0 valutazioniIl 0% ha trovato utile questo documento (0 voti)
20 visualizzazioni4 pagine
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS
La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una
partícula cargada cuando se ve sometida a la acción de un campo
eléctrico. La partícula se desplazará hacia el electrodo de carga opuesta.
Así pues, una partícula cargada positivamente (catión) se desplazará hacia
el cátodo (polo con carga negativa). Una partícula cargada
negativamente (anión) se desplazará hacia el ánodo (polo con carga
positiva). Como conclusión general, en una solución acuosa, las partículas se
moverán más deprisa cuanto mayor sea su carga, y más despacio cuanto
mayor sea su tamaño. En la separación de macromoléculas, como las
proteínas, la carga qp es muy baja en relación a su masa. Para conseguir la
migracion habría que aumentar mucho el campo eléctrico y se produciría la
hidrólisis del agua. Se generarían altas concentraciones de OH- en el ánodo
y H+ en el cátodo, lo que provocaría un gradiente de pH que afectaría a la
carga de la partícula. También habría cambios en la viscosidad del medio
debidos a la generación de calor por una diferencia de potencial muy
elevada.
Estos problemas pueden ser solucionados realizando la electroforesis en
un gran volumen de medio tamponado. Aún así la relación carga/masa
sigue siendo muy baja y la macromolécula migra muy lentamente con lo
que el problema de difusión se hace muy importante. Para aumentar la
velocidad de la macromolécula se aumenta la fuerza iónica del medio y
para evitar la difusión se realiza la electroforesis en soportes sólidos inertes
denominados de geles porosos.
La electroforesis es la técnica más utilizada en estudios analíticos, sobre
todo de componentes moleculares, utilizándose frecuentemente en el
laboratorio para la separación de proteínas y de ácidos nucleicos. La
separación de proteínas se realiza habitualmente mediante gel de
poliacrilamida en presencia de SDS. El gel se organiza en una red o malla a
través de cuyos poros circulan las proteínas a separar. Se obtiene mediante
la formación de polímeros lineales de acrilamida que se entrecruzan por
reacción con bis-acrilamida. El tamaño de los poros depende de la
concentración absoluta y de la proporción de acrilamida y bis-acrilamida
del gel. La polimerización es promovida por el persulfato amónico y
estabilizada por el TEMED.
Figura 1: Electroforesis en gel de acrilamida. Polo superior: Cátodo (carga negativa). Polo
inferior: Ánodo (carga positiva).
Los pesos moleculares de las proteínas se pueden determinar midiendo
su movilidad en geles de poliacrilamida en presencia de un agente
desnaturalizante, el detergente dodecilsulfato sódico (SDS). Esto es debido a
que la cantidad de SDS (cargado negativamente) que se une a una
proteína es proporcional al peso molecular del polipéptido y es
independiente de su secuencia. A saturación, se une aproximadamente 1.4 g de detergente por gramo de proteína. Existe una relación lineal entre la distancia que una proteína recorre en un gel y el logaritmo de su peso
molecular. Así pues, si tenemos una serie de proteínas de las que conocemos su peso molecular podemos utilizarlas como patrón y midiendo la distancia que recorren en el gel, podemos construir una recta que nos permita calcular el peso molecular de nuestras proteínas problema interpolando la distancia que han recorrido.
MATERIALES Y REACTIVOS.
1.- Stock de acrilamida-bisacrilamida 30%-0.8%
La ACRILAMIDA es un compuesto altamente NEUROTOXICO. Está
terminantemente prohibido continuar la práctica sin GUANTES , o
pipetear la disolución con la boca.
2.- Tris-HCl 0.5 M pH 6.8
3.- Tris-HCl 3 M pH 8.8
4.- SDS 10%
5.- Persulfato amónico 10%
6.- Tampón de electroforesis (Tris 25 mM pH 8.3, glicina 192 mM, SDS 0.1%)
7.- Tampón de ruptura (Tris 313 mM pH 6.8, SDS 10%, glicerol 25%,
mercaptoetanol 25%, azul de bromofenol 0.02%)
8.- Cristales, separadores, peines, pinzas-marco para sujeción de cristales y
accesorio formador de geles. Cubeta para elect
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS
La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una
partícula cargada cuando se ve sometida a la acción de un campo
eléctrico. La partícula se desplazará hacia el electrodo de carga opuesta.
