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INSTITUTO BIOMDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA
APOSTILA
DE
AULAS PRTICAS
- DISCIPLINA BACTERIOLOGIA
ASSUNTO 4: Diluio
Contagem de UFC viveis
Obteno de Cultura pura
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23
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ANEXO I
Tcnicas de Colorao
Colorao de Gram
Colorao de Zihel-Neelsen (BAAR)
Tcnica Para Evidenciao de Espiroquetas
Mtodo de Albert-Laybourn
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45
45
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APRESENTAO
O aprendizado terico e prtico de microbiologia, incluindo a bacteriologia, muito
importante para o profissional farmacutico. As reas de atuao em anlises clnicas,
enzimologia, controle microbiolgico de medicamentos e alimentos, entre outras,
exigem um profundo conhecimento desta disciplina.
Muitas vezes os alunos no percebem a importncia da bacteriologia, pois como o curso
ministrado durante o ciclo bsico, h uma grande distncia entre o curso de
bacteriologia e as demais disciplinas nela embasadas durante o curso de graduao. Ao
chegarem ao ciclo profissional percebem o quo fundamental ela para o entendimento
de outras disciplinas, assim como, para seu futuro profissional.
A presente apostila resulta do processo de atualizao e aperfeioamento da apostila de
aulas prticas de bacteriologia para o curso de Farmcia. A apostila contm explicaes
tericas e prticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma clara e
didtica. No final de cada assunto o aluno poder tirar as suas concluses da prtica
executada. Sempre que possvel procurou-se utilizar esquemas, gravuras e ilustraes
que facilitassem a compreenso do assunto.
Cada assunto apresenta uma introduo contendo a teoria do tema abordado, assim
como a sua aplicao e importncia no exerccio da profisso, objetivando o melhor
entendimento do tema, dos materiais a serem utilizados, da execuo e dos resultados
obtidos.
Finalmente procurou-se acentuar a importncia e aplicao de cada prtica no contexto
das atividades de um farmacutico de modo a estimular o aprendizado.
ASSUNTO 1:
- Material utilizado nas prticas de Bacteriologia.
- Tcnica e Processos de Assepsia em Bacteriologia.
- Microscopia.
INTRODUO:
TCNICA E PROCESSO DE ASSEPSIA
importante ter claro os procedimentos que se deve adotar na manipulao
segura dos meios, culturas bacterianas, etc, de modo a evitar qualquer tipo de
contaminao. Tais procedimentos so denominados genericamente de tcnicas de
assepsia e incluem:
fazer a desinfeco da rea de trabalho e a antissepsia das mos sempre antes e
depois de trabalhar (1);
trabalhar sempre na rea de segurana (aproximadamente 10cm) em volta da
chama do bico de Bunsen (2);
esterilizar adequadamente alas e agulhas de inoculao antes e depois do seu
uso, evitando a criao de aerossis, para isso aquecendo sempre da base para a
ponta (3);
flambar a boca dos frascos e tubos antes e depois das inoculaes (4).
BACTRIAS NO AMBIENTE
A presena de bactrias pode ser verificada em quase todos os ambientes, no solo, na
gua, no ar e colonizando o nosso corpo (ex: trato gastrointestinal, pele). A manipulao
e conservao incorretas de medicamentos so fatores predisponentes sua
contaminao por microrganismos. Dentre estes podem estar presentes microrganismos
patognicos ou microrganismos deterioradores.
Fundamentao Terica
A presena de bactrias uma constante nos mais variados ambientes. Freqentemente
tais bactrias no esto associadas a nenhum prejuzo. A microbiota intestinal
desempenha importante papel na defesa do organismo contra certas infeces; existem
estudos que sugerem que a microbiota normal estimula o desenvolvimento das defesas
imunolgicas. Ao mesmo tempo que desenvolve atividades benficas a microbiota pode
ser responsvel por uma srie de doenas oportunistas que podem ser relacionadas, por
exemplo, ao uso constante de drogas imunossupressoras, antibiticos e internaes em
UTI.
Muitas infeces causadas por bactrias so adquiridas por contato direto ou veiculadas
por alimentos. Ao contrrio do que se pensava antigamente, a disseminao de bactrias
patogncias pelo ar e poeira no ocorre com grande freqncia, pois de um modo geral,
no sobrevivem por longos perodos no ambiente externo. Entretanto, estas vias de
transmisso podem ser de grande importncia em determinadas situaes. No caso de
bactrias esporuladas a transmisso area mais importante. No ambiente hospitalar
deve ser feito o controle microbiano frequentemente para evitar contaminaes. Os
alimentos so uma importante via de transmisso de doenas bacterianas como a
shigelose, salmonellose, clera e vrias outras. O farmacutico deve estar atento
sempre.
OBJETIVOS:
1- Apresentar a vidraria e outros materiais de uso corrente em um laboratrio de
Microbiologia.
2- Executar tcnicas de preparo de material e montagem para esterilizao.
3- Treinar tcnicas de distribuio assptica.
4- Evidenciar a existncia de bactrias no ar, roupas, etc.
5- Explanao sobre o microscpio.
Aps a realizao da atividade prtica voc dever ser capaz de constatar a presena de
bactrias no ambiente; compreender a importncia dos critrios bsicos de higiene no
ambiente hospitalar e, na produo e manipulao de medicamentos, visando evitar a
contaminao dos mesmos por bactrias ambientais;
MATERIAL:
-
Vidrarias.
Outros materiais de uso em um laboratrio de Microbiologia.
gua peptonada.
Placas de Petri com Agar simples.
Pipetas e tubos de ensaio estreis.
Papel, barbante, algodo cardado, gaze.
d. Abrir as placas de Agar simples (1 por grupo), fora da rea de segurana, deixando
cada uma por 5, 10, 15 e 20, fechando quando atingido o tempo respectivo. Incubar a
37o C por 48 horas e analisar o crescimento obtido.
5 min
10 min
15 min
20 min
1.
DEDO
4.
CABELO
2.
JALECO
3.
