Conventional and Real-Time PCR-Based Assay for Detecting

Pathogenic Alternaria brassicae in Cruciferous Seed

Thomas Guillemette, UMR 77 Pathologie Vgtale, Facult des Sciences, Angers, France; Batrice
Iacomi- Vasilescu, UMR 77 Pathologie Vgtale, France, and USAMV, Department of Plant Protection, Bucharest,
Romania; and Philippe Simoneau, UMR 77 Pathologie Vgtale, France
ABSTRACT
Guillemette, T., Iacomi-Vasilescu, B., and Simoneau, P. 2004. Conventional and real-time PCR- based assay for detecting pathogenic Alternaria
brassicae in cruciferous seed. Plant Dis. 88:490496.
Alternaria brassicae is an important seedborne pathogenic fungus responsible for the black spot disease of crucifers. Sanitary control of commercial
seed is necessary to limit the spread of this pathogen. Current detection methods, based on culture and morphological identification of the fungus, are
time consuming, laborious, and not always reliable. Therefore, a polymerase chain reaction (PCR)-based assay was developed with A. brassicaespecific primers designed on the basis of the sequence of two clustered genes potentially involved in pathogenicity. Two sets of primers were
selected for conventional and real-time PCR, respectively. In both cases, A. brassi- cae was specifically detected using DNA extracted from seed.
The real-time PCR-based method presented here can be automated easily and preliminary results indicate that it is e fficient for quantitative estimation
of seed infection.
Additional keywords: ABC transporter, molecular diagnostic, nonribosomal peptide synthase

seed (1), thus complicating pathogen iden- tification. Some isolates sporulate sparsely or produce sterile mycelium under labora- tory
conditions. Morphological identifica- tion is impossible when this occurs.
Molecular approaches, mainly the poly- merase chain reaction (PCR), frequently h ave been used as tools for the detection of numerous
fungal pathogens (4,14,17). A sensitive and rapid PCR assay, based on amplification of sequences of the internal transcribed spacer (ITS)
regions of the ribosomal DNA, recently was developed to detect A. brassicicola or A. japonica infec- tion of cruciferous seed (8).
Unfortunately, this method did not generate a reliable diagnosis when seed were contaminated
with A. brassicae because cross-reactions
with other fungal species sometimes were
observed.
The genus Alternaria comprises saprophytic and pathogenic species of filamen- tous fungi. Plant pathogens of this genus have a distinct and limited host range. It has been
strongly suggested that both viru- lence and host specificity are partly de- pendent on the production of host-specific toxins (HSTs; 18,27). A
complex of three species, A. brassicae, A. brassicicola, and A. japonica (formerly named A. raphani), is responsible for the black spot
disease of crucifers and is transmitted by seed of many species belonging to the genera Brassica and Raphanus. The disease is of major
importance in cultivated crucifers worldwide, with most commercial culti- vars being susceptible (25). It occurs at all host plant growth
stages, on aerial parts, and is identifiable by black lesions, often surrounded by chlorotic zones (26). The disease also can be destructive
for seed producers because infection often leads to premature pod shatter and shriveled seed, with altered germination efficiency, as
noted in various crucifer hosts such as Brassica juncea, B. campestris, and B. rapa (20,21). Black spot disease results in
a serious reduction of crop yields, such as reduced market quality of cauliflower heads and oil quality in family Brassicaceae oilseed
species. The fungi overwinter on infected crop residues, seed, and any related cruciferous weed species. They can be seedborne via mycelia
within the seed or transitory spores on the seed surface. Spores are readily windborne and can be dispersed great distances through- out the
growing season.
Common practices to prevent the dis- ease do not always provide satisfactory control of infection. Genetic control could be the most
effective strategy, but most commercially available cultivars show little resistance to the pathogen. Black spot disease could be controlled
with fungi- cides, but field isolates of A. brassicicola expressing cross-resistance to common broad-spectrum fungicides recently were
identified in France (7). Rotations with noncruciferous crops, crop residue destruc- tion, and weed control also can help to reduce the incidence
of this disease. More- over, the use of pathogen-free seed is es- sential to limit the spread and incidence of the disease. The current routine
technique used to assess levels of pathogenic Alter- naria spp. contamination in cruciferous seed is based on the culture of the seedborne fungi
on nutritive media and further morphological characterization. This is a time-consuming process, whereby it ta kes at least 1 week to obtain a
diagnos- tic result. Accurate diagnosis is not easy because numerous saprophytic Alternaria spp. commonly are found on cruciferous
Johnson et al. (10) recently described the use of a PCR-based technique using primers designed from a gene i nvolved in pathogenicity
(synthesis of the host-spe- cific AM-toxin) to specifically detect A. alternata apple pathotypes among Alter- naria field isolates. Host
specificitytypi- cal of several pathogenic Alternaria spp. is dependent mainly on toxin production; therefore, effective molecular probes
could be developed for diagnostic techniques by cloning genes involved in virulence.
In the present study, we developed PCR assays for detecting A. brassicae in seed batches. These methods used oligonucleo- tides
complementary to sequences located on a cluster of genes that may be required for the pathogenicity of the fungus. The specificity and
suitability of the designed primers were tested using standard and real-time PCR.
MATERIALS AND METHODS
Fungal strains and culture conditions. Isolates of Alternaria spp. and other gen- era (Table 1) were recovered from seed. Cultures were
grown and maintained in petri dishes on potato dextrose agar. Alternaria isolates were identified on the basis of morphology criteria (11,16).
Iden- tifications then were confirmed by PCR using specific ITS primer pairs (8) for Alternaria spp. pathogenic to crucifers.
Preparation of seed samples. Seed samples were prepared from contaminated seed of radish and cabbage as described by IacomiVasilescu et al. (8). For artificial contaminations, seed were disinfected with