Así pues, una partícula cargada positivamente (catión) se desplazará hacia
el cátodo (polo con carga negativa). Una partícula cargada
negativamente (anión) se desplazará hacia el ánodo (polo con carga
positiva). Como conclusión general, en una solución acuosa, las partículas se
moverán más deprisa cuanto mayor sea su carga, y más despacio cuanto
mayor sea su tamaño. En la separación de macromoléculas, como las
proteínas, la carga qp es muy baja en relación a su masa. Para conseguir la
migracion habría que aumentar mucho el campo eléctrico y se produciría la
hidrólisis del agua. Se generarían altas concentraciones de OH- en el ánodo
y H+ en el cátodo, lo que provocaría un gradiente de pH que afectaría a la
carga de la partícula. También habría cambios en la viscosidad del medio
debidos a la generación de calor por una diferencia de potencial muy
elevada.
Estos problemas pueden ser solucionados realizando la electroforesis en
un gran volumen de medio tamponado. Aún así la relación carga/masa
sigue siendo muy baja y la macromolécula migra muy lentamente con lo
que el problema de difusión se hace muy importante. Para aumentar la
velocidad de la macromolécula se aumenta la fuerza iónica del medio y
para evitar la difusión se realiza la electroforesis en soportes sólidos inertes
denominados de geles porosos.
La electroforesis es la técnica más utilizada en estudios analíticos, sobre
todo de componentes moleculares, utilizándose frecuentemente en el
laboratorio para la separación de proteínas y de ácidos nucleicos. La
separación de proteínas se realiza habitualmente mediante gel de
poliacrilamida en presencia de SDS. El gel se organiza en una red o malla a
través de cuyos poros circulan las proteínas a separar. Se obtiene mediante
la formación de polímeros lineales de acrilamida que se entrecruzan por
reacción con bis-acrilamida. El tamaño de los poros depende de la
concentración absoluta y de la proporción de acrilamida y bis-acrilamida
del gel. La polimerización es promovida por el persulfato amónico y
estabilizada por el TEMED.
Figura 1: Electroforesis en gel de acrilamida. Polo superior: Cátodo (carga negativa). Polo
inferior: Ánodo (carga positiva).
Los pesos moleculares de las proteínas se pueden determinar midiendo
su movilidad en geles de poliacrilamida en presencia de un agente
desnaturalizante, el detergente dodecilsulfato sódico (SDS). Esto es debido a
que la cantidad de SDS (cargado negativamente) que se une a una
proteína es proporcional al peso molecular del polipéptido y es
independiente de su secuencia. A saturación, se une aproximadamente 1.4 g de detergente por gramo de proteína. Existe una relación lineal entre la distancia que una proteína recorre en un gel y el logaritmo de su peso
molecular. Así pues, si tenemos una serie de proteínas de las que conocemos su peso molecular podemos utilizarlas como patrón y midiendo la distancia que recorren en el gel, podemos construir una recta que nos permita calcular el peso molecular de nuestras proteínas problema interpolando la distancia que han recorrido.
MATERIALES Y REACTIVOS.
1.- Stock de acrilamida-bisacrilamida 30%-0.8%
La ACRILAMIDA es un compuesto altamente NEUROTOXICO. Está
terminantemente prohibido continuar la práctica sin GUANTES , o
pipetear la disolución con la boca.
2.- Tris-HCl 0.5 M pH 6.8
3.- Tris-HCl 3 M pH 8.8
4.- SDS 10%
5.- Persulfato amónico 10%
6.- Tampón de electroforesis (Tris 25 mM pH 8.3, glicina 192 mM, SDS 0.1%)
7.- Tampón de ruptura (Tris 313 mM pH 6.8, SDS 10%, glicerol 25%,
mercaptoetanol 25%, azul de bromofenol 0.02%)
8.- Cristales, separadores, peines, pinzas-marco para sujeción de cristales y
accesorio formador de geles. Cubeta para elect
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS
La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una
partícula cargada cuando se ve sometida a la acción de un campo
eléctrico. La partícula se desplazará hacia el electrodo de carga opuesta.