BANCADA
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ASSUNTO 2:
- Meios de Cultura
- Tcnicas de Semeadura
INTRODUO:
O estudo das bactrias necessita normalmente do seu prvio isolamento e
identificao. Para tanto diversos meios de cultura so utilizados. Define-se meio de
cultura como uma mistura de nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrognio, sais
minerais e gua, que propiciam o crescimento in vitro de bactrias. A maioria das
bactrias cresce em meios de cultura. Excees so as riqutsias e clamdias que por
serem parasitas intracelulares obrigatrios s se desenvolvem in vitro em meios
celulares (cultivo celular, ovos embrionados), Mycobaterium leprae e Treponema
pallidum. A inoculao das bactrias em diferentes meios envolve vrias tcnicas de
semeadura. Toda a manipulao de culturas bacterianas, meios e instrumental
necessrio deve ser feita seguindo-se procedimentos bsicos de assepsia e antissepsia,
visando evitar qualquer tipo de contaminao.
MEIOS DE CULTURA
Para uma melhor compreenso das diversas finalidades e usos dos meios de cultura,
apresentamos a seguir uma breve classificao dos mesmos:
A) Quanto composio:
A.1) Naturais so aqueles de origem vegetal (um pedao de batata, po, frutas)
ou animal (gema de ovo).
A.2) Artificiais so aqueles constitudos de substncias qumicas podendo ser
definidos ou indefinidos (complexos).
Definidos: sabido toda a sua composio.
Indefinidos ou Complexos: desconhecido por si. Sabe-se apenas
aproximadamente. Os meios utilizados na rotina so complexos.
B) Quanto ao seu estado fsico:
Lquido so os caldos, desprovidos de agar.
Semi-slido so aqueles que apresentam em sua composio at 1% de agar.
Slido so aqueles que apresentam em sua composio 1,5 a 2,5% de agar.
C) Quanto finalidade e caractersticas:
Simples contm apenas componentes bsicos para o crescimento de uma
bactria.
Enriquecido meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a
bactria pela adio de substncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro,,
leite. De uso freqente para bactrias de difcil crescimento (fastidiosas).
De enriquecimento meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactrias
acompanhantes e permitir o crescimento da bactria alvo que pretende-se
posteriormente isolar aumentando assim a proporo desta em relao s demais.
Por ser um meio lquido no destina-se ao isolamento da bactria.
C. Em Placa de Petri:
C.1. Em superfcie:
Estrias mltiplas ou esgotamento: fazer o inoculo em um ponto da superfcie
do meio, flambar a ala, deixar esfriar e da semear em ziguezague em toda a superfcie
do meio.
Difuso: com ala de platina ou pipeta, introduzir o inoculo ( 0,1 mL) na massa
do meio. Este tipo de semeadura empregada para obteno do crescimento
bacteriano. um repique normal.
OBJETIVOS:
1- Explanao sobre os principais meios de cultura empregados em laboratrios de
Microbiologia
2- Identificao das tcnicas de semeadura mais empregadas na rotina
bacteriolgica
3- Cultivo de bactrias com finalidade de obteno de cultura pura, ou seja, uma
populao onde todas as bactrias se originam de uma nica clula bacteriana.
MATERIAL:
-
ASSUNTO 3:
- Esterilizao e Desinfeco
- Ao dos Agentes Fsicos e Qumicos sobre as Bactrias
INTRODUO:
As taxas de crescimento e morte microbianas so fortemente influenciadas
por vrios fatores ambientais. O controle microbiano compreende uma srie de
procedimentos com a finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir ou impedir
a multiplicao de microrganismos existentes em um determinado equipamento,
ambiente, em alimentos ou em superfcies vivas. de extrema importncia
apresentando inmeras aplicaes prticas na rea mdica e de alimentos. A
conservao de medicamentos envolve sempre o uso de uma ou mais tcnicas
empregadas no controle microbiano.
Fundamentao Terica
importante inicialmente definir alguns termos utilizados no controle microbiolgico:
A) Desinfeco significa reduo do nmero de microrganismos em superfcies
inanimadas (ambiente ou materiais) e conseqente eliminao de sua
potencialidade infecciosa.
B) Sanitizao mesmo significado de desinfeco, porm utilizado rotineiramente em
indstria de alimentos.
C) Antissepsia significa reduo do nmero de microrganismos em tecidos vivos.
D) Esterilizao destruio ou remoo completa dos microrganismos em ambientes
ou materiais.
E) Assepsia significa ausncia de microrganismos / as tcnicas asspticas representam
uma srie de cuidados que previnem a contaminao.
O controle de microrganismos pode ser feito por agentes fsicos ou qumicos.
1 Controle Microbiano por Agentes Fsicos
Calor
o mtodo mais empregado para destruio de microrganismos por ser barato,
eficaz e prtico. Quando se tem finalidade esterilizante deve ser calculado para a
destruio das formas esporuladas de bactrias, mais resistentes. Pode ser utilizado
na forma de calor seco ou calor mido em funo da presena de gua. O primeiro
mata as bactrias por oxidao protica, enquanto o segundo por desnaturao
protica. Alm disso, o calor mido um mtodo de maior eficincia devido gua
ser um melhor condutor de calor do que o ar.
Calor seco: na ausncia de gua
- Flambagem: contato direto do material a ser tratado com o fogo, um tipo de
esterilizao.
- Forno ou Estufa: material submetido a uma temperatura de 170 a 180o C por 1 2 horas, um tipo de esterilizao, porm no qualquer material que pode ser
submetido a esse tratamento. Utilizado principalmente para vidraria e metais
(instrumentos cirrgicos p. ex.)
- Incinerao: a queima total de um material, mtodo utilizado com materiais
descartveis, principalmente aqueles materiais hospitalares.
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OBS: Dos cresis o mais importante a creolina, utilizada para pisos e sanitrios. O
hexaclorofeno muito usado na antissepsia cirrgica.
lcool Etlico: possui vrios mecanismos de ao, sendo relativamente eficiente,
so solventes de lipdios (ao detergente), so desidratantes (retiram a gua das
clulas) e desnaturam protenas. O lcool etlico pode ser usado como desinfetante
ou anti-sptico. O lcool absoluto (no hidratado) fraco germicida. Um lcool
parcialmente hidratado (60- 70%) mais ativo que o absoluto, pelo maior poder de
penetrao e conseqente desnaturao protica mais rpida.