490

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1% sodium hypochlorite, rinsed with ster- ile water, soaked for 1 h in a calibrated spore suspension (10 6 spores/ml), and dried at room
temperature on sterile filter paper. Disinfection and inoculation accu- racy was confirmed by placing 20 seed on the surface of malt-agar
plates for 1 week at 25C. Seed batches showing 0% (disin- fected seed) or 100% (inoculated seed) infection were selected and mi xed
together to prepare seed samples with different levels of contamination (0, 5, 10, 50, and
100%). Samples were produced by placing
20 seed (artificially contaminated) or 100 seed (naturally contaminated) in a sterile tube and covering them with 0.5 and 3 ml, respectively, of
liquid culture MDP medium (2% malt extract, 2% dextrose, 0.1% pep- tone). The tubes were incubated at 25C for
48 h with occasional shaking. This incuba- tion step is an enrichment phase that allows an optimal increase of the fungal biomass from seed.
The tubes then were vortexed briefly to separate mycelia and conidia from seed. The seed were discarded and the fun- gal structures were
collected on mi- crocentrifuge filters (pore size: 0.45 m; Ultrafree-Mc Millipore, Bedford, MA) by centrifugation at 5,000 g for 10 min.
DNA manipulation. DNA was ex- tracted from fungal mycelia and conidia harvested by scraping the surface of petri plate cultures
(extraction from fungal cul- tures) or collected on microcentrifuge filters (extraction from seed samples). Nucleic acids were isolated
according to the microwave miniprep procedure de- scribed by Goodwin and Lee (6). Alterna- tively, DNA was extracted using the Nucleospin Food kit (Macherey-Nagel, Dren, Germany) according to the manu- facturers instructions.
PCR-based assay. Specific oligonu- cleotides ABCsens (5-CTGGTGAAA- AGGTTGCGATCGT-3) and ABCrev (5GTGACTTTCATGAAATGACATTGATG3), complementary to the 3 end of open reading frame (ORF)2, and 115sens (5- AACCCTATAGACCCACGTCGACTA-3) and 115rev (5GATGGTACGCAAGGC- TTGGT-3), complementary to a portion of ORF1, were designed for the standard and real-time PCR assays,
respectively, using the appropriate software (Primer 3 online and ABI PRISM Primer Express). The two ORFs were deduced from the
nucleotide sequence of an A. brassicae genomic DNA fragment identified after screening a cosmid library with a probe corresponding to a portion of the nonribosomal peptide syn- thase (NRPS) gene. In order to test the specificity of
the primer pairs against A. brassicae isolates, amplifications were performed using DNA extracted from pure fungal cultures from a range of
Alternaria spp. and other fungi isolated from seed. Then the PCR procedure was applied to detect seed contamination. The universal
primer pair ITS1/ITS2 (28) was used as a positive control to assess the quality of the extracted DNA. Conventional PCR was performed
using 2 l of undiluted DNA preparations under the following condi- tions: Tris-HCl, pH 9.0, 20 mM (NH4)2SO4, 0.01% (wt/vol)
Tween 20, 1.5 mM MgCl2, 200 M each deoxyribonu- cleotide triphosphate, and 1 unit of ther- mostable DNA polymerase (Goldstar Red
DNA polymerase, Eurogentec, Seraing, Belgium). A Thermojet thermocycler (Equibio, Seraing, Belgium) was used with an initial step of 3
min at 95C; followed by 35 cycles of 30 s at 95C, 50 s at 60C, and 1 min at 72C; and a final step of 10 min at 72C. The amplification
results were visualized after electrophoresis of an aliquot (10 l) of the reaction mixture on a

