de cromatografa
(segn la disposicin de la fase estacionaria)

Plana
Anlisis cualitativo (NO CUANTITATIVOS!!!)

En papel
Fase estacionaria: papel de filtro

Tapa
Cubeta

Papel (FE)

Solvente (FM)
Mezcla
a resolver

Se basa en la diferencia de velocidad con la

que se desplazan los componentes de la
muestra, lo cual esta dado por el tipo de
interaccin con la fase mvil

Tipos de cromatografa

Plana
Anlisis cualitativo

En papel

En capa fina

Fase estacionaria: placa (papel)

recubierta con una capa delgada
de fase estacionaria,
generalmente se utiliza slice

Tipos de cromatografa

Plana

En Columna
(segn tipo de fase mvil)

En papel

En capa fina
Gases

Lquidos

Fluido supercrtico

Tipos de cromatografa

En Columna

Utiliza una columna que se llena con un soporte slido

adsorbente (gel de slice (SiO2) y almina (Al2O3)) y se
hace pasar a travs de ella la fase mvil.
La muestra que se quiere separar se deposita en la parte
superior de este soporte por efecto de la gravedad, hace
mover la muestra a travs de la columna.
Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la
fase estacionaria y el eluyente que fluye por la columna.
Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecer
interacciones diferentes con la fase estacionaria y la mvil, sern
transportados a diferentes velocidades y se conseguir su separacin.

DESVENTAJAS columna de vidrio

Es un proceso lento
Es un proceso poco eficaz tanto por la capacidad de separacin, como por el
nmero de solutos que se pueden separar.
Es una tcnica laboriosa
No proporciona directamente la composicin de las fracciones
Solo se pueden separar muestras del orden de gramos a mgr.

Tipos de cromatografa

Cromatografa Liquida
de Alta Presin (HPLC)

En Columna

VENTAJAS
Aumentar la eficacia de la separacin
Se reduce el tiempo de separacin
Permite acoplar un sistema de deteccin
continuo a la salida de la columna, (on line)
Aumenta el orden de deteccin (g)

Tipos de cromatografa

En Columna

FASE MOVIL
LIQUIDO

Cromatografa Liquida
de Alta Presin (HPLC)

Intercambio
inico

Exclusin
molecular
De particin

Fase normal

Fase reversa

Tipos de cromatografa

En Columna

Cromatografa Liquida
de Alta Presin (HPLC)

Las molculas se separan en solucin segn su peso

molecular (tamao).
La fase estacionaria consiste en pequeas perlas
que contienen cavidades de tamao exactamente
conocido.

Exclusin
molecular

Tipos de cromatografa

En Columna

Cromatografa Liquida
de Alta Presin (HPLC)

La fase estacionaria tiene grupos cargados que

interaccionan electrostticamente con iones de
signo contrario que se encuentran en la fase.
permite la separacin de iones y molculas
polares

Intercambio
inico

Tipos de cromatografa

En Columna

Cromatografa Liquida
de Alta Presin (HPLC)

De particin

Fase normal

Fase estacionaria

Fase
mvil

Orden elusin

Fase estacionaria: muy polar

Fase mvil: solvente no polar
Orden elusin: sale primero el
componente menos polar

Tipos de cromatografa

En Columna

Cromatografa Liquida
de Alta Presin (HPLC)

De particin

Fase reversa
Fase estacionaria: no polar
Fase mvil: solvente polar
Orden elusin: sale primero el
componente ms polar
Fase estacionaria

Fase
mvil

Orden elusin

Tipos de cromatografa

En Columna

Cromatografa Liquida
de Alta Presin (HPLC)

Fase normal

De particin

Fase reversa

De particin

Fase estacionaria: muy polar

Fase mvil: solvente no polar
Orden elusin: sale primero el
componente menos polar

Fase estacionaria: no polar

Fase mvil: solvente polar
Orden elusin: sale primero el
componente ms polar

Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC),

EQUIPAMIENTO

 R
ecipiente de fase mvil: de vidrio o plstico capacidad de o 2 litros.
A la hora de separar se debe elegir, la fase mvil de manera que se
consiga la mejor separacin de los solutos en un tiempo de anlisis
adecuado

 ofrecer un amplio rango de presiones de

trabajo
poder utilizarse con distintos caudales de fase
mvil,
originar un flujo de fase mvil libre de
fluctuaciones
ser qumicamente inertes,
no reaccionar con la fase mvil ni con los
solutos, su interior es de acero inoxidable o de
tefln