Cloro / Iodo (Halognios)
- O Cloro desinfetante de guas, alimentos e pisos. Mecanismo de ao oxidante.
Cl2 + H2O HCl + HClO
cido hipocloroso instvel, espontaneamente forma mais HCl e oxignio nascente, isso
que matar os microorganismos.
- O mecanismo de ao do Iodo a sua combinao irreversvel com protenas atravs
da interao com aminocidos aromticos, fenilalanina e tirosina, levando
desnaturao das mesmas. um dos anti-spticos mais utilizados na prtica cirrgica.
Detergentes catinicos (agentes de superfcie): alteram a permeabilidade de
membrana ( ex: compostos quaternrios de amnio cloreto de benzalcnio).
Mais ativo contra Gram negativos
Sais de Metais Pesados:
- Mercrio (Hg): anti-sptico . Em desuso pelo risco de intoxicao por absoro.
- Sulfato de Cobre (CuSO4): desinfetante para guas de recreao.
- Nitrato de Prata (AgNO3): anti-sptico, altamente eficiente contra gonococos, que
causam oftalmia em recm-nascidos e gonorria em adultos com vida sexual ativa.
Atuao: afinidade por protenas, inativando enzimas, por isso importante no
ingeri-los.
Uso tpico apenas.
cidos orgnicos e inorgnicos:
Freqentemente usados na conservao de alimentos. Exs.: cidos actico, ltico,
benzico.
lcalis:
Hidrxido de Sdio (NaOH)= presente nos sabes conferindo a estes a sua relativa ao
anti-sptica.
Outros: KOH, Ca(OH)2
Corantes Bsicos: mais eficientes contra Gram positivos. Ex.: Cristal Violeta,
Azul de Metileno.
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Oxidantes e Redutores
- Oxidantes: oxidam componentes celulares levando morte das clulas. Ex.:
Oznio (O3), gua oxigenada (H2O2), permanganato de potssio, perxido de zinco.
Usados como anti-spticos.
- Redutores: reduzem compostos celulares levando morte das clulas.
Aldedos e derivados:
Formaldedo/ formalina: muito irritante / So usados para desinfectar paredes e
pisos.
Glutaraldedo: mais ativo e menos txico que o formaldedo; esporocida aps 6
horas de contato)
xido de Etileno (gs): um agente alquilante inativando protenas e cido
nuclico. Usado em um recipiente fechado que recebe todo material a ser utilizado
(contm algumas ampolas de xido de etileno lquido), temperatura de 52o C, este
lquido torna-se gasoso, assim, seus vapores so esterilizantes. Usado para esterilizao
de materiais de borracha ou plstico.
A clula microbiana est em equilbrio, oxidantes e redutores rompem esse equilbrio,
matando a clula.
Antimicrobianos: ao contrrio dos anteriores possuem ao seletiva contra
microrganismos por isso no sero discutidos neste assunto.
OBJETIVOS:
- Verificar a eficincia de agentes qumicos e fsicos sobre as bactrias.
Aps a realizao da atividade prtica voc dever ser capaz de conceituar e diferenciar
os termos utilizados no controle microbiolgico; descrever os agentes fsicos e qumicos
utilizados no controle microbiano; entender o funcionamento de autoclaves e fornos de
esterilizao, diferenciando calor mido de calor seco; compreender as diferenas
encontradas na destruio de microrganismos esporulados e no esporulados frente
ao do calor; compreender as diferenas encontradas na ao dos diferentes mtodos
de antissepsia utilizados.
MATERIAL:
- Placas de Petri com agar simples ou caldo simples
- Culturas de E. coli e Bacillus sp
- Solues antisspticas
- Gaze
- Trip, tela de amianto e panela
EXECUO:
A Agentes Qumicos: observao da ao de antisspticos sobre bactrias a
microbiota da pele.
a) Numa placa de agar simples dividida em 4 quadrantes fazer a semeadura do 1
quadrante utilizando a ponta do polegar (fazer a impresso digital suavemente para no
ferir a camada do meio de cultura);
b) Um segundo aluno lava seu polegar com sabo e gua por 1 minuto, seca com
gaze estril e inocula o segundo quadrante fazendo a impresso do dedo;
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3. DEDO + 4. DEDO +
ANTIS. 1
ANTIS. 2
t0
t5
t10
t20
E
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ASSUNTO 4:
- Diluio
- Contagem de u.f.c.viveis
- Obteno de Cultura Pura
OBJETIVOS:
1. Metodologia de Diluies
2. Plaqueamento para contagem de u.f.c. viveis
3. Contagem de u.f.c. viveis
4. Obteno de cultura pura
MATERIAL:
- Tubos com 9mL de salina
- Placas de Petri com Agar simples
- Alas de Drigalski
- Cubas com lcool 70
- Agar inclinado
- Caldo simples
- Cultura bacteriana em caldo
- Pipetas de 1mL
PRTICA PARA EXECUTAR:
a. Diluio
A partir da cultura bacteriana, inocular 1mL em 9mL de salina, homogeneizar, retirar
1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina... Obtendo assim, as diluies 1/10,
1/100, 1/1000...
b. De cada diluio inocular 0,1mL, em duplicata, na superfcie do meio de Agar
simples. Semear por distenso com ala de Drigalski. Incubar a 37C por 24 horas.
c. Contagem da u.f.c. com diluio n placa 1 + n placa 2 aplicar na frmula:
2
u.f.c. = n encontrado x diluio x inoculo
d. Repicar u.f.c. para Agar inclinado e caldo simples.
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ASSUNTO 5:
- Colorao Simples
- Morfologia
INTRODUO:
Torna-se necessrio fixar e corar as bactrias para o estudo exato da sua morfologia e
citologia. Com efeito, a pequenez dos detalhes estruturais, a falta de contraste natural
destes detalhes e o movimento das bactrias aliado sua grande refringncia, tornam
impossvel o estudo morfolgico exato destes organismos nos simples exames a fresco.
A fixao a coagulao do protoplasma bacteriano e a sua colagem s lminas,
com o mnimo de deformao, quer dizer, imobilizao dos microrganismos e das
estruturas celulares. So agentes fixadores o calor, atuando em escala moderada, os
vapores de cido smico, o formol, o ter, os sais de mercrio, etc.
