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Clase 7

Purificacin de protenas
Veamos entonces purificacin de protenas. Hay tcnicas Cromatogrficas, Tcnicas Electroforticas,
Tcnicas de dilisis, Tcnicas de precipitacin (que es lo que estamos comenzando ahora), Criterios de
Purificacin, que son: a) Pureza y Rendimiento, y b) Actividad Total y Actividad Especfica. Y de eso
vamos a hablar ahora.
Para qu les puede servir a ustedes la purificacin de protenas, si un mdico va a comprar todo en polvo,
en una cajano tiene que purificar nada? sta es mi opinin: para leer papers. Porque cuando lean un
artculo cientfico y estn trabajando con una protena (sobretodo si es una protena nueva), va a aparecer
en metodologas cmo se purific esa protena, y ustedes tienen que tener los criterios suficientes para
seguir esa metodologa y aceptarla o rechazarla o criticarla. Entonces, principalmente, para seguir la
literatura cientfica de protenas que son emergentes o de algn artculo clsico en el cual se indique cmo
se purific el ?. Y para qu tambin les sirve? Es un pretexto para poner en prctica todo lo que hemos
aprendido desde ac hacia atrs.
Veamos la separacin de protenas. A ver, aqu hay dos elementos que son importantes cuando uno separa
una protena, y de qu la estamos separando? Imagnense, tenemos una clula, las clulas tienen miles de
protenas, y miles de tipos de molculas, que no son protenas, no todas son protenas. Lo que nosotros nos
proponemos es aislar UNA protena, una sola (y probablemente est en muy baja concentracin) para
hacer estudios de funcionalidad y saber esa protena en qu tipo de proceso biolgico est. Aislar esa
protena tiene un desafo doble: 1) que ojal pueda aislar mucha protena, de tal manera que la pueda
manipular fcilmente, o sea hablar de mg. y g. de protenas purificadas para hacer estudios con esa
protena, y 2) ojal que esa protena que yo aslo (y que al final la veo en una consistencia que puede ser el
polvo, por ejemplo), esa protena, tenga la posibilidad, que tenga el atributo de ser pura, es decir, que no
tenga contaminantes. No me sirve una protena que est muy contaminada para un estudio de
funcionalidad. Entonces yo necesito criterios de pureza (que es lo ltimo que dije) y de rendimiento
(que es lo primero que dije). El rendimiento tiene que ver con cunto estoy obteniendo, y la pureza tiene
que ver con qu estoy obteniendo. Entonces todas las tcnicas que vamos a ver ahora siempre tienen un
compromiso entre Rendimiento y Pureza, de acuerdo? Y a veces uno para obtener mucho rendimiento, o
sea para obtener gramos de una protena, necesito sacrificar la pureza de la protena. Y otras veces para
obtener mucha pureza, necesito sacrificar el rendimiento porque supone hacerla pasar a travs lneas
sucesivas de purificacin, que hacen que yo vaya perdiendo protena en el camino, pero me estoy
asegurando que esa protena va a terminar siendo pura. Por lo tanto, son dos conceptos que a veces se
contraponen y por lo tanto la purificacin de la protena supone un compromiso entre purificacin y
rendimiento. Entonces, vamos a ver distintas tcnicas, y muchas de estas tcnicas se utilizan una a
continuacin de la otra, de tal manera que me asegure que el producto est puro. Pero probablemente hay
un orden obligado de algunas tcnicas y por ejemplo una de las tcnicas que primero se aplica en un
compuesto, en un extracto del cual yo quiero purificar una protena es la Precipitacin Salina y les voy a
explicar por qu.
Precipitacin Salina

Qu es lo que hay que hacer primero si yo quiero obtener una protena? Vamos a poner un ejemplo
verdico del que no me debo avergonzar porque forma parte de mi historia personal, as que les dir que
purifiqu una vez la protena de la alcayota, s, la alcayota, y es una enzima proteoltica, es decir, capaz de
romper protenas, es decir, hidroliza el enlace peptdico. Entonces, qu deba hacer yo para purificar la
enzima de la alcayota?
(la enzima proteoltica). Es una enzima ya?, la mayora de las enzimas son
protenas. Recientemente se est hablando que hay RNA que tienen actividad enzimtica, por eso hago el
alcance, pero realmente, y en general, las enzimas son protenas. Entonces, haba una enzima que rompa
protena (que era la enzima proteoltica de la alcayota), y haba que purificarla. Qu haran? Romper la
alcayota cierto?, sacar la pulpa. Sacamos el jugo de la alcayota. Aqu tenemos que tomar una decisin.
Primero, la enzima es intracelular o extracelular? Porque si es extracelular, no hay ningn problema en
sacarle el juguito. Si es intracelular hay que romper toda la clula para que la enzima salga, as que ya
tenemos un primer problema. Tendra yo que homogeneizar el tejido vegetal de la alcayota, de tal manera
que me asegure que estn todos los citoplasmas expuestos digamos y la protena por tanto la puedo
obtener en el exudado de la alcayota. As que, de acuerdo, sta es extracelular y es fcil, sacamos el
juguito a la alcayota. Qu hacemos? Tengo pedazos de alcayota, tengo la cochina no msqu hago?
Filtro. Colamos, filtramos. Y despus tengo un jugo que yo supongo que es relativamente puro. Una de
las primera tcnicas que se ocupa (y en el caso de la alcayota que se ocupaba), lo que uno hace es aplicar
sal, para variar la solubilidad de las protenas. Y cuando agregamos sal, suceden dos cosas. Y veamos la
protena B en este grfico:
Fig. 1. Cuando se agrega una sal, hay dos efectos sobre la solubilidad de una protena:
- Solubilizacin por salado.
- Precipitacin por salado.

