Ralstonia

CULTIVO POR LOTE DE Rasltonia eutropha NRRLB-14690 EN
MEDIO QUMICAMENTE DEFINIDO CON LIMITACIN DE

NITRGENO
INTRODUCCIN:
Ralstonia eutropha es una bacteria gram negativa, de un tamao de 0.7 x 1.82.6 um de la clase Betaproteobacteria comn en los suelos.
R. eutropha es una bacteria oxidante del hidrgeno capaz de crecer en la
interface entre ambientes aerbicos y anaerbicos. Puede crecer a 41C.
Puede adaptarse con facilidad entre un estilo de vida heterotrfico o autotrfico.
Pudiendo utilizar tanto compuestos orgnicos como inorgnicos como fuente
de energa. Posee resistencia al Nikel.
R. eutropha puede efectuar una respiracin celular aerbica o anaerbica por
medio de una desnitrificacin es decir la reduccin de nitritos o nitratos a gas
nitrgeno. Cuando crece bajo condiciones auttrofas R. eutropha es capaz de
fijar carbono por medio de la va de las pentosas fosfato. R. eutropha es
conocida por producir y capturar plsticos de tipo Polihidroxialcanoato (PHA)
cuando crece expuesta a un exceso de azcares como sustrato. El PHA puede
acumularse hasta niveles de aproximadamente el 90% del peso de la clula en
seco.
La bacteria Ralstonia eutropha ATCC 17699 es la ms estudiada para la
produccin de PHAs, debido a su excelente capacidad para acumular una gran
cantidad de polmero como el cido Polihidroxibutirato (PHB) a partir de fuentes
de carbono simples como fructosa, glucosa, cido actico y fuentes de carbono
no convencionales como almidones, melazas y suero de leche.
El PHA representa una fuente de almacenamiento de energa y carbono, este
compuesto ha atrado gran inters por lo que se han desarrollado diversas
aplicaciones tcnicas e investigaciones sobre su utilidad.
Una cepa genticamente modificada tiene mejorada la habilidad para
inmovilizar iones
externos de Cd2+ y reducir los efectos nocivos de los
metales pesados en el crecimiento de las plantas de tabaco.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

El genoma de R. eutrofa H16 es compuesto en dos cromosomas circulares de
tamao 4.1 a 2.9 Mb. La bacteria es aislada de suelo y gas hidrogeno.
En el presente trabajo se realiza una cintica microbiana de este
microorganismo con el propsito de observar la formacin de estos grnulos de
PHA y determinar si una limitacin de fuente de carbono en el medio es capaz
de inducir la formacin de los grnulos, obteniendo a la vez datos de
rendimiento y consumo del sustrato, al igual que el consumo de nitrgeno
E.A.P. Biotecnologa
MARCO TERICO:
Definicin, estructura y propiedades de los polihidroxialcanoatos
Los PHA son polmeros de cidos hidroxialcanoicos que algunas bacterias,
arqueas y microalgas acumulan intracelularmente como material de reserva,
para usarlo posteriormente como fuente de carbono y energa.
La poli-
merizacin
enzimas
de
los
cidos
hidroxialcanoicos,
por
accin
de
intracelulares, tiene lugar mediante condensacin del grupo carboxilo de un

monmero (cido hidroxialcanoico), con el grupo hidroxilo del siguiente,
formndose un enlace ster de all que tambin se les conozca como
biopolisteres. Se acumulan como polmeros lquidos, mviles y amorfos en
forma de grnulos que se alojan en el citoplasma microbiano rodeados de una
monocapa de fosfolpidos que contiene enzimas polimerasas y despolimerasas.
Las investigaciones sobre el proceso de acumulacin de PHA indican que el
nmero de grnulos por clula se define en las primeras etapas de
acumulacin y que la produccin del polmero cesa cuando su contenido
alcanza cerca del 80 % del peso celular en base seca. Este fenmeno ha
llevado a la conclusin de que existen restricciones fsicas que impiden a la
clula acumular ms polmero, a pesar de la disponibilidad de sustrato y
actividad de la enzima PHA polimerasa. Estas inclusiones se observan bajo el
microscopio como grnulos esfricos de diferentes tamaos
E.A.P. Biotecnologa