Os corantes so substncias dotadas de cor prpria e que uma vez dissolvidas
comunicam essa cor s estruturas com as quais so postas em contacto.
Os corantes usados em Bacteriologia so produtos artificiais ou sintticos.
Os corantes sintticos, so compostos orgnicos de estrutura complexa em que
um ou mais anis benznicos se encontram ligados a um grupo auxcromo e outro
cromforo.
a. A funo do grupo cromforo conferir ao composto a cor.
b. A funo do grupo auxcromo permitir a dissociao inica do corante,
tornando-o apto a formar sais e a reagir quimicamente com os tecidos, clulas e
estruturas celulares.
Os corantes da Bacteriologia so sais e podem ser classificados em corantes
cidos e bsicos.
Os corantes bsicos so corantes de eleio da Bacteriologia uma vez que as
bactrias, possuem carga eltrica negativa. Deste modo, a afinidade eletroqumica torna
possvel a fixao do radical corado sobre as estruturas celulares das bactrias, o que
no sucede com os corantes cidos cujo radical corado eletronegativo.
Os mordentes so substncias que reforam a ao dos corantes, so
principalmente usados como mordentes em Bacteriologia, o cido tnico, o cido
crmico, o cido fnico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor, os alcalis; estas substncias
aumentam a energia de fixao das cores sobre as estruturas celulares.
Classificao esquemtica das tcnicas de colorao
1. Coloraes simples ou monocromticas - em que actua apenas um soluto corante.
2. Coloraes duplas ou policromticas - em que actuam sucessivamente dois solutos
corantes.
Destas duplas coloraes h duas que so de interesse fundamental em Bacteriologia
Mdica, a colorao de Gram e a colorao de Ziehl-Neelsen3.
OBJETIVOS:
1. Identificao dos vrios tipos de corantes de acordo com os diversos mtodos de
colorao empregados em Bacteriologia.
2. Preparao de esfregaos partindo de meio lquido e de meio slido.
3. Fixao de esfregao por meios fsicos e qumicos.
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ASSUNTO 6:
- Colorao de Gram
INTRODUO:
O mtodo de colorao de Gram o mais utilizado em Bacteriologia e permite a
diferenciao da maioria das bactrias em 2 grupos pelas diferenas marcantes na
parede celular que apresentam. Baseado nessas diferenas de parede celular os corantes
utilizados coram as bactrias Gram-positivas em roxo e as Gram-negativas em
vermelho.
O mtodo de Gram utilizado na maioria das infeces bacterianas, permitindo
o diagnstico de algumas delas com bastante segurana. Porm no se aplica para
micoplasmas, bactrias desprovidas de parede, micobactrias pela presena de muitos
lipdios insolveis na parede e espiroquetas pela estrutura muito delgada e pouco
permevel aos corantes.
Fundamentao Terica
A colorao pelo mtodo de Gram chamada de colorao diferencial porque
so utilizados dois corantes e as bactrias ficam coradas em tonalidades diferentes. Isso
possvel devido composio da parede celular das mesmas.
Essas bactrias podem ser aerbias, anaerbias facultativas e anaerbias.
Possuem a forma de cocos, bacilos ou vbrios (bacilos encurvados). Muitas so
patognicas e outras, membros da microbiota normal do corpo humano.
A maioria dos cocos Gram-positiva com exceo dos gneros Neisseria e
Veillonella que so os nicos Gram-negativos; entre os bacilos Gram-positivos incluemse aqueles pertencentes aos gneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus
e Clostridium; os demais bacilos so Gram-negativos (a maioria); os vbrios so Gramnegativos.
A investigao das caractersticas morfolgicas e de colorao (morfo-tintoriais)
das bactrias etapa inicial de grande importncia no isolamento e identificao de
bactrias de material clnico bem como de alimentos. No entanto, a identificao
completa de uma bactria sempre necessitar de dados fisiolgicos ou genticos da
mesma.
O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da parede celular,
sendo que as G+ possuem uma espessa camada de peptideoglicano e cido teicico, e as
G-, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada
composta por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e lipopolissacardeos. Durante o
processo de colorao, o tratamento com lcool (ou cool-acetona) extrai os lipdeos,
da resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das G-.
Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as G- so descoradas.
A parede celular das bactrias G+, em virtude de sua composio diferente, torna-se
desidratada durante o tratamento com lcool, a porosidade diminui, a permeabilidade
reduzida e o complexo CV-I no pode ser extrado.
Outra explicao baseia-se tambm em diferenas de permeabilidade entre os
dois grupos de bactrias. Nas bactrias G+, o complexo CV-I retido na parede aps o
tratamento pelo lcool, o que causa, provavelmente, uma diminuio do dimetro dos
poros da camada de glicopeptdeo ou peptideoglicano da parede celular. Os poros da
parede das bactrias G- permanecem suficientemente grandes, mesmo depois do
tratamento pelo lcool, possibilitando a extrao do complexo CV-I.
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Lulu
Cristal Lugol
Violeta
Ali
lcool gua
Fumar
Algo
Fucsina
gua
20
Notas:
1. O etanol poder ser usado como agente descorante fraco.
2. O material dos corantes empregados na tcnica, principalmente sedimento do cristal
violeta poder aparecer como artefato.
3. O descoramento para mais ou para menos resultante de incorreta diferenciao pelo
lcool.
4. A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamental na colorao de Gram.
Em culturas envelhecidas, clulas Gram-positivas freqentemente se tornam Gramnegativas. Enzimas lticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem
causar danos membrana da clula, como por exemplo, alterando a permeabilidade dos
solventes. Conseqentemente, o complexo iodo-cristal violeta poder ser retirado da
clula.
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ASSUNTO 7:
- Cocos Gram-positivos
INTRODUO:
Identificao das bactrias de importncia mdica
material de colheita: secrees, lquidos biolgicos e outros
Cocos Gram positivos:
Dentre as duas famlias conhecidas (Microcacceae e Streptococcaceae), trataremos dos
gneros e das espcies de interesse patognese das infeces.
I.
Staphylococcus
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Provas bioqumicas
- Prova da Catalase:
A prova da catalase se destina a verificao da presena da enzima catalase. A
prova pode ser efetuada com o crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de
cultura, exceto meios com sangue pois este possui catalase, levando a resultados falsopositivos.