Así pues, una partícula cargada positivamente (catión) se desplazará hacia
el cátodo (polo con carga negativa). Una partícula cargada
negativamente (anión) se desplazará hacia el ánodo (polo con carga
positiva). Como conclusión general, en una solución acuosa, las partículas se
moverán más deprisa cuanto mayor sea su carga, y más despacio cuanto
mayor sea su tamaño. En la separación de macromoléculas, como las
proteínas, la carga qp es muy baja en relación a su masa. Para conseguir la
migracion habría que aumentar mucho el campo eléctrico y se produciría la
hidrólisis del agua. Se generarían altas concentraciones de OH- en el ánodo
y H+ en el cátodo, lo que provocaría un gradiente de pH que afectaría a la
carga de la partícula. También habría cambios en la viscosidad del medio
debidos a la generación de calor por una diferencia de potencial muy
elevada.
Estos problemas pueden ser solucionados realizando la electroforesis en
un gran volumen de medio tamponado. Aún así la relación carga/masa
sigue siendo muy baja y la macromolécula migra muy lentamente con lo
que el problema de difusión se hace muy importante. Para aumentar la
velocidad de la macromolécula se aumenta la fuerza iónica del medio y
para evitar la difusión se realiza la electroforesis en soportes sólidos inertes
denominados de geles porosos.
La electroforesis es la técnica más utilizada en estudios analíticos, sobre
todo de componentes moleculares, utilizándose frecuentemente en el
laboratorio para la separación de proteínas y de ácidos nucleicos. La
separación de proteínas se realiza habitualmente mediante gel de
poliacrilamida en presencia de SDS. El gel se organiza en una red o malla a
través de cuyos poros circulan las proteínas a separar. Se obtiene mediante
la formación de polímeros lineales de acrilamida que se entrecruzan por
reacción con bis-acrilamida. El tamaño de los poros depende de la
concentración absoluta y de la proporción de acrilamida y bis-acrilamida
del gel. La polimerización es promovida por el persulfato amónico y
estabilizada por el TEMED.
Figura 1: Electroforesis en gel de acrilamida. Polo superior: Cátodo (carga negativa). Polo
inferior: Ánodo (carga positiva).
Los pesos moleculares de las proteínas se pueden determinar midiendo
su movilidad en geles de poliacrilamida en presencia de un agente
desnaturalizante, el detergente dodecilsulfato sódico (SDS). Esto es debido a
que la cantidad de SDS (cargado negativamente) que se une a una
proteína es proporcional al peso molecular del polipéptido y es
independiente de su secuencia. A saturación, se une aproximadamente 1.4 g de detergente por gramo de proteína. Existe una relación lineal entre la distancia que una proteína recorre en un gel y el logaritmo de su peso
molecular. Así pues, si tenemos una serie de proteínas de las que conocemos su peso molecular podemos utilizarlas como patrón y midiendo la distancia que recorren en el gel, podemos construir una recta que nos permita calcular el peso molecular de nuestras proteínas problema interpolando la distancia que han recorrido.
MATERIALES Y REACTIVOS.
1.- Stock de acrilamida-bisacrilamida 30%-0.8%
La ACRILAMIDA es un compuesto altamente NEUROTOXICO. Está
terminantemente prohibido continuar la práctica sin GUANTES , o
pipetear la disolución con la boca.