Y esto es
solubilidad
versus

concentracin de sal. Primero aumenta la solubilidad y despus disminuye la solubilidad. Por qu? De
qu modo aumenta? Primero, pensemos, vienen de poco soluble, qu significa que sean poco soluble?
cmo estn entre s? se quieren o se odian? Se quieren, se abrazan. Si son hidrofbicas estn juntas
porque los dems las rechazan cierto? Si son hidroflicas estn juntas porque tienen afinidad mutua, y por
lo tanto no interactan tanto con el agua. Si fuese as, diramos que tienen poca solubilidad. [pregunta k
es solubilidad y la maca responde bien] La solubilidad por lo tanto depende de la pareja solvente-soluto.
Y hasta aqu no ms disuelve la protena del agua, hasta aqu no ms con esa concentracin de sal, esta
concentracin de sal es la mxima [q disuelve]. Y lo que pasa es que para interferir con la afinidad que hay
entre molculas de las protenas que hacen que se vayan al fondo y no interacten con el agua, necesito
agregar sal, para que la sal se interponga en la interaccin entre las protenas, de tal manera que las cargas
de la protena interacten ms bien con la sal que con la misma protena, y como la sal es soluble, todo
feliz. El problema es cuando agrego ms sal, porque voy a llegar a un mximo de solubilidad con la
protena B, pero cuando (y a esto se le llama salting-in =solubilizacin por saldo [cuando la curva sube] y
a ste [cuando la curva baja], salting-out = precipitacin por salado) agrego ms sal, por qu empiezan a
precipitar las protenas? [un nio responde algo de que le kitan el lugardisminuyen las interacciones con
las protenas]. Exacto, entonces las protenas se sienten rechazadas y precipitan. Ahora, esto es espicfico
para una protena, la protena B, la protena A y C van a responder de manera distinta, y ESE es el secreto
para purificar. Porque significa que si yo agrego una oncentracin de sal determinada va a haber protenas
ms solubles que otras. Por ejemplo a sta concentracin, la soluble va a ser la C y las insolubles la B y la

A. [Seala en el grfico, cuando la curva C est arriba y las de A y B abajo]Lo que significa que si yo
centrifugo este compuesto a esa concentracin de sal, voy a obtener precipitado de A y B, y soluble de C,
y as me quedo con la protena C. Uds. dirn: pero si esto no precipita completamente, bueno obvio ,
si es la primera etapa de purificacin, pero indudablemente enriquec la protena C. Y lo mismo pasa si
agrego poquita sal, voy a tener ms soluble la A que la B y la C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de
las protenas y eso es empleado como una etapa primera de purificacin de protenas. Ojal no la
denature, porque si la denatura, sonamos con la purificacines difcil renaturar las protenas. No se dice
redenaturar, se dice Renaturar
Cmo puedo ver una protena que es microscpica? Cmo puedo saber que la protena est presente?
Viendo la funcionalidad de la protena.
Qu es la solubilidad? (una vez ms) cantidad mxima de soluto que se puede disolver en un solvente
determinado, por lo tanto depende de la pareja solvente- soluto , as que hasta aqu no mas disuelve la
protena del agua , hasta aqu no mas con esta concentracin de sal, hasta aqu no mas esta concentracin
de sal es la mxima. Y lo que pasa es que, para interferir con la afinidad que hay entre las molculas de la
protena, que hace que se vayan al fondo y no interacten con el agua, necesito agregar sal, para que la sal
se interponga en la interaccin entre las protenas, de tal manera que las cargas de las protenas interacten
mas bien con la sal que con la misma protena, y como la sal es soluble, todos felices. El problema es
cuando agrego mas sal, porque voy a llegar a un mximo de solubilidad con la proteina B, a eso se le
llama salting in, y a este proceso que viene salting out, que significaria (solubilidad por salado, y
precipitacin por salado)
Entonces salting in le denominamos a esta primera fase, y cuando agregamos mas sal, porque empiezan
a precipitar estas protenas? Porque ah la sal empieza a interactuar con el agua, no permite que las
proteinas lo hagan, y por lo tanto a las protenas no les queda mas que interactuar entre si, se sienten
rechazadas y luego precipitan. Ahora esto es especifico para la proteina B, la proteina A y C van a
reaccionar de manera distinta, y ese es el secreto para purificar, porque significa que si yo agrego una
concentracin de sal determinada, va a haber proteinas ms solubles que otras. Por ejemplo a esta
concentracin X, la soluble va a ser la C y las insolubles van a ser la A y B, y significa que si yo
centrifugo ese compuesto a esa concentracin de sal, voy a obtener precipitado de Ay B, soluble de C y
me quedo con esa proteina. Si no precipita completamente es porque es la primera etapa de purificacin,
pero indudablemente enriquec la proteina C si agrego sal. Y lo mismo podra pasar si agrego poquita sal,
voy a obtener mas oluble la A, que la B y C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteinas y eso
fue empleado como una etapa primaria de purificacin Ojala no la denature, por que si lo hace no se puede
purificar, porque es difcil renaturar.

Entonces la solubilidad aumenta


porque al
agregar sal, el primer efecto al haber pocas
concentraciones de sal, es disminuir las
interacciones entre las protenas, porque la sal
compite. La sal esta disuelta asi que todo bien
para que las protenas tambien esten disueltas, no
se van al fondo.
Pregunta: como saber hasta que punto agregar
sal, si se poco de la proteina? Ensayo y error, y te vas dando cuenta cuando tienes mucha mas pura la
proteina que te interesa.
Como veo una protena que es microscpica? Viendo la funcionalidad de la proteina, por ejemplo si
tengo una protena que es inflamatoria, para saber si la tengo los extractos de la protena se los inyecto en
la pata de una rata, y veo si se inflama o no midiendo el dimetro de la pata. Eso se llama ensayo
biolgico, tenemos ensayos quimico, bioquimicos y biolgicos del extracto que estas obteneniendo y
saber si la tienes en mayor o menor concentracin, y al mismo tiempo mides protena total, para saber con
cuanta protena te estas quedando. Se hacen los 2 tipos de mediciones proteina total y funcionalidad de la
proteina, asi que, es necesario poder observar la proteina de alguna manera, sino no se si la tengo o no la
tengo.