Volmenes de trabajo pequeos

Debe evitar despresurizacin
Dos tipos de inyectores
ser qumicamente inertes,
no reaccionar con la fase mvil ni con los solutos,
su interior es de acero inoxidable o de tefln

 Volmenes de trabajo
pequeos
Debe evitar despresurizacin
Dos tipos de inyectores
ser qumicamente inertes,
no reaccionar con la fase mvil
ni con los solutos, su interior es
de acero inoxidable o de tefln

Rellenos comunes..

Son de acero inoxidable

Su longitud es entre 10 y 30 cm
Su dimetro 4 a 10 mm
Tamao de partcula de fase
estacionaria 3.5 a 10 m

Columna

Caractersticas principales que debe reunir un detector

Todos los detectores
producen una seal que se
relaciona con la
concentracin de las
especies en disolucin

TIPOS DE DETECTORES
Absorbancia

til para sustancias que absorben radiacin UV-Vis

Mas empleado
Fotomultiplicador o arreglo de diodos
Longitud de onda fija o variable

ndice de
refraccin

Mide la diferencia de ndices de refraccin entra la FM y la FM+M

Baja sensibilidad
Deben estar termostatizados

Conductividad

Principalmente se lo usa en cromatografa de intercambio inico

Baja sensibilidad
Sensibles a impurezas en la FM

Fluorescencia

Espectrometra
de masas

Para analitos fluorescentes o derivados

Se debe elegir exc y emisin
Alta sensibilidad

Electroqumico

Tipos de cromatografa

Plana

En Columna
(segn tipo de fase mvil)

En papel

En capa fina
Gases

Lquidos

Fluido supercrtico

Tipos de cromatografa

En Columna

Gases

FASE
MOVIL GAS

Gas portador o carrier : Fase mvil

Funcin: transportar los componentes de la muestra a travs

de la fase estacionaria
Caractersticas: debe ser gas inerte, de alta pureza (99.9995%)
Flujo: Su flujo esta directamente relacionado con la separacin
de la muestra, debe ser controlado para lograr una separacin
ptima.

Que gas elijo?

Sistema de inyeccin

Capacidad de autosellado
( en el momento en que se retira la aguja)

Objetivo: vaporizar a muestra a analizar e incorporarla en la corriente del gas

portador que se dirige a la columna.
Requisitos: vaporizacin e inyeccin muestras: la vaporizacin debe ser lo mas
rpida posible, se deben vaporizar todos los componentes de la muestra.
Caractersticas: bloque metlico capaz de mantener la T cte y aislamiento
trmico, dentro del cual se encuentra el sistema de inyeccin.

Muestra

Mezclas cuyos constituyentes sean

voltiles
Temperaturas de ebullicin hasta 300 C
Que sean trmicamente estables

Horno

La T debe ser igual o ligeramente mayor al Peb

promedio de la muestra
Para muestras con amplio intervalo en ebullicin se
usan rampas de T
Debe mantener la T constante en todo su volumen

Columna

Columnas empacadas

Estn hechas de acero inoxidable o vidrio

Longitud de 1 a 15 metros
Dimetro de 2 a 4 mm
Mayor capacidad de muestra que las capilares

Columnas capilares

Son mas eficientes

Longitud hasta 100 metros
Diametro de 0.2 a 0.3 mm
Requieren menor capacidad de muestra y menos
flujo de carrier

Detectores
Caractersticas principales de un
detector

Tipos de Detectores
Universales
Responden prcticamente a cualquier compuesto

Conductividad
trmica

Responde a la diferencia de conductividad trmica entre el

carrier puro y el carrier + muestra.
El cambio de temperatura se traduce en una variacin de
la seal elctrica.
No destructivo.