A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio com formao
de gua e oxignio molecular. A verificao da produo dessa enzima por determinada
bactria pode ser feita adicionando-se perxido de hidrognio (H2O2 a 30%) a cultura
em meio slido ou lquido, e verificando-se desprendimento de bolhas gasosas (O2). Na
ausncia de catalase, no h decomposio do perxido.
Uma leitura da prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de
um crescimento em agar-sangue da seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma
gota de perxido em uma rea do meio desprovida de crescimento e em seguida sobre
uma colnia a ser testada. Considera-se positivo apenas se o borbulhamento foi mais
rpido e intenso sobre a colnia.
- Fermentao do Manitol:
O manitol um acar que alguns microorganismos so capazes de utilizar como
fonte de energia atravs da fermentao. A prova se baseia na alterao do pH do meio,
graas a produo de cidos durante o processo de fermentao. Essa mudana de pH
pode ser observada pela viragem de cor do meio devido a presena do indicador de pH
Vermelho de Fenol. A prova pode ser realizada em meios de cultura lquidos ou slidos.
Aps a semeadura, o meio deve ser incubado a 37C por 18 24 horas.
Interpretao:
positivo: amarelo
negativo: no h alterao da cor
- Prova da coagulase:
A coagulase estafiloccica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e
coagulase livre.
A coagulase ligada, presente na parede da clula bacteriana, converte o
fibrinognio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulao, e
pode ser detectado em teste direto em lmina, utilizando-se da suspenso de
Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos
circulares e observando-se a formao de cogulo no tempo de 1-2 minutos. Pode-se
tornar mais sensvel o teste em tubo, por este detectar tanto a coagulase livre quanto a
ligada, sendo a prova de escolha.
A coagulase livre produzida e liberada pelo microorganismo, reagindo com o
fator de coagulao do plasma, CRF, formando uma substncia semelhante, mas no
idntica, trombina, que converte fibrinognio em fibrina. Para o teste, utiliza-se
plasma citratado humano ou de coelho, estril, diludo em soluo salina na proporo
de 1:5. a reao ocorre volume a volume a 37C.
Estudos recentes demonstraram que a produo da enzima coagulase se intensifica
quando o microorganismo crescido e meio contendo alta concentrao de NaCl. Desta
forma, aconselha-se a utilizao de colnias para a prova, crescidas em Agar Manita
(Agar Manitol Salgado) contendo NaCl e Vermelho de Fenol. Este procedimento
aumentaria a sensibilidade do teste.
24
S. aureus
+
+
+/+
R
S. epidermidis
+
S
+
S. sapophyticus
+
R
-
Streptococcus
25
26
Provas bioqumicas
- Prova da optoquina:
Colocar um disco de optoquina na superfcie do Agar Sangue (pode-se incluir no
antibiograma). Havendo impedimento do crescimento das colnias ao redor do disco de
optoquina (2 cm de dimetro), trata-se de teste positivo.
27
- Bile solubilidade:
A prova realizada conforme esquema que se segue:
a 1,0 ml de cultura em calo, adicionar uma gota de vermelho de fenol;
acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rsea);
adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sdio ou blis;
incubar juntamente com o tubo sem blis a 37C por 3 horas.
* clareamento: positivo
* inalterado: negativo
- Bacitracina:
Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,04 U) colocados na superfcie do
meio de cultura semeado com o microorganismo em estudo (pode-se incluir no
antibiograma) e incubar a 37C por 24 horas em microaerofilia.
* Grupo A: sensvel a bacitracina
* demais grupos: resistentes
- Crescimento a 56C:
Para evitar dvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis),
submeter a cultura a um aquecimento a 56C por 30 minutos. Somente os enterococos
resistem a este tratamento.
- Crescimento em Agar Chapman:
Os enterococos toleram altas concentraes de NaCl, como acontecem com
Staphylococcus.
- Crescimento em Agar EMB:
Os enterococos suportam a presena de corantes, como o azul de metileno
OBJETIVOS:
1. Isolamento de bactrias das vias areas superiores.
2. Identificao bioqumica atravs da interpretao do metabolismo microbiano.
MATERIAL:
- cultura de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis
1a aula: swabs estreis, tubo com soluo salina, Agar Chapman, Meio de
Tioglicolato (ou de Hitchens-Pike).
2a aula: Agar sangue, Caldo simples ou BHI, Agar inclinado, Agar DNAse,
dessecador com vela.
3a aula: reativo para catalase (H2O2), reativo para DNAse (HCl 1N), reativo
para coagulase (plasma sangneo), tubo controle positivo, lminas e
conjunto de colorao de Gram.
PRTICA PARA EXECUTAR
1 DIA:
a.
28
b.
c.
2 DIA:
a.
semear material do crescimento em Tioglicolato em placa de Agar Sangue, pela
tcnica de esgotamento e incubar em microaerofilia pela tcnica da vela.
b.
inocular a UFC tpica de Staphylococcus nas provas bioqumicas (catalase,
coagulase e DNAse)
c.
realizar a colorao de Gram
3 DIA:
a.
d.
Importncia da Aula:
de suma importncia para o profissional farmacutico o conhecimento dos
cocos Gram positivos, pois eles so responsveis por diversas infeces humanas.
Staphylococcus aureus (o + importante representante) causa abcessos,
endocardites e osteomielites, intoxicao alimentar e sndrome do choque txico. S.
epidermidis pode causar endocardites e S. saprophyticus causa infeces do trato
urinrio.
Os estreptococos produzem uma grande variedade de infeces como faringite e
infeces celulares septicemia (Streptococcus agalactiae causa infeco urinria em
gestantes). Tb podem causar desordens imunolgicas como febre reumtica e
glomerulonefrite aguda (causada por Streptococcus pyogenes).
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ASSUNTO 8:
- Colimetria.
INTRODUO
A gua elemento fundamental para a sobrevivncia humana. Sua grande
utilizao no abastecimento pblico, na recreao, na industria, no uso domestico atesta
essa importncia vital.