Hay otro mtodo de purificacin: La dilisis. Imagnense que precipite la enzima proteolitica de la
alcayota, y lo que obtuve, me quede con el precipitado, no con el soluble. Y la redisuelvo, y va a estar
contaminada con sal, porque el mtodo anterior que utilice fue precipitacin salina, entonces lo que esta
rojo seria la sal, y lo que esta en verde seria la protena. Y si pongo
una membrana de celofn o semipermeable, con un dimetro de poro
que permita que salgan los iones de sal, pero no permita que salgan
la protena, entonces a travs de difusin simple yo veo que sal
empieza a migrar hacia el espacio del compartimento que esta a
fuera que es pura agua, y voy a quedar con la protena mucho mas
pura, voy a eliminar contaminantes de bajo peso molecular a travs
de la dilisis.
Ahora piensen que tal vez esa protena tena una molcula que
siempre la acompaa y que la inhiba o bajaba su actividad, probablemente esa molcula en ese paso salga
y la pierda. Entonces tengo que tener conciencia del proceso que estoy aplicando, porque estoy
introduciendo modificaciones en la muestra, y probablemente haya algn factor que sea importante para la
actividad de la enzima, y que a lo mejor encenda o apagaba la actividad de la enzima y lo voy a perder si
era de bajo peso molecular, as que puede que suceda y puede que no. Si son molculas de alto peso
molecular, se aplican otras tcnicas ms gruesas, y se va afinando con otras mas especificas.
Cuando uno trabaja con una protena que no se conoce, se debe estar atento a todos los resultados y tratar
de interpretarlos.
Esa era una segunda etapa de purificacin, y es bastante gruesa. Ahora yo tomo los extractos que obtengo
ac, y los ocupo en tcnicas que voy mostrando a continuacin.
Hay un tipo de cromatografa que es la de particin, es cuando a travs de la solubilidad se separa un
soluto que se distribuye en forma diferente en fase slida como un papel, a una fase mvil que puede ser
una muestra de distintos solventes, agua con etanol, con butanol, distintos alcoholes para dar la polaridad
apropiada. Consista en una cmara con un solvente o mezcla de solventes con una polaridad
determinada, y ponan un fase slida que poda ser un papel, que es pura celulosa (que a su vez esta
formada por glucosa), la celulosa tiene enlaces glucosidicos, B 1-4 para establecer las cargas, son puros
polimeros de enlaces B 1-4. Cuando tienen estos enlaces en la celulosa se establece un polimero, que ese
constituye el papel en este caso. Pero esa celulosa tiene afinidad por el agua, por lo tanto esta hidratada.
Cuando agregamos una muestra, esta sube por cuanto tiene afinidad por el solvente, y el solvente sube por
capilaridad. Por qu sube por capilaridad? El solvente tiene polaridad, la glucosa tiene polaridad, por lo
tanto empieza a interactuar con la glucosa y tiende a subir, porque tiene afinidad, hay fuerzas que la une a
la glucosa, y si hay mucha glucosa arriba en al celulosa, tiende a subir el liquido porque se estn
encaramando las molculas del solvente sobre la celulosa, entonces sube el solvente (no solo es agua,
puede ser con componentes mas apolar, como ser alcohol) a travs del papel y el soluto que estaba en la
lnea de partida con lnea segmentada, va a seguir el frente del solvente como pueda, porque ama al
solvente, al agua que hidrata a la celulosa, y a la celulosa (afinidad por el solvente y la fase estacionaria).
Entonces si tengo un aminocido muy polar, va a tener atraccin por la fase estacionaria que es glucosa y
agua, y si la fase movil, que es agua y una componente hidrofobica, va a tener menor afinidad por el
aminocido. Entonces este aminocido no sigue al frente, se va retrasando. Por qu se retrasa? La
molcula comparte su tiempo entre la fase movil y
la estacionaria, se sienta a descansar o avanza con
el solvente, eso es al azar, pero pasa ms tiempo
con quien tiene ms afinidad.

Si tengo distintas molculas, que tienen distinta


afinidad relativa entre fase movil y estacionaria,
no van migrar de la misma forma, algunas
llegaran ms lejos y otras se quedaran mas cerca
de la lnea de partida. Ah aparece Rf: que es un

coeficiente dado entre lo que migro el soluto, y lo que migro la fase estacionaria. Ustedes calculan ese Rf
y lo pueden utilizar en casos para propositos de comparacin.
Entonces aqu agregamos una muestra, una gota que se resuelve en 3 manchas, son 3 aminocidos
distintos que estoy separando. Entonces los identifico, porque despus los roco con un colorante para
aminocidos ( hay uno que interacta con el grupo alpha amino, que se llama ninhidrina, y ese colorante
cuando se roca sobre el papel marca y establece marquitas de color violeta) y paralelamente sospecho
que era por ejemplo aspartico, glutmico y fenilalanina, y pondr en paralelo los mismos pero comprados
y comparo los Rf, y si uno migra igual que el otro debe ser el que sospecho, por ejemplo, si el que pienso
es aspartico, y migra igual que el aspartico es porque debe serlo.
Pero estas tcnicas ya no se usan, pero sirven para procesar y
aplicar lo que sabe, actualmente se usan identificadores para
aminocidos, tcnicas de cromatografa de alta presin, pero
son tcnicas caras.
La cromatografa en columna se ocupa siempre, porque
tiene muchas variantes tecnolgicas, y consiste en que
agregan la muestra arriba, ah esta mi extracto, imagnense
que purifique a travs de precipitacin por saldo, resuspendi,
hice dilisis, tengo algo medianamente puro, pero quiero algo mas puro, al punto que este tan puro que
cristalice, y si cristaliza puedo hacer difraccin de rayos X para que pueda conocer la estructura, y asi
vamos avanzando en el conocimiento de lo que estoy buscando. Entonces agrego la muestra arriba, y esta
es una columna que tiene un relleno que interacta con la muestra, interacta diferencialmente con las
molculas dependiendo de su son mas grandes o mas chicas, mas cargadas o menos, mas hidrofobicas o
menos, o si tiene afinidad por algn anticuerpo, estas son todas las variantes que pueden tener una
cromatografia, as que esto es genrico. Esto interactua y dependiendo como interacta, voy a ver si se va
resolvindola muestra en distintos componentes, asi como se ve en la figura artificialmente en distintos
colores, significa que cada color es una proteina distinta.
Podra tener una separacin mas dramatica, de tal manera que al final puedo diferencialmente aislar la
proteina C de la B y la A, y para lo que hago veo la concentracion de proteina versus volumen de elusin.
Cuando cae un ml estoy midiendo que el tubo de ensayo que tiene 1 ml, mientras mas a la derecha tengo
un goteo posterior o mas tardio que hacia la izquierda. Uno va colectando en distintos tubos, porque se
esta separando.
Eluir: es salir a travs de un colector inferior de la columna, gotear, lo que escurre de la columna.
Entonces aqu tenemos el volumen,
primero sale la protena A, despus sale la
protena B, Pero cmo s que la protena A es
A y la B es B?, por que lo nico que estoy
midiendo es concentracin total de protenas. La
concentracin total de protenas la pueden medir
a travs de mtodos qumicos o bioqumicos,
como el mtodo de Lowry, el mtodo de
Bradford, unos se basan en el enlace peptdico,
qu se yo (O_o).. Pero uno puede medir
protenas aprovechando la propiedad de que los
aminocidos aromticos absorben a 280nm, y
como en general todas las protenas tienen aminocidos aromticos, entonces van a absorber a 280nm, y
normalmente lo que obtenemos ac es una absorbancia de 280nm, o sea ultravioleta, versus volumen de
elusin. Si hay DNA estamos mal, ya que el DNA absorbe ms o menos en el mismo rango, pero uno
podra pensar que a esa altura en que ya se ha precipitado, se hizo dilisis, la protena est relativamente