Los PHA tienen caractersticas fsicas similares a las de los plsticos derivados
del petrleo, como el polipropileno y polietileno, pero tienen la ventaja de que
pueden ser sintetizados a partir de fuentes de carbono renovables, son
biodegradables (pueden ser asimilados por muchos microorganismos ya sea
de suelos, mares, lagos o aguas residuales) y son biocompatibles (no causan
efectos txicos). Estas propiedades les confieren una gran importancia como
substitutos de los plsticos convencionales.
METODOLOGA:
ELABORACIN Y DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO:
Se realizaran tres medios:
Medio de Mantencin (PGY-Agar) para la cepa Ralstonia Eutropha

NRRL B-14690
Composicin
Peptona
Extracto de
Levadura
K2HPO4
Glucosa
Agar-Agar
g/L
7.0
g/15ml
0.105
3.5
0.0525
1.0
1.4
20
0.015
0.021
0.3
Ajustar pH 7.0 con 0.2 M de HCl.
E.A.P. Biotecnologa

Antes de esterilizar, hacer hervir por 2 min la solucin para homogenizar
el agar-agar.
Esterilizar a 121 C por 15 min.
Pesar
Cada nutriente como indica en la Tabla 01
Diluir
15 ml de agua destilada en matraz
Con mechero Bunsen hasta ebullir
Calentar
Hasta aparecer burbuja
Agitar
Colocar
En 5 tubos de ensayo con tapa (3ml en cada uno).
Reposar
1 hora
En autoclave a 121C 15 min desde la primera burbuja

Esterilizar
Reposar
Inclinar
E.A.P. Biotecnologa

Realizar el sembrado
Desinfectar
Colocar
Someter
El medio de trabajo con alcohol 96
Bajo mechero para un ambiente estril
El asa bacteriana al fuego a rojo vivo
El asa por las paredes del tubo que contiene la cepa

Enfriar
Extraer
Flamear
Una asada de la clula desarrollada
El tubo antes de cerrarlo
En 5 tubos de ensayo reparados con medio solido agar

Resembrar
Llevar
Arrastrar
Incubar
Por dentro del tubo del medio solido la azada
Por la superficie desde adentro hacia afuera
1 a 2 horas
E.A.P. Biotecnologa

Medio rico (PGY) para la cepa Ralstonia Eutropha NRRL B-14690
Composicin
Peptona
Extracto de Levadura
K2HPO4
Glucosa
g/L
1.0
1.0
1.0
1.4
g/50ml
0.05
0.05
0.05
0.07
Ajustar pH 7.0 con 0.2 M de HCl.

Esterilizar a 121 C por 15 min.
Considerando al Carbono como el nutriente limitante en el medio rico
lquido, se puede estimar la cantidad de biomasa formada para un
crecimiento aerbico:
Yx / s
40
* 0.6 0.48g / g
50
xf 0.48 * (1.4) 0.672g / L

Para 50 ml.:
xf =0.48( 0.07 )=0.0336
Si un volumen de 15 mL se traspasa aspticamente a 120 mL de

volumen
de
fermentacin
(105
mL de
medio),
entonces
la
concentracin del inculo es x0=0.084 g/L.
E.A.P. Biotecnologa
K2HPO4
Extracto de levadura
Peptona
Aforar
Aforar
15 ml
Agua destilada
10 ml
Agua destilada
Esterilizar
Todo
lo anterior en autoclave por 15 min
Medio de cultivo para alcanzar 1.5 g/L de biomasa final en el matraz