As guas para abastecimento podem ser poludas por servir de reservatrio para
espcies microbianas patognicas e permitir a sobrevivncia das mesmas, e
reconhecida desde os primrdios da civilizao. Vrias doenas podem ser veiculadas
pela gua, tais como clera, febre tifide, disenterias, leptospirose, tuberculose, hepatite,
poliomielite, doenas parasitrias e fngicas. Essas doenas so resultantes da ingesto
de gua e alimentos contaminados ou do emprego de gua poluda pela irrigao, pesca,
lazer, piscicultura, cultura de marisco.
Em cidades onde existe um sistema eficiente de esgotamento sanitrio, o esgoto
domstico um dos principais responsveis pela poluio das guas, estimulando o
crescimento de microrganismo. A assimilao destes contaminantes orgnicos
biodegradveis realizada com o concurso de bactrias presentes, por meio de um
processo, que consome o oxignio dissolvido na gua dos rios ou reservatrios. Quando
a carga de matria orgnica biodegradvel presente na gua, e o OD (Oxignio
Dissolvido), que mede a concentrao de oxignio disperso na gua (Soares, 1999).
Alm dos esgotos domsticos, os efluentes industriais e o escoamento superficial
urbano contribuem grandemente na poluio dos corpos dgua. Os efluentes industriais
contem grandes nmeros ou metais pesados. O escoamento superficial urbano contm
todos os poluentes que se depositam na superfcie do solo na ausncia de chuvas, como
lixo e matria orgnica. Estes acumulados no solo, valas e bueiros so arrastos quando
da estao chuvosa para os cursos dgua superficiais, constituindo-se numa outra fonte
de poluio (Soares, 1999).
Os microrganismos dotados de potencial patognico chegam s extenses
hdricas procedentes das excrees intestinais do homem e de outros animais. Embora j
existam mtodos desenvolvidos para a deteco de vrios organismos patognicos de
veiculao hdrica, os mesmos no so aplicveis na rotina devido ao alto custo e
necessidade de pessoal especializado (CETESB, 1993).
Uma alternativa para a avaliao da qualidade sanitria da gua a pesquisa de
organismo no patognicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de
sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrncia de contaminao fecal,
evidenciando o risco da presena de patgenos. Fezes humanas contm de 20-30 % de
resduos alimentares no digeridos, sendo o restante constitudo de gua e bactrias. NO
indivduo saudvel essas bactrias constituem os habitantes normais do intestinos onde
a Escherichia coli a representante caracterstica. O nmero desses microrganismos
pode atingir XXXXclulas/g de fezes. Assim a presena da Escherichia coli em
alimentos e gua indicativo de contaminao fecal e possibilidade de presena de
patgenos entricos.
Microrganismos indicadores de poluio de gua so utilizados para monitorar,
classificar e restringir o uso das guas. Um indicador ideal deveria preencher os
seguintes critrios: 1. Ser aplicvel a todo tipo de gua; 2. Estar presente
simultaneamente com os microrganismos patognicos, com um tempo de sobrevivncia
igual quele patgeno entrico mais resistente; 3. No se reproduzir em guas
contaminadas, para no resultar em valores aumentados ( HAGLER E MENDONAHAGLER, 1998 ).
30
31
d. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da gua para criar um
espao de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.
3. Rios, Lagoas e Mares
a. Coleta da amostra de gua de rios e lagoas nestes casos deve-se mergulhar o frasco
at uma profundidade de 20cm, com abertura voltada em direo contrria a corrente, a
fim de evitar a contaminao da gua com as mos.
b. Coleta da gua do mar a coleta deve ser feita na regio onde as pessoas costumam
banhar-se, que corresponde profundidade aproximadamente de 1,0 m, que a regio
das praias mais utilizada para a recreao de contato primrio, na mar baixa e 24 horas
sem chuvas.
ACONDICIONAMENTO E TRANSPORTE DA AMOSTRA PARA O
LABORATORIO
O ideal a anlise iniciar-se at 1 hora aps a coleta. Caso isto seja impossvel, a
amostra deve ser transportada sob refrigerao. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10
graus Celsius no prazo mximo de at 30 horas aps a coleta.
Amostras presumivelmente poludas tm de ser inoculadas no mximo aps 6
horas da coleta.
Entre o recebimento da amostra e o inicio da inoculao, a mesma deve ser mantida em
geladeira (cerca de 5 graus Celsius).
EXAMES BACTERIOLGICOS DA GUA
O exame bacteriolgico da gua feito atravs de dois processos: Contagem de
bactrias heterotrficas viveis na gua e determinao ou estimativa do nmero de
bactrias coliformes.
A metodologia padro empregada no exame bacteriolgico da gua, para medida
do grupo coliforme, inclui dois procedimentos: a tcnica dos tubos mltiplos e a tcnica
da membrana filtrante (Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater -APHA, 1980).
A. Determinao de coliformes pela tcnica dos tubos mltiplos
NMERO MAIS PROVVEL (NMP)
A tcnica do nmero mais provvel consiste no exame de uma srie de tubos
onde foram inoculados volumes diferentes de amostra.
O valor obtido resulta da consulta da tabela que foram estimuladas com base em
frmulas de probabilidade. Consideraes tericas e determinaes repetidas em grande
escala indicam que este tipo de tcnica tende a fornecer valores mais elevados do que o
nmero real. As disparidades tendem a diminuir quando se adota sries com maior
nmero de tubos em cada diluio. Portanto, a sensibilidade do teste depende do
nmero de tubos adotados.
Existem vrias tabelas de NMP e a escolha da srie a ser adotada funo das
caractersticas microbiolgicas da amostra.
32
b.
33
3
3
3
3
3
3
3
3
3
1
1
2
2
2
3
3
3
3
1
2
0
1
2
0
1
2
3
75
120
93
150
210
240
460
1100
2400
34
Teste complemento
A partir dos tubos positivos de caldo blis verde brilhante, semear por estrias em
placa contendo endo agar ou azul de metileno agar (agar EMB). Incubar a 35 0,5C
por 24 2 horas.
Colnias tpicas: Meio endo agar - colnias vermelhas
Meio agar EMB - colnias verdes com centro escuro.
De cada placa, escolher uma ou mais colnias tpicas e bem isoladas; transferir
cada colnia para tubos contendo caldo de lactose ou caldo lauril triptose e para um
tubo inclinado de agar nutriente. Incubar a 35 0,5C por 24 horas, prosseguindo a
incubao at 48 3 horas caso no tenha ocorrido formao de gs aps a primeira
incubao.