pura y tengo pura protena; uno podra hacer un test para ver si tengo DNA o no, y probablemente no lo
tenga.
Entonces qu deberamos hacer?: ver actividad biolgica, y si la enzima era proteoltica, o sea capaz de
romper protenas, entonces lo que yo veo abajo es un test de actividad proteoltica, o sea veo cunta
actividad enzimtica para romper protenas tiene versus volumen de elusin; si fuera un veneno de
serpiente y tiene un componente que es capaz de hidrolizar tejidos como la hialuronidasa, entonces yo
hara test para la hiarulonidasa, depende de lo que quiera observar lo que quiero determinar; si yo quiero
medir insulina, estoy aislando insulina, entonces har un test biolgico del efecto de la insulina en un ratn
y medir el efecto de la insulina en el ratn, como baja la glicemia lo que estoy inyectando en el ratn,
esto sera un test biolgico.
Realmente cuando uno hace el experimento (cromatografa en columna) cambia de color?: no, uno
solamente ve agua, no se ve nada, salvo que sea hemoglobina que sea coloreada o que quieras purificar un
pigmento como la clorofila, que no es protena, y que es verde, se podra ver, pero en la realidad no se ve
absolutamente nada, es el espectrofotmetro el que dice cul tiene mas protena que otro y en qu tubo
est la protena que te interesa.
Distintos tipos de cromatografa en columna
Esta la cromatografa de intercambio inico
que utiliza una propiedad del soluto que es
la capacidad de adquirir ciertas cargas, la
ionizacin, el soluto sera la protena, por
ejemplo. Cul es la fase de relleno de la
columna, denominada fase slida, la matriz
que contiene molculas que estn cargadas,
grupos ionizados. Cul es el solvente? Un
buffer. Por qu es importante usar un
buffer a un pH determinado?: para que no se
desnaturalice la protena, as que uno tiene
que elegir muy bien el buffer cuando est
haciendo el ensayo, y la concentracin de
sal tambin y todo eso...
Filtracin en gel, otra tcnica. Qu usa la cromatografa en gel? Tamao y forma de la protena. Es un
gel hidratado, el solvente usualmente es agua.
La cromatografa de afinidad, se basa en la afinidad por una molcula, est anclada a una fase slida, y
que va a retener a la protena cuando est prxima a ella, puede ser un anticuerpo por ejemplo que se va a
unir a la protena. Cmo la retiene? Por que el anticuerpo estara pegado a la columna y cuando haces
fluir la protena se queda pegada en el anticuerpo. Eso sera el ligando?: s.
La ltima cromatografa que vamos a ver es la cromatografa de adsorcin (adherencia, adhesin), que
utiliza la propiedad de adsorberse. La fase slida absorbente es usualmente material inorgnico y el
solvente sera no polar. Un ejemplo de adsorcin, el carbono es capaz de adsorber un sinnmero de
partculas en suspensin, por eso las pastillas para evitar la intoxicacin intestinal son pastillas de carbn,
que sera el mismo que ustedes obtendran si hacen un pan tostado, lo carbonizan y se lo comen, es capaz
de depurar el solvente porque se adsorben las molculas que son txicas, asi que tiene esa propiedad de
purificar el medio.

Entonces, veamos primero la cromatografa de intercambio inico.