de 1000 mL (CULTIVO POR LOTE) desde x0= 0.084 g/L.
Realizar un diseo de medios para Saccharomyces cerevisiae con las
siguientes caractersticas, obtener conocimiento de:
Requerimiento del elemento celular
Biomasa requerida
Fuente de cada elemento
Rendimiento de cada fuente
E.A.P. Biotecnologa
Mantenimiento
Formacin de producto
Empleamos:
Ralstonia eutropha
Biomasa = 1.5gr/L
Aerbico
Nutriente limitante : Nitrgeno
Mantenimiento = 0
Producto = 0
Exceso = 50%
Elemento
C
N
Mg
S
K
P
Fe
Elemento
Nutriente
Nutriente
Glucosa
(NH4)2SO4
MgSO4.7H2O
(NH4)2SO4
KH2PO4
KH2PO4
FeSO4
Elemento
Elemento en
Nutriente %
40
%E.C
50 %
14%
0,5%
1%
1%
3%
0.2%
Yx/s
So
So
Glucosa
en clula %
50 %
40/50 * 0.6 = 0.48
1.5/0.48=3.13
3.13*1.5= 4.695
(NH4)2SO4
14%
21.21
21.21/14 * 1 = 1.52
1.5/1.52= 0.99
0.99*1 = 0.99
MgSO4.7H2O
0,5%
9.87
9.87/0.5* 1 =19.74
1.5/19.74= 0.08
0.08*1.5= 0.12
(NH4)2SO4
1%
24.24
24.24/1 * 1 = 24.24
1.5/24.24=0.06
0.06*1.5= 0.04
KH2PO4
1%
28.69
28.69/1 * 1 = 28.69
1.5/28.69= 0.05
0.05*1.5= 0.075
P
Fe
K2HPO4
FeSO4
3%
0.2%
17.77
36,76
17.77/3* 1 = 5.92
36.76/0.2 * 1 = 183.8
1.5/5.92= 0.25
1.5/183.8=0.008
0.25*1.5= 0.375
0.008*1.5 = 0.012
Mg
Composicin
K2HPO4
(NH4)2SO4
Glucosa
MgSO4.7H2O
(NH4)2SO4
KH2PO4
FeSO4
EDTA
Esterilizar a 121 C por 15min.
g/L
0.375
0.99
4.695
0.12
0.04
0.075
0.012
20
g/150ml
0.05625
0.1485
0.70425
0.018
0.006
sales
EDTA + K2HPO4Otras
+ (NH4)2SO4
0.01125
0.0018
3
Aforar
25 ml Agua destilada
Aforar
100m
E.A.P. Biotecnologa
Esterilizar
Todo
lo anterior en autoclave por 15 min
Elementos menores y trazas

- 1M MgSO4.7H2O
1mL/L medio
- 10 mM de FeSO4.7H2O en 1M HCl
1.5 mL/ L medio
- MT (minerales trazas)
1.5 mL/L medio
Ajustar a pH=7.0 (ajustado con NaOH 3M, HCL 3 M), si se desea se

puede diluir un poco la base y el cido para poder llegar al pH requerido.
Cuando se trabaje en el fermentador si se debe ajustar el pH a 7.0 0.1,
automticamente.
Solucin stock de los elementos Trazas minerales (MT)
Composicin
CaCl2.2H2O
g/L
1.47
E.A.P. Biotecnologa

- MnCl2.4H2O
- CoCl2.6H2O
- CuCl2.2H2O
- ZnSO4.7H2O
1.98
2.38
1.70
2.90
Se disuelve todas las sales en 1 L de 1M HCl y se esteriliza

Cuantificacin de azucares reductores con el mtodo DNS (3,5
dinitro saliclico):
Equipos y Materiales
Espectrofotmetro
10 Tubos de ensayo
Gradilla
Equipo de Bao Mara
Balanza
Agitador
Hielo en cubos
Biker
Fiola
Preparacin del reactivo 3,5 dinitro saliclico
cido 3,5-dinitrosaliclico
Tartrato sdico potsico
Hidrxido sdico
Procedimiento para preparar el reactivo

Disolver 10 g de cido 3,5-dinitrosalislico y 300 g de tartrato sdico
potsico en 200 ml de hidrxido sdico 2 M (16 g de NaOH en 200 ml
de agua destilada)
Diluir hasta 1000 ml con agua destilada.
El reactivo debe guardarse en bote oscuro (color topacio), siendo
estable durante varias semanas.
Procedimientos para la curva de calibracin
10
E.A.P. Biotecnologa
[
]
1
.
8
1
.
4
1
0
.
8
0
.
4
0
.
1
0
.
0
8
0
.
0
4
0
.
0
1
0
.
0
0
8
Soluci
n
madre
Ab
sa
540
nm
Agu
a
0.9
0.1
0.7
0.3
0.5
0.5
0.4
0.6
0.2
0.8
0.05
0,95
0.04
0.96
0.02
0.98
0.005
0.99
5
0.004
0.99
6
E.A.P. Biotecnologa
Cuadro:
Realizar la curva de abs vs [ ].