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ASSUNTO 9:
- Provas Bioqumicas para a Identificao de Bacilos Gram-negativos
OBJETIVO
Identificar enterobactria em gneros ou espcies, utilizando-se para isso vrios
meios de cultura especiais, de acordo co o esquema a seguir:
1. Plaqueamento Seletivo
Etapa de isolamento bacteriano a partir de espcies clnico, utilizando meios
seletivo-indicadores como o Agar EMB. Neste meio as bactrias Gram positivas so
inibidas pela presena de eosina e azul de metileno. As bactrias Gram negativas
fermentadoras de lactose ( LAC + ) apresentam-se como colnias rosa-avermelhadas
com ou sem centro negro, enquanto as no-fermentadoras ( LAC - ) formam colnias
transparentes.
Plaqueamento Seletivo - Agar EMB6.
2. Triagem
Conjunto de provas bioqumicas realizadas simultaneamente em 1 ou 2 meios,
permitindo uma diferenciao inicial dos isolamentos e direcionamento da
contaminao bioqumica. Quando realizada em meio TSI, podemos observar:
- Fermentao de glicose e produo de gs
- Fermentao de lactose e/ou sacarose
- Produo de H2S
Bactrias que utilizam apenas glicose provocam acidificao (de colorao
amarela) apenas na base, permanecendo o pice alcalino (de cor avermelhada).
Bactrias fermentadoras de lactose e/ou sacarose acidificam todo o meio. A formao
de gs evidenciada pelo rompimento ou descolamento do meio. A produo de H2S se
manifesta pelo escurecimento do meio.
37
3. Confirmao Bioqumica
Conjunto de provas necessrias para a identificao bioqumica das colnias
suspeitas. Algumas dessas provas esto descritas abaixo:
a. Fermentao de Carboidratos: glicose, lactose, manitol, sacarose.
A utilizao dos carboidratos leva formao de cidos, com viragem do indicador
(vermelho de fenol) para cor amarela. A partir da glicose podemos observar tambm a
produo ou no de gs (CO2, H2) no interior do tubo de Durham.
A inoculao realizada a partir de cultura bacteriana overnight (+/- 18h) em
Agar. Incubar por 24 horas a 37C.
Leitura: cor amarelada = + (positivo)
sem alterao = - (negativo)
Fermentao de Carboidratos7
38
39
E. coli
Salmonella
Klebsiella
Proteus
EMB
Lac +
Lac Lac +
Lac
TSI
c/c
alc/c
ac/ac
lc/c ou ac/ac
H2S
+
+
Glicose
+
+
+
+
Gs
+
+
+
+
Lactose
+
+
Sacarose
V
+
V
Manitol
+
+
+
V
VM
+
+
+
+
VP
Citrato
V
+ (5 dias)
Indol
+
V
Mobilidade
V
+
+
Nitrato
+
+
+
+
Uria
V
+
Tabela 1 Identificao bioqumica de alguns gneros de enterobactrias.
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40
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ASSUNTO 10:
- Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA)
Mtodo de Kirby-Bauer
OBJETIVOS:
1. Determinar a sensibilidade de uma bactria frente a antimicrobianos, para a escolha
da droga mais adequada no tratamento de uma doena.
2. Interpretar um antibiograma.
MATERIAL:
- cultura recente do microorganismo em teste
- discos com antimicrobianos
- placas com Agar Mueller-Hinton
- swabs estreis
- pinas, rgua graduada
PRTICA PARA EXECUTAR:
1. Inculo:
Cultura pura, em fase log, padronizado, diluda at obteno de turvao semelhante ao
tubo n 0,5 da escala de McFarlnd (1,0x108)
2. Meio
Mueller-Hinton, recente, em camada de 4 5 mm, pH = 7,2 7,4, com umidade
adequada. Em alguns casos pode ser enriquecido com 5% de sangue, etc.
3. Semeadura
Inocular a cultura a ser testada na superfcie do agar, com o auxlio de um swab, para
um crescimento confluente (1).
4. Antimicrobianos
Com o auxlio de uma pina flambada, aplicar os discos com antimicrobianos sobre o
meio recm-semeado de modo eqidistante (3).
Identificar a placa e incubar a 37C por 18 24 horas em posio invertida.
Ocorrer difuso das substncias e suas concentraes diminuem gradativamente a
medida que se afastam do disco.
A eficincia de uma droga demonstrada pelo aparecimento de um halo de inibio do
crescimento do microorganismo.
5. Leitura
Com o auxlio de uma rgua graduada, medir o dimetro dos halos de inibio,
incluindo o dimetro do disco (4).
42
Potncia
0,01 mg
0,03 mg
0,03 mg
0,03 mg
Cefalotina
Polimixina
Sulfazotrim
14
8
10
15 17
09 11
11 15
18
12
16
Notas:
1. leituras de 4 e 6 horas podero ser feitas em caso de emergncia, mas leituras
definitivas devero ser feitas somente aps o tempo estipulado (18 24 horas)
2. No usar sinais para expressar os resultados. Usar as letras S para os
microorganismos sensveis e R para os microorganismos resistentes.
3. Lembrar que um halo de inibio maior que outro no indica propriamente uma
maior atividade do antibacteriano sobre o microorganismo em teste. Outros fatores,
como carga antibitica, difusibilidade, etc., intervm na formao dos halos. Portanto,
deve ser utilizada a tabela na interpretao dos resultados.
4. Atualmente, no intuito de minimizar erros de interpretao, considera-se a
sensibilidade intermediria como resistente.
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44
ANEXO I
TCNICAS DE COLORAO
A utilizao de corantes em microbiologia atribuda a Goeppert e Cohn (1849).
Os corantes empregados, geralmente derivados da anilina, tm frmula
quimicamente complexa, e so obtidos por sntese; quase sempre so sais de potssio ou
de sdio, sendo classificados em: naturais, entre os quais podemos citar o carmim e a
hematoxilina, e artificiais, que se dividem em: bsicos ou nucleares, cidos ou
citoplasmticos e neutros.