Y como funciona? Ustedes tienen una columna


que tiene partculas, que aqu estn exageradas,
estas partculas son microscpicas y tienen una
carga pegada, como en el caso de estas
partculas que tienen carga negativa y por lo
tanto Qu tipo de molculas se van a quedar
pegadas en la columna?: las de carga positiva
que se representan en rojo. Se agrega de todo a
la columna, molculas positivas, de carga neta
negativa, de mucha carga positiva y mucha
carga negativa. Cuando agrego eso y veo cmo
migra, observo que las primeras que salen son
muy negativas, ya que tienen poca afinidad con
la columna, la que es de carga negativa. Cuando sigue escurriendo el buffer, lo que yo obtengo en los
tubos sucesivos, por que esos tubos automticamente se van cambiando, las molculas que eran ms afn.
Ahora las que se quedaron pegadas no van a salir simplemente. Las molculas con carga neta negativa (no
las de mayor carga negativa, sino simplemente negativa) van a salir despus de las que tenan la mayor
carga neta negativa, pero se van a quedar pegadas todas las positivas, y ah viene el problema. Cmo
hago para sacar todas aquellas que se quedaron pegadas pero que tienen afinidad diferenciada? No se
puede cambiar la carga de la columna por que pierde la afinidad por todas, van a salir las positivas y las
muy positivas. Variamos el pH, supongan que las que quedan pegadas, quedan ah porque son positivas,
por que hay cadenas laterales de aminocidos que estn positivos. Qu pasa si yo cambio el pH y tengo
un pK?: cambio el estado de ionizacin del grupo cido, lo puedo hacer pasar de neutro a negativo en los
aminocidos cidos, o lo puedo hacer pasar de positivo a neutro en los aminocidos bsicos. Cules son
los cidos?: glutmico y asprtico. Y, Cules son los bsicos?: histidina, lisina y arginina.
Si yo cambio el pH cambio el estado de ionizacin de los grupos ionizables, y eso va a depender del pH y
del pK, y eso ustedes DEBERIAN saberlo o habrselo cuestionado.. si pH es mayor que pK este grupo se
disoci, si pH es menor que pK el protn est en el grupo, y si pH es igual a pK es mitad y mitad, es
situacin de buffer. Entonces qu vamos a hacer?: vamos a cambiar los pH de tal manera que primero se
vea afectado un grupo ionizable o un conjunto de grupos ionizables de una molcula y despus los de la
otra molcula. En buenas cuentas cada molcula va a tener un valor de pH al cual va a tener carga neta 0,
el que se llama punto isoelctrico, entonces si el pH es menor que todos los puntos isoelctricos, Cmo
estn ambas molculas?: positivas, por que con cada valor de pH igual al punto isoelctrico estn neutras,
y si el pH es menor, tienen un protn que las saca de la neutralidad, por lo que estn positivas. Qu pasa
si el pH est entre los dos puntos isoelctricos?: una molcula es positiva y la otra es negativa. Y, Qu
pasa si el pH es mayor que los dos puntos isoelctricos?: ambas son negativas porque estoy aumentando el
pH del medio por sobre los puntos isoelctricos y por lo tanto las cargas son negativas porque perdieron
protones. As que si yo jugara, y aqu lo que queremos hacer es que las molculas menos positivas dejen
de serlo... Las menos positivas van a tener un punto isoelctrico mayor o menor?: menor, as al aumentar
gradualmente el pH la menos positiva se vuelve negativa y se desprende de la columna. Se queda pegada
la molcula muy positiva. No se puede subir el pH por sobre los dos puntos isoelctricos por que las
obtendra juntas, as que se sube gradualmente.
Esto se puede hacer en vez de pH, con sal, de tal manera que subo la concentracin de NaCl u otra sal,
para afectar la unin entre la protena y la columna y se despega, si la subo ms se despegan las ms
resistentes. Pero tambin se hace con pH, y en la gua ustedes van a ver problemas con pH. Esta tcnica,
se ocupa, est vigente.
Cmo es la
matriz de intercambio inico?, puede
ser
de
poliestireno
entrecruzada
con
divinilbenceno.

Lo importante es que estas matrices tienen pegadas cargas. Entonces ustedes tienen columnas que pueden
ser de resinas diferentes a las que les dije anteriormente de un material fibroso como la celulosa y sobre
ella pueden unirse algunos grupos ionizables, grupos carboxlicos que se pueden deprotonar, grupos amino
que se pueden deprotonar. Estos pasan a
configuracin negativa, estos pasan a estado neutro,
de positivo a neutro. Y tienen nombre, la que tiene
grupo carboxlico y es de celulosa se llama
carboximetilcelulosa, y estas tienen cargas netas
negativas, por que uno prepara la columna a un pH
tal que este ionizada. Y la otra es la
dietilaminoetilcelulosa, que se abrevia DEAEcelulosa, y que el pK es 9.5. A qu pH esta
ionizada la carboximetil si el pK es 3.5?: mayor que
3.5, as que esta columna tiene que estar preparada
a un pH mayor que 3.5.
Cmo es la matriz. La matriz de este cambio inico,
puede ser de poliestireno, estas molculas que estn
ac, entre cruzadas con dimetilbenceno que es lo que tienen ah. Se compra, para que se queden
tranquilos: uno se gana un proyecto, agarra un catlogo, intercambio inico, quiero tal columna y se
compra, pero hay que saber cmo funciona. Lo importante es que esas matrices tienen pegadas cargas,
como les deca. Entonces, ustedes tienen columnas que pueden ser una resina diferente a las que les dije
anteriormente, de un material fibroso como la celulosa y sobre ella pueden unirse algunos grupos
ionizables, cmo cules: grupos carboxlicos que se pueden deprotonar, grupos amino que se pueden
deprotonar. Estos pasan a configuracin negativa, estos pasan a estado neutro, de positivo a neutro y
tienen nombre: la que tienen el grupo carboxlico y es de celulosa, se llama carboximetilcelulosa y estas
tienen cargas netas negativas, porque uno prepara la columna a un pH tal que sea ionizada; la otra es la
dietilaminoetilcelulosa que se abrevia DEAE-celulosa y que el pKa es 9,5.
Ejercicio, a qu pH est ionizada la carboximetil si el pKa es 3,5 mayor o menor que 3,5: mayor que
3,5, ah va a estar ionizada, as que esa columna debe estar preparada a un pH mayor que 3,5. Y la otra: 9,5
si es menor que 9,5 qu carga va a tener la columna? Esta es la columna: aqu est positiva protonada,
neutra deprotonada. El pKa es 9,5 y el pH es 7,0 qu carga tiene esta columna? Positiva.
As que ustedes tendrn columnas, como la dietilaminoetil, que son positivas y ah intercambian
aniones porque tiene su in anulando la carga, puede ser cloruro, sodio, dependiendo de la columna y
ese in se va a intercambiar por la molcula (), por ejemplo: la dietilaminoetil tiene grupos aminos
positivos, pero puede tener cloruro contraponiendo sus cargas; cloruro es solvente, est disuelto en el
solvente qu va a suceder? Cuando agregue una protena negativa, va a desplazar al cloruro y se va a unir
a la dietilaminoetil, que es positiva. Y esta columna, intercambio un cloruro por una protena negativa, y
por lo tanto es un intercambiador de cargas negativas, sera un intercambiador aninico. La carboximetil,
es negativa por los grupos carboxlicos, los que estn neutralizados por sodio que est disuelto en el
solvente; cuando paso una protena positiva, el sodio
se va a intercambiar por la protena positiva: es un
intercambiador catinico. Por lo tanto, habr
intercambiadores aninicos e intercambiadores
catinicos.
Veamos otro tipo de cromatografa, que es la
cromatografa
de
exclusin.
Esta
cromatografa separa por tamao, que es
natural, hasta ahora no habamos pensado en
el tamao, slo habamos pensado en la carga
de las protenas. Entonces imagnense que hay
protenas que tienen la misma carga y siempre
van a salir en la cromatografa de intercambio
inico prxima, va a costar obtenerlas en
tubos separados porque son muy parecidas,
entonces miro otra propiedad: el tamao. Ya