Fig. 1. Gel electrophoresis of polymerase chain reaction products obtained with internal transcribed spacer (ITS) 1/2 universal primers and with

ABCsens/rev diagnostic primers. DNA was extracted from pure Alternaria brassicae cultures or from radish seed infected with A. brassicae, using the Nucleospin Food kit. Lanes M were loaded with a DNA ladder (SmartLadder Classic, Eurogentec, Seraing, Belgium).
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1.2% agarose gel. The real-time PCR reac- tions were carried out in a 25-l final vol- ume containing: 2.5 l of DNA, 12.5 l of SYBR
Green PCR Master Mix 2X (Ap- plied Biosystems, Courtaboeuf, France),
300 nM forward and reverse primers and H2O up to 25 l. An ABI PRISM 700 Se- quence Detection System (Applied Biosys- tems) was
used with the following steps: 2 min at 50C, 10 min at 95C, and 40 cy- cles consisting in one step at 95C for 15 s foll owed by one step at
60C for 1 min. Nucleic acids were quantified in unknown samples by direct comparison to a stan- dard. The DNA used as standard was
ex- tracted from fungal cultures, with the con- centration measured by fluorometric assay (Turner Design Inst. 700, Sunnyvale, CA) before
dilution.
RESULTS
Selection of the diagnostic PCR prim- ers. Bacterial and fungal genes involved in toxin production have been used success- fully to
develop molecular diagnostic tools (10). Therefore, primer pairs were de- signed on the basis of the nucleotide se- quence of a potential
pathogenic cluster of two A. brassicae genes encoding an NRPS and an ATP-binding cassette (ABC) trans- porter. These genes putatively
are involved in the synthesis and excretion of a toxic peptide metabolite produced by A. brassi- cae and, thus, may be suitable targets for
PCR-based detection of this pathogen. We
expected to find homologous genes in related pathogenic Alternaria spp.; there- fore, PCR screening of the A. japonica and A. brassicicola
genomes was performed using primers that span the A. brassicae gene cluster. This preliminary approach revealed that the two A. brassicae
ORFs have counterparts on the genome of other Alternaria spp. pathogenic to crucifers (data not shown). However, the central part and 3 end
of the NRPS and ABC trans- porter, respectively, were found to be less conserved among the three species. There- fore, we focused on these
regions to select primers for specific detection of A. brassi- cae. Two primer pairs were designed: one for standard PCR assays, called ABCsens/ABCrev, located near the 3 end of the ABC transporter gene coding se- quence; and one for real-time PCR assays, called
115sens/115rev, located at ap- proximately 10 kb of the NRPS gene start codon.
DNA extraction from seed. DNA was extracted routinely from fungal mycelia in pure cultures or from seed samples using a standard
miniprep procedure. This tech- nique involved lysis at high temperature in a detergent-containing buffer, extraction with organic solvents, and
nucleic acid precipitation in the presence of alcohol. However, alternative extraction procedures using commercial kits were tested with the aim
of designing a simple and safe diag- nostic assay that could be automated to
process numerous samples. The Nucleo- spin Food kit was found to be the most efficient. Irrespective of the method used for isolating
nucleic acids (i.e., from pure fungal cultures or seed samples), similar amplification patterns were obtained with both universal and specific
primer pairs (Fig. 1). The DNA obtained with the Nu- cleospin Food kit also was tested successfully as template for real-time PCR
(described below).
Specificity of the selected PCR prim- ers. To test the specificity toward A. bras- sicae isolates, ABCsens/rev primers were first used in a
PCR reaction with genomic DNA extracted from mycelial pure cultures of different fungal isolates (Table 1). These were selected to
represent a range of fungi commonly found on cruciferous seed, including the three pathogenic Alternaria spp. A. brassicicola (five isolates),
A. ja- ponica (five isolates), and A. brassicae (five isolates), as well as saprophytic A. alternata isolates (two isolates), and iso- lates of
Fusarium spp. (two isolates), Peni- cillium spp., Aspergillus spp., and Phoma spp. (one isolate each). Another seedborne Alternaria sp. (A.
dauci) and isolates from the closely related genera Ulocladium and Stemphylium also were tested, along with one Botrytis cinerea strain
isolated from sunflower seeds. A representative sample gel is shown in Figure 2. After optimisa- tion of the cycling parameters, PCR products of the expected size (780 bp) were obtained from A. brassicae isolates only. No cross hybridization was observed with
Table 1. Names and origins of species and isolates used in the present study
Detection by
Origin