2.- Tris-HCl 0.5 M pH 6.8
3.- Tris-HCl 3 M pH 8.8
4.- SDS 10%
5.- Persulfato amónico 10%
6.- Tampón de electroforesis (Tris 25 mM pH 8.3, glicina 192 mM, SDS 0.1%)
7.- Tampón de ruptura (Tris 313 mM pH 6.8, SDS 10%, glicerol 25%,
mercaptoetanol 25%, azul de bromofenol 0.02%)
8.- Cristales, separadores, peines, pinzas-marco para sujeción de cristales y
accesorio formador de geles. Cubeta para elect
La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una
partcula cargada cuando se ve sometida a la accin de un campo elctrico. La partcula se desplazar hacia el electrodo de carga opuesta. As pues, una partcula cargada positivamente (catin) se desplazar hacia el ctodo (polo con carga negativa). Una partcula cargada negativamente (anin) se desplazar hacia el nodo (polo con carga positiva). Como conclusin general, en una solucin acuosa, las partculas se movern ms deprisa cuanto mayor sea su carga, y ms despacio cuanto mayor sea su tamao. En la separacin de macromolculas, como las protenas, la carga qp es muy baja en relacin a su masa. Para conseguir la migracion habra que aumentar mucho el campo elctrico y se producira la hidrlisis del agua. Se generaran altas concentraciones de OH- en el nodo y H+ en el ctodo, lo que provocara un gradiente de pH que afectara a la carga de la partcula. Tambin habra cambios en la viscosidad del medio debidos a la generacin de calor por una diferencia de potencial muy elevada. Estos problemas pueden ser solucionados realizando la electroforesis en un gran volumen de medio tamponado. An as la relacin carga/masa sigue siendo muy baja y la macromolcula migra muy lentamente con lo que el problema de difusin se hace muy importante. Para aumentar la velocidad de la macromolcula se aumenta la fuerza inica del medio y para evitar la difusin se realiza la electroforesis en soportes slidos inertes denominados de geles porosos. La electroforesis es la tcnica ms utilizada en estudios analticos, sobre todo de componentes moleculares, utilizndose frecuentemente en el laboratorio para la separacin de protenas y de cidos nucleicos. La separacin de protenas se realiza habitualmente mediante gel de poliacrilamida en presencia de SDS. El gel se organiza en una red o malla a travs de cuyos poros circulan las protenas a separar. Se obtiene mediante la formacin de polmeros lineales de acrilamida que se entrecruzan por reaccin con bis-acrilamida. El tamao de los poros depende de la concentracin absoluta y de la proporcin de acrilamida y bis-acrilamida del gel. La polimerizacin es promovida por el persulfato amnico y estabilizada por el TEMED.
Figura 1: Electroforesis en gel de acrilamida. Polo superior: Ctodo (carga negativa).
Polo inferior: nodo (carga positiva).
Los pesos moleculares de las protenas se pueden determinar midiendo
su movilidad en geles de poliacrilamida en presencia de un agente desnaturalizante, el detergente dodecilsulfato sdico (SDS). Esto es debido a que la cantidad de SDS (cargado negativamente) que se une a una protena es proporcional al peso molecular del polipptido y es independiente de su secuencia. A saturacin, se une aproximadamente 1.4 g de detergente por gramo de protena. Existe una relacin lineal entre la distancia que una protena recorre en un gel y el logaritmo de su peso molecular. As pues, si tenemos una serie de protenas de las que conocemos su peso molecular podemos utilizarlas como patrn y midiendo la distancia que recorren en el gel, podemos construir una recta que nos permita calcular el peso molecular de nuestras protenas problema interpolando la distancia que han recorrido.
MATERIALES Y REACTIVOS.