que, que tengan la misma carga y el mismo tamao, es como mucha la mala suerte, pero sucede. Entonces
vamos a separar por tamao. As que exageramos las partculas, y estas partculas estn entrelazadas y son
hidratadas y ah el agua est como en paal de guagua: est quieta el agua hidrata el gel del paal de
guagua, es decir, el agua es el gel junto con la resina que tiene, no est fluida, est como en un estado de
gelatina, porque hay tantas molculas que hidratar que el agua est ms quieta que en medio acuoso me
entienden? Hay demasiado estorbo molecular: no es lo mismo tener molculas de agua fluyendo entre s,
que obligarlas a interactuar con una matriz porque las molculas de agua van a estar ms quietas, pierden
su libertad. Entonces, aqu tenemos un estado de gel y esta es una partcula en la cromatografa de
exlusin, uno agrega una mezcla de protenas de distinto tamao y va viendo la elusin de las protenas
conectndola a distintos tubos. Vamos a mirar actividad y concentracin de protenas, igual que antes, pero
qu va a suceder cules creen que llegan primero abajo? Antes les digo una cosa: las partculas de gel,
entre s, establecen ciertos espacios de solvente porque hay lugares en los que las partculas no se tocan,
como bolitas de ping pong, hay espacio por donde puede fluir el solvente libremente, pero al interior de la
partcula que aqu est exagerada, hay gel. Cules llegan primero? Y si me dicen cules, dganme por qu
las grandes o las chicas llegan primero abajo? Grandes por qu? Las grandes se distraen menos, porque
las chicas se van a meter al interior de la matriz. Significa que la grande es capaz de sortear todas las
bolitas de ping pong y es capaz de pasar a travs de los espacios, y las chicas se distraen. Y si yo les dijera
que las chicas, como tienen acceso por tamao a todos los lugares, no deberan ver columnas, por lo tanto
las chicas deberan llegar rpido, porque tienen acceso a todos los lugares: es como que para ellas no hay
resina. Yo hara casi una apuesta de, a quien le preguntasen de cromatografa de exclusin, va a decir que
las chicas se demoran porque se distraen porque tienen ms espacio, pero eso nunca a m me cuadr,
porque si las chicas tienen acceso a todos los lugares, deben fluir como si no hubiera resina: lo que sucede
es que las chicas se meten al entramado de las partculas y ah hay gel y ah fluye ms lento, porque el
agua est gelificada, por lo tanto no hay movimiento browniano como si estuviera lquida, as es que como
que ah se sienta a descansar: la partcula entra, se atrapa y descansa. Se sienta ms veces en la silla que la
grande porque tiene acceso a la silla, que son las partculas de gel que estn ah.
As que salen primero las grandes, salen despus las chicas.
Si son ms garbees no deberan tambin ser atrapadas por esta porosidad?
Es que las grandes no entran a los poros de la partcula, pasan por los intersticios, que son los espacios que
habra entre las pelotas de ping pong, Ahora, habr algunas partculas que como que entran y no entran y
esas son las que salen entre las ltimas y las primeras. Hay algunas que entran en algn porcentaje.
As que aqu veamos concentracin de protenas. Hay una absorcin de luz de 280 nm versus los tubos de
ensayo que vamos colectando: 0 mL, 50 mL si ustedes quieren; A, B, D, C. Imagnense la sensacin de
estar haciendo este experimento, de ser el que obtiene una protena por primera vez, y ver dnde les sale,
en realidad es fascinante el hecho de que ustedes se
estn enfrentando a algo que nunca nadie ha hecho. Si
ustedes quieren obtener la protena y estn midiendo
actividad biolgica en estos de ensayo, y se
encuentran que obtienen, pero no de actividad
biolgica sino que de concentraciones solamente: A,
B, D, C cul es ms grande? la A, la B, la D o la C?
la A es ms grande porque sale primero, la ms chica
es la C y despus sale la B y la D. Si hay una que
cabe completamente en el poro, por ejemplo la C,
imagnense que la F es ms chica que la C dnde va
a salir la F? cae junto con la C, porque la C es ms
chica y que entre, no tiene diferencia con las que son
ms chicas y tambin entran, as que salen juntas. Y las que son grandes y no entran, no tienen diferencia
con las que son ms grandes y no entran tambin, as que saldran antes y si es una ms grande que la A,
y la A no cabe en los poros, entonces van a salir juntas. Lo que tiene que hacer el bioqumico es
seleccionar otro gel con un rango de poro determinado para separar estas protenas que salen juntas,
porque son ms grandes que el dimetro de poro que ustedes eligieron: ensayo y error.

Cul es la cromatografa de afinidad? La misma tcnica: un tubo, la muestra arriba, el gel abajo, si
ustedes quieren obtener la protena de inters que est en rojo, agregan un ligando, pero e tambin est
agregado a la partcula de resina que tienen ah, que est rellenando la columna. Por ejemplo: imagnense
que es la enzima acetilcolinesterasa, til en la sinapsis neuromotora, en la placa neuromotora cierto? Y yo
quiero aislarla, entonces agarro el ssutrato y lo pego covalentemente a la resina (se compra, alguien ya lo
hizo y lo vende). Entonces, por lo tanto, est la resina con el sustrato, la enzima se va a pegar al sustrato y
por lo tanto agrego la muestra que tiene de todo, porque hice pur el tejido neuronal y va todo ah, pero la
acetilcolinesterasa se va a pegar sobre la acetilcolina que est unida a la resina. Cmo la despego
inteligentemente? Agregas sustrato: agrego sustrato suelto para que compita, con el sustrato unido a la
resina, por la enzima. Entonces, si agrego acetilcolina, la acetilcolinesterasa se a distraer unindose a ese
sustrato y va a fluir con este sustrato y ya no va a estar pegada a la resina. Si quiero una protena rara, que
no es enzima y necesito de alguna manera tenerla ms pura y la tengo medianamente pura: la tomo, la
inyecto a un conejo, espero que el conejo genere anticuerpos, aslo los anticuerpos del conejo, pego los
anticuerpos del conejo a la resina, agrego la protena medianamente pura sobre la columna y se me pega
mucho ms que las dems
protenas
que
son contaminantes y tengo la
protena ya no
medianamente pura, sino que
muy pura. Esa
es una tesis de doctorado por lo
menos, pero as
de simple el protocolo, requiere
de
mucho
trabajo, pero se hace.
La