conv-PCRa

Species

Isolate no.

Q-PCRb

Alternaria brassicae
Bre14
Radish seed
+
+ A. brassicae
Bre16
Radish
seed
+
+ A. brassicae
Bre39
Radish seed
+
+ A. brassicae
Bre103
Radish seed
+
+ A. brassicae
Bre112
Radish seed
+
+ A. brassicicola
Bra3
Radish seed

A. brassicicola
Bra18
Radish seed

A. brassicicola
Bra40
Radish seed

A.
brassicicola
Bra41
Radish seed

A. brassicicola
Bra43
Radish
seed

A. japonica
Jap4
Radish seed

A. japonica
Jap19
Radish seed

A. japonica
Jap52
Radish seed

A. japonica
Jap63
Radish seed

A. japonica
Jap108
Radish seed

A. alternata
Alt62
Radish seed

A. alternata
R7404
Cabbage seed

A . dauci
R9228
Cress seed

nt

other cruciferous pathogenic Alternaria

2A and 2B), with nonpathogenic A. alter- nata or other tested fungi (Fig. 2C). Sig- nals were obtained with all tested fungi when the
universal ITS1-ITS2 primer pair was used as a control of DNA quality (data not shown).
The specificity of the real-time PCR primers was checked using 100 pg of DNA extracted from pure cultures of fungi listed in Table 1. All
of the selected fungi origi- nated from cruciferous seed. No increasing fluorescent signal exceeding the back- ground fluorescence (baseline
threshold) was observed except when A. brassicae DNA was used as template. In that case, standard fluorescent amplification curves
representing an exponential growth of PCR products were recorded and a mean 26.65
Stemphylium botryosum
Cabbage seed

sp.
Fu6

Phoma sp.
Cabbage seed

C27381
Cabbage seed

S. botryosum
Botrytis cinerea
BC40
Sunflower seed

Radish seed

Fusarium sp.
Fu7
Pho1
Radish seed

Penicillium sp.
Aspergillus sp.
A2
Cabbage seed

R7410
nt Fusarium
Radish seed
P1

Verticillium sp.
a
b

V1

Tomato seed

nt

conv-PCR refers to conventional polymerase chain reaction (PCR) with the ABCsens-ABCrev primer set.
Q-PCR refers to real-time PCR with the 115sens-115rev primer set; + = amplification, = no ampli- fication, and nt = not tested.