Luego sacar 1 ml de la muestra a analizar +1ml de DNS llevar al calor
a 100C por 5-10 minutos

Luego enfriar en un bao de hielo durante 3 minutos.
Agregar 10 ml de agua destilada, dejar reposar 5 minutos y leer al
espectrofotmetro a 540 nm.
Reactivo DNS
AADIR
1 ml
MEZCLAR
MUE(1ml)yDNS(1ml)
CALENTAR
En cada tubo de
ensayo.
En cada
tubo.
En bao mara
hasta ebullicin.
T: 5min
Agua en hielo
ENFRIAR
Agua destilada
Tiempo:
3min
AADIR
10ml
LEER
Absorbancia a
540 nm
Procedimiento para el anlisis de biomasa:
Elaboracin De Capachos:
CONFECCI
N
Con papel aluminio

capachos
E.A.P. Biotecnologa
DESECAR
Los capachos en la
estufa
T= 2 horas
DESECAR
En la campana de
gauss
T= 30 min
PESAR
En la balanza
analtica.
Densidad ptica:
1 Del volumen extrado se procede a leerlo por espectrometra a 640nm
(con un blanco de AGUA).
2 Centrifugar durante 15 min.
3 Desechar el sobrenadante y luego agregar agua destilada hasta
completar los 5ml.
4 Volver a centrifugar por 15 min.
5 Desechar nuevamente el sobrenadante y colocar lo restante en los
capachos.
6 Colocar los capachos en la estufa a 80C por 24 horas.
7 Finalmente pesar los capachos.
5ml
Cultivo
AGREGAR
En 10 tubos
CENTRIFUGAR
10 tubos a 15 min
BOTAR
El sobredanante
E.A.P. Biotecnologa
5 ml
Agua
AGREGAR
Al tubo
REPETIR
CENTRIFUGAR
2 veces
Los 10 tubos por 15 min
1 ml
AGREGAR
A cada tubo
Agua
AGITAR
Hasta disolver el pellet
REPETIR
2 veces
INCUBAR
80C /24 horas
Determinacin de la curva de concentracin celular en base seca

(mtodo turbidimtrico)
Realizar diluciones al 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10 (3ml)
De cada dilucin realizar lecturas de absorbancia (640 nm)
E.A.P. Biotecnologa
Graficar la biomasa en peso seco vs absorbancia y se determinar la

ecuacin de la recta.
Anlisis de datos de la cuantificacin de biomasa por peso seco y

densidad ptica
En la presente curva la concentracin estar seguida entre
concentracion
de biomasa
( Lg )= gramos
mililitros de medio
Se ha encontrado que la densidad ptica depende de la concentracin

de biomasa. Para determinar de manera inicial la relacin lineal entre las
dos variables se debe elaborar un diagrama de dispersin.
Medio y agua
1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; Realizar
1:6; 1:7; 1:8; 1:9; 1:10
La disolucin en
10 tubos
Leer
A 640 nm
E.A.P. Biotecnologa
Se realiza una grfica donde se evalu densidad ptica versus

concentracin y se obtendr la pendiente es decir la velocidad de
crecimiento.
Absorbancia en funcin del Peso Seco
E.A.P. Biotecnologa
Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa
la inversa del peso seco del microorganismo que produce un
aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W 0).
Realizar la curva de calibracin de biomasa durante la fermentacin:

La curva de calibracin es estable. No hay necesidad de realizar una
nueva curva para cada lote de determinacin o an para nuevos
reactivos.
Esterilizar las pipetas y rotular
Preparar viales y rotularlos
Preparar el inoculo
Mezclar en un matraz el medio de fermentacin con parte del inculo
Cuando se mezcla el inoculo se deber sacar dos muestras que sern
el tiempo cero y luego leer en el espectrofotmetro

Despus de una hora sacar 5ml de muestra y colocarlo en un tubo
Colocar en agua hirviendo
Leer en el espectrofotmetro 640nm.
Llevar a centrifugar por 10 min y el sobrenadante colocarlo en un vial
Luego el sedimento lavarlo con tampn hasta los 5ml y llevarlo a
centrifugacin por 10 min