otra

tcnica

que

es

importante, es la
tcnica
de
electroforesis,
que no utiliza el
tamao de la
protena no,
no he dicho
nada. Utiliza la
carga de la
molcula a separar y muchas veces la carga en
relacin con el tamao, porque hay una relacin
carga-tamao. La electroforesis se puede realizar en
gel de agarosa, generalmente se utiliza para separar
DNA; la electroforesis en gel de poliacrilamida, se
utiliza para separar protenas; electroforesis en poliacrilamida, pero con un agente que se llama SDS, ese
agente lo que hace es denaturar la protena. Y hay una electroforesis muy elegante que se llama
desfocalizacin isoelctrica, que es la que vamos a ver al final. Cules son las propiedades que tiene el
soluto para cada una de ellas? Las vamos a ir viendo a medida que veamos las tcnicas una a una: una es
carga elctrica, carga elctrica, tamao y carga, la ltima. Y cules son las fases slidas: tres soportes
inertes, en el caso de las tres primeras tiene una cierta porosidad y el solvente siempre es un amortiguador,
un buffer, con agua.
La electroforesis, que la van a hacer en el laboratorio: ustedes agregan en el gel, en unos bolsillitos que
forman, unos moldes especiales, la
muestra con la
micropipeta y pueden ver como migra
cuando
someten a un campo elctrico esa
muestra. Ac
tenemos el polo positivo que se llama
nodo, y ac
el polo negativo que se llama ctodo,
porque
uno
atrae aniones y el otro cationes, no se
confundan con
el
nombre.
La
movilidad
electrofortica
de una molcula es la razn que hay
entre
la
velocidad que sta logra en el gel y la
diferencia de
potencial que hubo que aplicar, esa es
la movilidad
electrofortica. Y se puede demostrar
tericamente
que es la carga partido por un
coeficiente
propio de la molcula: coeficiente de
roce.

Ah tienen un ejemplo de un gel que ya fue revelado y sostiene las marcas de proteinas que ustedes pueden
teir con [] que puede marcar aminocidos y no al gel. Ustedes ven, en una primera etapa de
purificacin ustedes obtienen todas estas muestras, en una segunda todas estas, estas, estas, estas y las de
ac. Y ac, si se dan cuenta, cuando est protena pura, en este caso, una RNApolimerasa qu hace la
RNApolimerasa? Sintetiza RNA a partir de DNA. Entonces aqu al final obtenemos una banda, otra
banda: dos bandas y es que esta RNApolimerasa tiene subunidades: una, otra y las dos asociadas.
[pregunta de la Aguayo]
A ver, djame ver si te respondo la pregunta con lo
que voy a decir: cuando uno pone una muestra
arriba y las partculas tienen carga positiva, los que
tengan mayor movilidad electrofortica en relacin
a los positivos, o sea, en relacin a los negativos,
van a llegar ms lejos, porque abajo est el
positivos y arriba est el negativo; pero si yo,
adems, quiero separar slo por tamao, entonces
voy a pintar de cargas negativas a todas las
protenas, para separar slo por tamao. Y la manera
de pintarlas con carga neta negativa es agregar un
compuesto que es el SDS, y ese compuesto, significa,
de la abreviacin al castellano: dodecil sulfato de
sodio, y este que est ac para los amigos: SDS.
Fjense que tiene una carga, una cabeza cargada y una
cola hidrofbica porque aqu tenemos once carbonos.
Esta cola
hidrofbica se
va
a
insertar en la
porcin hidrofbica de las protenas y todas las protenas
tienen
aminocidos hidrofbicos en alguna parte, la mayora, esto es
en
general.
Entonces se va a incrustar en la porcin hidrofbica, y si la
porcin
hidrofbica va hacia adentro, lo que es natural, va a dar
vuelta
la
protena, como quien mete la mano a un calcetn y lo tira para
afuera: va a
desnaturalizar la protena. Estas protenas estn todas
desnaturalizadas, y la carga negativa queda mirando hacia el
solvente,
es
decir, van a estar todas estar cargas negativas de sulfato
mirando hacia el
solvente. Y caben tantas molculas de SDS en la protena por
igual que en
distintas protenas por centmetro cuadrado. Todas van a
tener la misma
relacin carga-tamao, as que ya no separa ms por
movilidad
electrofortica en el sentido de carga-tamao, sino que separa
solamente por
tamao, porque todas tienen el barniz de SDS que les
confiere
la
misma carga: algunas ms negativas porque eran ms
grandes y otras
menos negativas porque son molculas ms chicas, admiten menos molculas de SDS. Entonces cuando
tienen SDS las molculas, la carga ya no es motivo para la separacin porque todas tienen el mismo
atributo: muchas cargas negativas, lo que permite que se separen es el tamao y el gel de poliacrilamida es
entrecruzado, es as, as que cules van a llegar ms lejos, las chicas o las grandes? Las chicas; y en la
cromatografa de exclusin cules llegaban ms lejos? Las grandes. No hay contradiccin porque aqu no
hay partculas hidratadas ni con intersticios entre partculas hidratadas, aqu tenemos una trama de gel que
es el gel de poliacrilamida que es un entrecruzado covalente y las ms chicas pasan, las ms grandes se
quedan, por lo tanto, las ms chicas son las de ac, al final, las ms grandes son las que estn ac arriba
te contesto con eso la duda? Las ms chicas son las que llegan ms abajo, migran ms rpido.
Qu podemos decir? Bendita tcnica, porque permite separar de una manera con mucha resolucin
protenas que normalmente no eran separadas por otra tcnica, la cromatografa en gel de poliacrilamida.
Puedo separar DNA a travs de esta tcnica? no se usa, porque el SDS no se va a pegar al DNA, por gel
de agarosa separo DNA, como les deca en la tabla.
Qu sucede, ahora, en el ejemplo que tenemos ah?
Ya, seguimos la prxima clase.