As clulas bacterianas so ricas em cido nuclico, conduzindo cargas negativas
sob a forma de grupamentos fosfato, e estes se combinam com os corantes bsicos, que
so carregados positivamente. Os corantes cidos no coram as clulas bacterianas, e
por isso podem ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor contrastante.
As solues corantes so classificadas quanto ao veculo nos seguintes grupos:
solues aquosas, solues hidroalcolicas e solues hidroalcolicas mordentes.
Utilizam-se as solues aquosas quando se quer preservar a vitalidade dos
microorganismos. A adio de substncias mordentes tem a vantagem de preserv-las
da contaminao mais ou menos estvel entre ambas, como exemplos de substncias
que funcionam como mordentes citamos o fenol, iodo, formol e tanino.
As coloraes podem ser simples, quando utilizamos um s corante, duplas e
mistas. Assim podemos ter uma noo da morfologia dos germes utilizando uma
colorao simples, e de outras informaes com o emprego de tcnicas especiais de
colorao, como por exemplo para diferenciar flagelos, cpsulas, paredes celulares,
membranas celulares, grnulos, ncleos e esporos.
I.
45
OBJETIVOS
1. Avaliao da importncia taxonmica do mtodo de Gram;
2. Interpretao da ao e funo dos reagentes.
Tcnica:
A. Preparao do esfregao:
Lmina nova ou estocada em lcool.
Flambar no bico de Bunsen.
Deixar esfriar.
46
D. Interpretao de resultados:
Solues reagentes:
1. Cristal violeta:
- Cristal violeta
- lcool a 95
- gua
1,0g
10mL
100mL
47
2. Lugol:
- Iodo
- Iodeto de potssio
- gua
1,0g
10mL
300mL
3. Fucsina:
- Fucsina bsica
- Fenol
- lcool a 95
- gua
0,3g
5,0g
10mL
100mL
Dever ser diluda 1:10 para ser utilizada no mtodo de Gram. Existem vrias
modificaes introduzidas no mtodo visando melhora-lo, uma das utilizadas a de
Kopeloff-Beermann. Com adio de bicarbonato de sdio soluo de cristal violeta e a
substituio da soluo de fucsina por safranina. As principais vantagens deste mtodo
modificado: no iro sofrer interferncia de pH (como a acidez do pus) e, preservar as
bactrias G+ que se descoram facilmente (Gram lbeis).
4. lcool-acetona proporo 1:1.
II. TCNICAS DE COLORAO ZIEHL-NEELSEN
As micobactrias constituem um grupo que causa doenas no homem e nos
animais superiores. No homem essas doenas variam de infeces superficiais at a
tuberculose. Atualmente, constituem um dos maiores problemas em pases
desenvolvidos, podendo causar, alm da tuberculose bovina, a Doena de Johne e
doenas em roedores, rpteis, peixes e galinhas.
As micobactrias so microorganismos encontrados com facilidade no meio ambiente,
com exceo do Mycobacterium tuberculosis e M. leprae. Pertencem ao gnero
Mycobacterium e se apresentam como bacilos longos, delgados, retos ou ligeiramente
encurvados, imveis e aerbios. So bacilos lcool-cido resistentes (BAARs)
apresentam crescimento lento e alto contedo lipdico na parede celular. Algumas
espcies podem crescer em meios simples, mas em geral, os meios so complexos,
como o de Lowenstein Jensen, apresentando crescimento macroscpico aps 3 a 4
semanas de incubao 37 C. Neste gnero, duas espcies produzem doenas
importantes: Mycobacterium tuberculosis e M. leprae, as demais so denominadas
atpicas e divididas em 4 grupos (grupos de Runyon I, II, III e IV).
M. tuberculosis o agente etiolgico da tuberculose, esta pode se apresentar em
diversas formas clnicas, sendo a mais comum a pulmonar (cerca de 80%), a nica
forma clnica contagiosa. O teste confirmativo para diagnstico da tuberculose a
demonstrao do M. tuberculosis em material clnico colhido do paciente suspeito,
atravs de baciloscopia pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen ou cultura em meios apropriados
(diagnstico bacteriolgico).
M. leprae o agente etiolgico da hansenase, uma doena que se caracteriza por
leses da pele, mucosas e nervos perifricos. So BAARs semelhantes ao M.
tuberculosis e caracterizam-se pela disposio em feixes ou globias. At o momento no
48
49
50
51
Microscpio ptico(M.O.)
M.O. + condensador
Lminas
Reagentes Fontana-Tribondeau
SWAB
lcool
leo de cedro
Soluo salina
Culturas em meios lquidos e slidos
Exsudato positivo
Resultado: num campo escuro as espiroquetas aparecem claras.
1,0 mL
2,0 mL
100 mL
1,0 g
5,0 g
52
- gua
100 ml
TCNICA:
1. Preparao do esfregao
a.
n.
o.
p.
q.
r.
Solues reagentes:
1. Soluo de Albert-Laybourn
- azul de toluidina
- verde malaquita
- cido actico glacial
- lcool 95%
- gua destilada
2. Soluo de lugol Forte
- iodo metlico
- iodeto de potssio
- gua destilada
0,15g
0,20g
1,00ml
2,00ml
100ml
2,0g
3,0g
300ml
53
Referncias Bibliogrficas:
1. Bazzo, G. C., Pezzini, P. R., Ztola, M.Nunes G. C., Peters, E. A importncia da
avaliao da qualidade microbiolgica de matrias-primas utilizadas em farmcias
magistrais. Disponvel em www.anfarmag.org.br, Seo: Encarte Tcnico. Acessado em
20/11/2007.
2. Brown, A. E. Benson. Microbiological Applications Laboratory Manual in General
Microbiology. 8th Edition. The McGrawHillCompanies, 2001.
3. Sebenta das aulas prticas de microbiologia e parasitologia. Faculdade de Medicina.
Coimbra, 2005-2006.
4. Lerner, K L., Lerner, B. W. World of Microbiology and Immunology. Volumes 1 e 2.
Gale, 2003.
5. Harley, J. P. Prescott, L. M. Laboratory Exercises in Microbiology 5th Edition. The
McGrawHillCompanies, 2002.
6. http://www.mc.maricopa.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/emb.html, acessado em
22/11/2007.
7. http://biology.fullerton.edu/biol302/302labf99/biochem.html, acessado em
22/11/2007.
54