Retirar de nuevo el sobrenadante y colocar el sedimento en un
capacho
Repetir esa operacin
Realizar la curva de calibracin
Se hace la grfica concentracin vs. absorbancia y mediante la ecuacin

se saca la glucosa g/L.
E.A.P. Biotecnologa

0.8
0.6
Concentracin g/L
f(x) = 0.36x - 0.03

R = 0.99
0.4
0.2
0
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Absorbancia
Hallndose la ecuacin y = 0.3551x - 0.0281, siendo y:
concentracin,
x: absorbancia.
Procedimiento del cultivo de la fermentacin
15 ml (10 %)
Se muestreara 5 ml en cada hora.
Medio de
mantencin
(15ml)
Medio rico (*50

ml)
Fermentacin (150
ml)
La biomasa inicial del medio rico ser: 0.0336; la biomasa incial en el

medio de fermentacin ser 0.00336.
C 1. V 1=C 2.V 2
0.0336(15)=Xo(150)
Xo=0,00336
E.A.P. Biotecnologa
Abs
orba
ncia
0.55
89
0.36
12
0.31
79
0.25
64
0.14
78
0.06
18
Conc
entra
cin
de
gluco
sa
(g/L)
1.8
1.2
0.8
0.5
0.2
RESULTADOS:
I.
SUSTRATO
a. Curva de calibrado de glucosa
E.A.P. Biotecnologa
Curva de calibrado de glucosa

0.6
f(x) = 0.31x - 0
R = 1
0.5
0.4
Absorvancia
0.3
0.2
0.1
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
1.4
1.6
1.8
Concentracion de glucosa (g/L)
Con
el uso de la ecuacin de recta de la curva de calibrado de glucosa
obtenemos la concentracin de glucosa,
10
E.A.P. Biotecnologa
a
b
s
UNIVERSIDAD
or
b
a
n
ci
b.
a
0.
1
5
2
9
0.
1
4
7
3
0.
1
3
2
2
0.
1
c.
3
4
0.
1
1 Tie
8
8
0.
0
1
2
1
1
4
0. 2
1
2 3
9
4 4
0.
1 5
2
6 6
1
0. 7
1
1
8
0
1
0. 9
1
11
1
5
4
0.
1
NACIONAL DEL SANTA
Lecturas de absorbancia
Se realiz la lectura en el
espectrofotmetro a una
disolucin de 1:12
Curva de DNS
Absor
bancia
12.152
9
12.147
3
12.132
2
12.134
12.118
8
12.121
4
12.129
4
12.126
1
12.110
1
12.115
4
12.120
Conce
ntraci
n (g/L)
3.7717
6016
3.7700
2192
3.7653
3488
3.7658
936
3.7611
7552
3.7619
8256
3.7644
6576
3.7634
4144
3.7584
7504
3.7601
2016
3.7616
E.A.P. Biotecnologa

10
7216
Concentracion de Glucosa (g/L)

3.78
3.77
3.77
concentracion (g/L)
3.76
3.76
3.75
0
9 10
d. Cintica de crecimiento
12
E.A.P. Biotecnologa
13
bi
o
m
UNIVERSIDAD
a
s
a
(
g
/
L
)
9
.
9
2
E
0
6
0
.
0
0
0
0
5
4
7
2
0
.
0
0
0
0
5
1
9
2
0
.
0
0
0
0
5
1
3
6
0
.
0
0
0
0
5
0
2
4
0
NACIONAL DEL SANTA
conce
ntraci
n (g/L)
3.7717
6016
3.7700
2192
3.7653
3488
3.7658
936
3.7611
7552
E.A.P. Biotecnologa
3.7619

4
3.5
3
2.5
Cinetica de
Crecimiento R. eutrofa
glucosa
1.5
1
0.5
0
0
9 10
14
E.A.P. Biotecnologa
DENSIDAD
OPTICA
D
Ab
i
sor
l
ba
u
nci
c
a
i
n
1
0,0
:
334
0
1
1
0,0
:
302
0
2
1
0,0
:
226
0
PESO
3
CON
N1
0,0
BIOM
:
191
ASA
0
4
1
0,0
:
18
0
0,380
15
8
1
0,0
:
135
0
6
0,439
1
0,0
2:
3
126
0
7
1
0,0
:
088
0
0,384
38
8
1
0,0
:
097
0
9
1
0,0
:
087
15
1
0
BIOMASA
PESOS SECO
PESO
SIN
BIOMA
SA
0,38
0,4389
0,3842
B
I
O
M
A
S
A
0
,
0
0
0
8
0
,
0
0
0
4
0
,
0
0
0
CONCEN
TRACION
(g/L)
0,00016
0,00016
0,00012
E.A.P. Biotecnologa
CONCEN
ab
D
TRACIO
so
6
N (g/L)
rv
0,433
0,4328
0
an
6
,
ci
0
a
0
0,0334
0,
0
1:
00
8
01
0,354
0,3537
0
6
1
,
0,0302
0,
000
1:
001
06
0,0226
40,
0,403
0,4029
000
1:
2
,
01
02
0,0191
0
8E
0
1:
305
0,018
8E
1:
05
0,0135
6E
1:
05
8E-05
8E-05
6E-05
Como
sacamos 5 ml para hallar el peso seco entonces para hallar la
concentracin se tiene: g de peso seco/ 5ml
16
E.A.P. Biotecnologa
Curva de calibrado de Biomasa