Tipos de Detectores
Universales
Responden prcticamente a cualquier compuesto

Ionizacin de
llama (FID)

La mayora de los compuestos

orgnicos se pirolizan a la temperatura
de
la
llama
y
producen
iones/electrones que conducen la
electricidad a travs de la llama.
Elevada sensibilidad, gran estabilidad y
rango lineal elevado.
destructivo

Tipos de Detectores
Universales
Responden prcticamente a cualquier compuesto

Captura
electrnica

Muy sensible
Altamente selectivo
Se usa particularmente para halgenos
y grupos nitro
Se basa en la captura de electrones
libres procedentes de la ionizacin del
gas
portador
disminuyendo
la
intensidad de la corriente
No destructivo

Tipos de Detectores
Universales
Responden prcticamente a cualquier compuesto

Conductividad
trmica

FID

Captura
electrnica

Anlisis cromatogrfico

Esta tcnica permite no solo separar los componentes

de una muestra sino tambin su identificacin y
cuantificacin

Anlisis Cualitativo
Identificacin individual de especies presentes en la muestra

Determinacin de la identidad de la muestra

Esta basado en la medida de parmetros cromatogrficos
Retencin: uso de datos de retencin de un
analito para su identificacin
Tiempo de Retencin
tR
es funcin de:

Naturaleza de la fase estacionaria

Longitud de la columna
Naturaleza y flujo de la fase mvil
Temperatura de la columna
Tamao de la muestra

En condiciones
experimentales CONSTANTES
el tR
es caracterstico de cada
sustancia, pero OJO no es
universal!!!

Anlisis Cuantitativo
Esta basado en la medida de alturas u reas de picos
cromatogrficos que se relacionan con la concentracin

Deben ser comparados

con una sustancia patrn

Parmetros cromatogrficos

tR :tiempo transcurrido desde la inyeccin

tR,1
tR,2
tM

de la muestra al mximo del pico

tM: tiempo necesario para que la fase

tR

movil atraviese la columna

tR: tiempo retencin ajustado:

tR = tR - tM

Anlisis Cuantitativo

rea Concentracin

Cmo?

Cromatografa Liquida
de Alta Presin (HPLC)

Fase
Fija

Columna analtica C18 de fase reversa

Fase
Mvil

55% de Buffer fosfato 0.25 M, pH 3

45% de metanol

gd

De particin

Fase
reversa

Detector

UV-VISIBLE

Elegir longitud de
onda de trabajo

Cmo?

Cmo?
Inyectar cada estndar e identificar el tR en las condiciones de trabajo

tM

tR,caf
IDEM PARA:
CIDO BENZOICO Y
ASPARTAMO

Cmo?

Intensidad / u.a.

Inyectar cada estndar e identificar el tR en las condiciones de trabajo

tM

tR,caf
IDEM PARA:
CIDO BENZOICO Y
ASPARTAMO

t / min

Cmo?
Inyectar cada estndar e identificar el tR en las condiciones de trabajo

ACIDO BENZOICO Y ASPARTAMO

Obtener el porcentaje de cada componente en la bebida cola

, CIDO BENZOICO Y ASPARTAMO

Determinacin de cidos grasos por

cromatografa gaseosa

Analizar la influencia de los diversos parmetros

instrumentales en la identificacin y separacin de los
componentes presentes en una mezcla de steres metlicos.
Seleccionar las condiciones instrumentales ptimas para dicha
separacin.
Resolver una mezcla de metil-steres de cidos grasos.

Cmo?

Cromatografa Gaseosa

Fase
Fija

Columna capilar Supelco SPB-2250 (50 % metil - 50 % fenil siloxano),

Longitud: 30 m, dimetro interno: 0,25 mm, espesor de film: 0,20 mm.

Fase
Mvil

He, N2 confirmar!
Flujo

Procedimiento experimental
1.- Inyectar el patrn de steres metlicos de triglicridos de origen marino
2.- Optimizar la resolucin de la muestra variando distintas condiciones
instrumentales como la temperatura del horno y el flujo del gas portador.
Anlisis de los resultados
Discutir los resultados obtenidos.
Informar las condiciones experimentales, los tiempos de retencin de cada
componente de la mezcla y
Informar la composicin porcentual de cidos grasos en las muestras.
Obtener los parmetros que caracterizan la eficiencia de la columna para estos
analitos en las condiciones de trabajo (k, a, N y H).