1.- Stock de acrilamida-bisacrilamida 30%-0.8%
La ACRILAMIDA es un compuesto altamente NEUROTOXICO. Est terminantemente prohibido continuar la prctica sin GUANTES , o pipetear la disolucin con la boca. 2.- Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 3.- Tris-HCl 3 M pH 8.8 4.- SDS 10% 5.- Persulfato amnico 10% 6.- Tampn de electroforesis (Tris 25 mM pH 8.3, glicina 192 mM, SDS 0.1%) 7.- Tampn de ruptura (Tris 313 mM pH 6.8, SDS 10%, glicerol 25%, mercaptoetanol 25%, azul de bromofenol 0.02%) 8.- Cristales, separadores, peines, pinzas-marco para sujecin de cristales y accesorio formador de geles. Cubeta para electroforesis con soporte para geles y formador de cmaras. Fuente de alimentacin. 9.- Marcadores de peso molecular de protenas 10.- Solucin de tincin o solucin de Coomassie (Coomassie brilliant blue R 0.05 %, actico 10% e isopropanol 25%) 10.- Solucin de revelado (cido actico 10%
MTODO
Preparacin del gel
En esta prctica se va a preparar un gel discontnuo compuesto por el gel de separacin o resolucin (parte inferior) y el gel de concentracin o empaquetamiento (parte superior, con pocillos). Las cantidades de cada gel se muestran en la tabla adjunta. Limpiar perfectamente los cristales (uno grande y otro pequeo) con agua y jabn, aclararlos muy bien con abundante agua. Utilizar un poco de etanol 70% y secar los cristales con papel secamanos. Montar el gel siguiendo meticulosamente las instrucciones del profesor. Preparar la solucin del gel de separacin (7.5 ml por gel) teniendo en cuenta que el persulfato amnico y el TEMED se aaden al final. Verterlo rpida y cuidadosamente entre los cristales hasta 1-2 cm por debajo del nivel que ser ocupado por el peine formador de los pocillos. Colocar un poco de agua destilada cuidadosamente sobre el gel y dejarlo polimerizar a temperatura ambiente. Una vez polimerizado, retirar el agua y preparar la solucin del gel concentrador. Verter esta solucin sobre el gel de separacin hasta llenar el espacio entre cristales y colocar un peine de 14 pocillos previamente lavado con agua y etanol, evitando que queden burbujas entre el peine y el gel. Dejarlo polimerizar a temperatura ambiente. Gel de separacin gel de concentracion Agua Acrilamidabisacrilam Tris HCl 3 M pH 8.8 Tris HCl 0.5 M pH 6.8 SDS Persulfato amnico TEMED
3.9 ml 2.5 ml 0.95 ml -------75 l 30 l 10 l
Preparacin de la muestra
1.75 ml 0.31 ml -------0.625 ml 27.5 l 15 l 5 l
En esta prctica se van a analizar mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida con SDS las muestras provenientes de la precipitacin fraccionada. Se incluir tambin un carril con marcadores de peso molecular, que consisten en una mezcla de protenas de peso molecular conocido que nos servirn de referencia. Las muestras a analizar son las siguientes: 1.2.3.4.5.-
Suero de Ternera diludo 1/5.
Fraccin 1 (precipitado obtenido con 30 % de sulfato amnico). Fraccin 2 (precipitado obtenido con 40% de sulfato amnico). Fraccin 3 (precipitado obtenido con 60% de sulfato amnico). Muestra tras dilisis.
Rotular 5 microtubos, uno para cada muestra. Mezclar en cada uno de
ellos 20 l de su muestra correspondiente con 20 l de tampn la emli. Desarrollo de la electroforesis Una vez polimerizado el gel de concentracin, retirar el peine con cuidado de no romper los pocillos reservados a las muestras. Montar el gel en la cubeta de electroforesis siguiendo las instrucciones del profesor. Aadir tampn de electroforesis y cargar las muestras anotando el orden. Las cantidades cargadas de cada muestra se deducirn durante el desarrollo de la prctica en funcin de la cantidad de protenas determinada anteriormente en el ensayo tipo Bradford. Una vez cargadas las muestras, se conectan los cables correctamente (polo positivo rojo abajo y negativo negro arriba) y se corre la electroforesis al amperaje que indique el profesor hasta que el frente azul est a punto de salir de la parte inferior. Cuando el frente est a punto de salir, se desconecta la corriente, se separan con mucho cuidado los dos cristales, se retira el gel y se coloca en un recipiente donde se aade la solucin de fijacin (dependiendo del desarrollo de la prctica consultar con el profesor los tiempos de fijacin), se retira la solucin de tincin y se aade la solucin de revelado, donde se deja hasta que el gel est completamente desteido.
DMT: La molécula del espíritu (DMT: The Spirit Molecule): Las revolucionarias investigaciones de un medico sobre la biologia de las experiencias misticas y cercanas a la muerte
Cómo Conversar Con Cualquier Persona: Mejora tus habilidades sociales, desarrolla tu carisma, domina las conversaciones triviales y conviértete en una persona sociable para hacer verdaderos amigos y construir relaciones significativas.