0
0
0
f(x) = 0.01x - 0
R = 0.96
absorvancia
Linear (absorvancia)
0
0
0
0
0
0.01
0.02
0.02
0.03
0.03
0.04
I.
CINTICA DE FERMENTACIN
17
DENSIDAD
OPTICA
E.A.P. Biotecnologa
T
i
e
m
p
o
18
1
0
ab
sor
va
nci
a
0,0
10
7
0,0
18
7
0,0
18
2
0,0
18
1
0,0
17
9
0,0
18
5
0,0
28
1
0,0
20
9
0,0
18
7
0,0
21
8
E.A.P. Biotecnologa
DENSIDAD PTICA
0.03
0.03
0.02
DENSIDAD OPTICA
0.02
0.01
0.01
0
0
10
Se calcula
la concentracion a partir de la formula de la ecuacion de la recta de la
curva de calibrado (y = 0,0056x - 2E-05)
19
E.A.P. Biotecnologa
T
i
e
m
p
o
20
ab
sor
ba
nci
a
0,0
10
7
0,0
18
7
0,0
18
2
0,0
18
1
0,0
17
9
0,0
18
5
0,0
28
1
0,0
20
9
0,0
18
7
bio
ma
sa
(g/
L)
9,9
2E06
0,0
00
05
47
2
0,0
00
05
19
2
0,0
00
05
13
6
0,0
00
05
02
4
0,0
00
05
36
0,0
00
10
73
6
0,0
00
06
70
4
0,0
00
05
47
2
E.A.P. Biotecnologa
1
0
0,0
21
8
0,0
00
07
20
8
Crecimiento de la Biomasa en la Fermentacin

0
0
0
Densidad Opstica
Fementacion
0
0
0
0
0
21
E.A.P. Biotecnologa
22
E.A.P. Biotecnologa

II.
23
CONCENTRACION DE mx
E.A.P. Biotecnologa
24
L
bio
n(
mas
X/
Tie
a
X
(g/L)
0)
9,92
0
0
E-06
1,
7
0
7
6
7
6
0,00
3
0054
5
2
72
2
1,
6
5
5
1
51
0,00
1
0051
5
3
92
1
1,
6
4
4
3
0
6
0,00
7
0051
3
4
36
8
1,
6
2
2
2
5
8
0,00
6
0050
0
5
24
1
1,
6
8
6
9
9
6
0,00
1
0053
4
6
6
7
0,00
2,
7
0107
3
36
8
1
E.A.P. Biotecnologa
Ln(X/X0)
3
2.5
2
Ln(X/X0)
1.5
1
0.5
0
0
10
De esta grfica solo tomaremos la fase de crecimiento

es decir los 3 puntos para as poder determinar el
mx, pues es donde apreciamos crecimiento y los
dems es constante y en declive. :
umax : 0.3797 h^1
25
0,0
00
05
02
4
0,0
00
05
36
0,0
00
10
73
6
6
7
1,6
22
25
86
01
1,6
86
99
61
47
2,3
81
63
47
52
E.A.P. Biotecnologa
DETERMINACION DE mx
3
2.5
f(x) = 0.38x + 1.14
R = 0.81
2
1.5
Linear ()
1
0.5
0
5
DETERMINACION DE
= Ln(x) /t
= 0,968579885
RENDIMIENTO
26
YX/S = 0,010088 / 0,00006216
E.A.P. Biotecnologa
YX/S = 0,006161776
TIEMPO DE DUPLICACIN
td= Ln2/ max
td = 1,825512722
e. Presencia de PHA en clulas de Ralstonia eutropha
27
E.A.P. Biotecnologa
DISCUSIN:
Karger AG, (2008) cita que el polmero se acumula en grandes cantidades