Vamos a ver un detalle: cmo depende el tamao de la


protena, cmo depende la migracin respecto del tamao
de la protena y nos queda esta diapositiva y quizs
este grfico o lo vemos ahora.
Vemoslo al tiro, si no queda nada.
Ah ustedes tienen un gel de cromatografa de
electroforesis con poliacrilamida que es con SDS, y lo
que ven ustedes es que la miosina, que es la protena del
msculo, se queda arriba porque es muy grande, tiene
200.000 daltons cuntos aminocidos tiene? Dos mil.
Entonces lo que podemos ver, es que llegan primero estas
y las otras se van quedando atrasadas. Entonces, lo que
podramos hacer es graficar la migracin de estas molculas respecto del logaritmo del peso molecular, y
por qu el logaritmo: porque vara tanto, como ya lo vieron, que es mejor trabajar con el exponente.
Grafican ustedes esto y da una lnea recta, lo que permitira, si yo tengo una molcula desconocida y s la
migracin, yo grafico la migracin, intercepto, interpolo y obtengo el peso molecular de la protena.
Entonces uno podra interpolar en este caso.
La migracin relativa es porque uno divide la migracin de la ms grande, la usa para dividir las
migraciones de las otras, para obtener una relacin entre 0 y 1, por eso, la que migra ms lejos es sta.
Estas las compro y trabajo con la desconocida.
Entonces, hay otra tcnica, que es la que utiliza el punto
isoelctrico de las protenas y ustedes ven que hay
protenas que tienen cada un punto isoelctrico diferente. Si
yo agrego esas protenas en un gel y realizo una
electroforesis a un pH determinado, agrego la protena,
establezco el campo elctrico: voy a obtenerlas separas,
como aparece ah. Pero lo que deberamos pensar ac es
que la muestra est a un pH determinado, pero la verdad es
que el gel tiene un gradiente de pH, o sea que deberamos
pensar que aqu est de un mayor pH a un menor pH.
Dnde van a detenerse las protenas? Cuando la carga neta
sea cero: cuando la carga neta es cero, hasta ah no ms
lleg la migracin. As que la banda de all es con carga
neta cero.
Entre pH 9 y 3 t no vas a tener desnaturalizacin de las protenas, pero para el caso, t haces el estudio
previo.
Despus t tomas el gel que tiene todas
las protenas en
banda, lo das vuelta y haces una
electroforesis
convencional y ties, y esta
electroforesis es
con SDS y separas por tamao qu
obtuve? Fjense
que toda esta banda se me resuelve en
todas
estas
manchas, esta banda se separ en todas
estas manchas,
separ por tamao, es decir, haba
muchas
protenas con el mismo punto
isoelctrico
y
que estaban saliendo juntas, pero como
ahora hago una
electroforesis con SDS, separo por
tamao y por lo
tanto, separo las de menor tamao con
las de mayor
tamao y me queda arriba y lo que
obtengo es esto.
Y
esto,
hay
programas
computacionales
que lo interpretan y que les pueden decir la anomala en una o dos manchitas y detectan una patologa en
el laboratorio clnico. Esto es protemica, ahora uno puede hacer la protemica tambin identificando
algunos RNAm con unos chips especiales y ves cunto RNAm estay sintetizando. Pero uno puede hacer
esto y lo que ests determinando es la protemica: es decir, qu protenas se estn expresando en ese tejido

y saber si hay alguna que est ausente o alguna presente que no debera estar. La genmica, les dije que
era la Edad de Piedra, en eso estamos, en la genmica.
En todo proceso de purificacin interesa el grado de purificacin y rendimiento, y cmo los estimamos:
esta es la muestra inicial, esta es la muestra definitiva, nos interesan las bolitas rojas dnde hay ms
bolitas rojas? Ac dnde estn ms puras las bolitas rojas? All. Aqu habra un caso donde sacrificamos
rendimiento por purificacin. Por lo tanto, lo que nosotros queremos es que la protena est rodeada de
protenas iguales y saquemos las impurezas, eso significa deshacernos, en el transcurso de la purificacin,
de la protena, y eso es lo que no queremos, pero a veces es inevitable. As que all tenemos purificacin
lograda, pero con un rendimiento que se ha sacrificado en cuanto a la protena, pero para estudiarla es
fabuloso, lo ideal es tenerla pura, y la etapa ms eficiente de la purificacin es la de focalizacin
isoelctrica, que ustedes vieron denante, combinada con la electroforesis de SDS, y a ambas juntas se le
llama electroforesis bidimensional. As que ustedes tienen tablas como estas, donde aparece la etapa de
purificacin, cunto volumen mantiene, cunta protena total mantiene, cunta actividad mantiene y cul
es la actividad especfica, y eso se los voy a explicar.
En el caso de la alcayota, por ejemplo: tenamos diez mil
miligramos, cunta actividad: cien mil unidades; despus, precipito
en el sulfato de amonio, tengo 3000 miligramos, cunta actividad: 96
mil unidades de
actividad,
qu
obtengo: actividad
especfica de 32.
Qu
es
la
actividad
especfica:
unidades dividido por miligramos. Mientras ms
actividad tenga, la que sea, significa que est ms puro
ah, as que nosotros vamos a obtener, en las etapas
sucesivas,
despus
del
intercambio
inico,
cromatografa, etctera, obtenemos mayor actividad
especfica, o sea que est ms pura, y el rendimiento
cul sera si tenemos 45.000 unidades y tenamos
100.000 cul sera el rendimiento? Un 45%, porque de 100, obtuve 45 unidades de actividad la que
sea, invntese. Pero cul es la purificacin si tena 10 por gramo y ahora tengo 15 por gramo, 15.000 por
gramo dividan: 1.500 veces ms pura. En cambio al pasar del extracto puro a la precipitacin por
sulfato cuntas veces se purific? 3,2 veces simplemente. As que una cosa es cuntas veces se purific y
otra es el rendimiento, y eso es importante que ustedes lo puedan entender.

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