en la clula y se puede utilizar para diversas aplicaciones, efectivamente el
PHA hallado en las clulas de Ralstonia eutropha se acumul a tal forma
que se hizo reconocible por medio del microscopio en nuestra experiencia.
Segn Spiekermann (1999) menciona el colorante oxazina azul Nilo A y su

forma oxazone fluorescente, rojo Nilo, se utilizaron para desarrollar un
mtodo de tincin simple y altamente sensible para detectar poli (cido 3hidroxibutrico) y otros cidos polyhydroxyalkanoic (PHA) directamente en
el crecimiento de colonias bacterianas. Este mtodo de tincin viablecolonia era aplicable en particular a las bacterias gram-negativas tales
como Azotobacter vinelandii, Escherichia coli, Pseudomonas putida, y
Ralstonia eutropha. No empleamos este colorante para detectar la
presencia de PHA en los microorganismos pero si pudimos distinguir unas
pequeas formaciones dentro de las clulas las cuales las presentamos en
fotografas.
R. eutropha, sin embargo, no se limita a los PHA y polmeros relacionados

con PHA como poli (cidos mercaptoalcanoico), ya que tambin se puede
28
E.A.P. Biotecnologa

emplear para la produccin de una gama de otros polmeros interesantes,
citado por Karger (2008); la acumulacin de PHA en las clulas se debi
principalmente a la carencia del nutriente limitante nitrgeno, por ello su
produccin de otros polmeros mencionados es causado por nutrientes
limitantes de otra naturaleza.
Segn Martinez (2010)

menciona que el inculo se prepar en
Erlenmayer de 1 L conteniendo 200 mL del medio descrito anteriormente,
en shaker orbital durante 24 h a 200 rpm y 35C. En comparacin con el
nuesto que fue en un matras de 200 ml con un agitacin de 200 rpm y
28C; la diferencia recae en la temperatura por lo que encontramos nuestra
baja produccin de biomasa. El cultivo de fermentacin lo efectuaron a 300
rpm. En 60 horas de fermentacin con nitrgeno limitante se produjeron
22.5 g/L de biomasa.
En este perodo, se consumieron 1.5 g/L de fuente de nitrgeno y se

metabolizaron 26.2 g/L de glicerol. La sntesis de PHB, producto de inters,
comenz a las 32 horas y lleg a una concentracin final de 3.3 g/L.
CONCLUSIN:
El crecimiento en lote de Rasltonia eutropha en un medio qumicamente

definido pero con limitaciones del nutriente nitrgeno gener cambios
fisiolgicos debido a la acumulacin del compuesto de reserva PHA.

La acumulacin y reserva de PHA responde a la deficiencia de un nutriente
en el medio, en este caso la fuente de nitrgeno, ya que detiene el
crecimiento exponencial. Como se observ en el microscopio.

Una posible causa del poco crecimiento es por la temperatura puesta a
28C ya que en la bibliografa encontramos a 30C.
BIBLIOGRAFA:
Spiekermann, P., Rehm, B., Kalscheuer, R., Baumeister, D. and Steinbuchel
A. (1999). A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for
direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and
other lipid storage compounds. Arch Microbiol 171 (2): pp. 7380)
29
E.A.P. Biotecnologa
Reinecke F, Steinbchel A. Ralstonia eutropha strain H16 as model

organism for PHA metabolism and for biotechnological production of
technically interesting biopolymers. 2008 S. Karger AG, Basel. Institut fr
Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie, Westflische WilhelmsUniversitt Mnster, Mnster, Germany.
Shahhosseini, S. Simulation and optimization of PHB production in fedbatch culture of Ralstonia eutropha.(2004) Process Biochemistry 39, 963969.
Loperena, G. M. (2010). Produccin microbiana de biopolmeros a partir de

glicerol. Departamento de Bioingeniera, 1-10.
ANEXOS:
CALCULOS DEL MEDIO:
Elemento en nutriente:
carbono: P.M = 12
GLUCOSA = C6H1206
P.M de glucosa =180 gr
180 gr de glucosa
100% de E.N
72 gr de carbono
x % de E.N
x=
72100
180
x = 40 %
30
Nitrgeno : P.M = 14
Sulfato de amonio = (NH4)2SO4
P.M de sulfato de amonio =132 gr

E.A.P. Biotecnologa
132 gr de sulfato de amonio
28 gr de nitrgeno
x=
100% de E.C
x % de E.C
28100
132
x =1.21%
Magnesio : P.M = 24.3
Sulfato de magnesio heptahidratado = MgSO4.7H2O
P.M de sulfato de magnesio =246.03 gr
246.3 gr de sulfato de magnesio
24.3 gr de magnesio
x=
x % de E.C
24.3100
246.3
100% de E.C
x = 9.87%
Azufre : P.M = 32
Sulfato de amonio = (NH4)2SO4
P.M de sulfato de amonio =132 gr
132 gr de sulfato de amonio
32 gr de azufre
x=
100% de E.C
x % de E.C
32100
132
x = 24.24%
Potasio : P.M = 39
Fosfato de potasio monobsico = KH2PO4
P.M de fosfato de potasio =135.9 gr
135.9 gr de fosfato de potasio

39 gr de potasio
100% de E.C
x % de E.C
31
E.A.P. Biotecnologa

x=
39100
135.9
x = 28.69%
Fosforo : P.M = 30.9
Fosfato dicido de potasio = K2HPO4
P.M de fosfato de potasio =173.9 gr
173.9 gr de fosfato de potasio
100% de E.C
30.9 gr de fosforo
x % de E.C
x=
30.9100
173.9
x =17.77%
Hierro : P.M = 55.8
Sulfato de hierro = FeSO4
P.M de sulfato de hierro =151.8 gr
151.8 gr de sulfato de hierro
55.8 gr de hierro
100% de E.C
x % de E.C
x=
55.8100
151.8
x= 36.76%
32
E.A.P. Biotecnologa
33
E.A.P. Biotecnologa

Ralstonia

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CULTIVO POR LOTE DE Rasltonia eutropha NRRLB-14690 EN

MEDIO QUMICAMENTE DEFINIDO CON LIMITACIN DE

externos de Cd2+ y reducir los efectos nocivos de los

metales pesados en el crecimiento de las plantas de tabaco.

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intracelulares, tiene lugar mediante condensacin del grupo carboxilo de un

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Medio de Mantencin (PGY-Agar) para la cepa Ralstonia Eutropha

Ajustar pH 7.0 con 0.2 M de HCl.

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Cada nutriente como indica en la Tabla 01

15 ml de agua destilada en matraz

Con mechero Bunsen hasta ebullir

Hasta aparecer burbuja

En 5 tubos de ensayo con tapa (3ml en cada uno).

En autoclave a 121C 15 min desde la primera burbuja

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El medio de trabajo con alcohol 96

Bajo mechero para un ambiente estril

El asa bacteriana al fuego a rojo vivo

El asa por las paredes del tubo que contiene la cepa

Una asada de la clula desarrollada

El tubo antes de cerrarlo

En 5 tubos de ensayo reparados con medio solido agar

Por dentro del tubo del medio solido la azada

Por la superficie desde adentro hacia afuera

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Ajustar pH 7.0 con 0.2 M de HCl.

xf 0.48 * (1.4) 0.672g / L

Si un volumen de 15 mL se traspasa aspticamente a 120 mL de

concentracin del inculo es x0=0.084 g/L.

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Medio de cultivo para alcanzar 1.5 g/L de biomasa final en el matraz

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40/50 * 0.6 = 0.48

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Elementos menores y trazas

1.5 mL/ L medio

1.5 mL/L medio

Ajustar a pH=7.0 (ajustado con NaOH 3M, HCL 3 M), si se desea se

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Preparacin del reactivo 3,5 dinitro saliclico

Procedimiento para preparar el reactivo

Procedimientos para la curva de calibracin

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Realizar la curva de abs vs [ ].

a 100C por 5-10 minutos

Procedimiento para el anlisis de biomasa:

Con papel aluminio

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Los 10 tubos por 15 min

80C /24 horas

Determinacin de la curva de concentracin celular en base seca

De cada dilucin realizar lecturas de absorbancia (640 nm)

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Graficar la biomasa en peso seco vs absorbancia y se determinar la

Anlisis de datos de la cuantificacin de biomasa por peso seco y

Se ha encontrado que la densidad ptica depende de la concentracin

1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; Realizar