temperature profiles of the PCR products at the end of the cycling reactions were determined with samples containing A. brassicae DNA.
A single dissociation peak of increased fluorescence was obtained for the specific 115sens-115rev primer at a melting temperature of 83 to
84C (data not shown). This indicated that the specific amplification obtained did not involve cross hybridization with other A.
brassi- cae-related sequences or the formation of primer dimers.
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PCR detection in seed samples. In a preliminary experiment, the PCR detection test was applied to radish and cabbage seed batches
artificially contaminated with A. brassicae (isolate Bre112). DNA was extracted from the different seed samples and used as a template in
PCR experiments with either the ABCsens-ABCrev primer pair (standard assays) or the 115sens115rev primer pair (real-time PCR). In the latter case, parallel experiments with serial dilutions of a calibrated A. brassicae DNA extract
were carried out. A. brassicae was detected using the conventional PCR pro- cedure in all contaminated seed batches (Fig. 3), even at
contamination levels as low as 5% (Fig. 3B). As expected, a sig- nal also was observed with the positive control (DNA extracted from a
mycelial pure culture of the A. brassicae isolate) but not with the negative control (disin- fected seed). Amplifications using the
universal ITS1/ITS2 primer pair were successful with all samples, indicating that the extracted DNA was suitable for PCR (Fig. 3A).
No fungal growth was observed with disinfected seed plated on solid growth medium; therefore, the sig- nal obtained with these seed after
amplifi- cation with the nonspecific primers probably originated from co-extracted host plant DNA.
When real-time PCR was used with se- rial dilutions of an A. brassicae DNA cali- brated extract as template, a standard curve was plotted
using known amounts of A. brassicae DNA against the CT calculated with ABI Prism 7000 sequence detection system (SDS) software (Fig.
4). This curve revealed that the primer set used in this experiment was quite accurate over a linear range of at least 3.5 orders of magnitude
and that the correlations between CT and DNA quantities were high (R2 = 0.986). The mean CT values obtained with 100 and
10% artificially contaminated radish seed batches were 25.56 and 32.55, respec- tively, corresponding to approximately 250 and 3.5 pg of A.
brassicae DNA, respec- tively.
These results were obtained with artifi- cially contaminated seed free of other fun- gal or bacterial contaminations. It was then necessary to
check this molecular diagno- sis approach with cabbage and radish seed naturally contaminated with pathogenic Alternaria spp. Six different
seed lots were tested (Table 2). Infection levels were de- termined on 200 seed using the standard plating technique. Amplifications using the
nonspecific ITS1-ITS2 primer pair were successful with all DNA extracted from samples, indicating that this DNA was suitable for
further amplifications (Fig.
5B). When the ABCsens/rev primer pair
Real-time PCR was carried out with samples prepared with the six radish seed lots. Amplification curves were obtained only with DNA
extracted from lots C to F. Similar CT values (mean: 32.54) were noted for seed lots E and F (Fig. 4). This mean value is close to that
obtained with the 10% artificially contaminated seed batch. The CT value for seed lot C, with an A. brassicae infection level of 2%, was
34.28.
DISCUSSION
Conventional tests used to detect A. brassicae in seed involve a combination of pathogenicity assays and morphological characterization.
However, the drawback of such methods is that accurate pathogen identification can be difficult and time- consuming. Hence, there is an
urgent need for a sensitive and rapid test that could
detect seedborne A. brassicae. With ad- vances in molecular biology, most recently developed techniques for microorganism detection
involve PCR analysis. The ad- vantages of PCR-based assays include specificity, sensitivity, and speed. Hence, such assays have been
designed for the detection of various plant pathogens, in- cluding seedborne fungi (22,24). A few PCR-based methods have already been
reported for the detection of Alternaria spp. on carrot (12,19), linseed (15), and cruciferous (8) seed, as well as in host tissues (15) or food
products (32). The ITS region of nuclear rDNA (8,12,15,32) is the main genomic region targeted for PCR primer development. Recently,
Iacomi- Vasilescu et al. (8) reported a sensitive and rapid PCR diagnostic assay for the identi- fication of A. brassicicola and A. japonica on
cruciferous seed. Nevertheless, the ITS
was used, A. brassicae contaminations up to 3% (seed lot D) were detected (Fig. 5A). No amplification signal was obtained with DNA
extracted from the A, B, and C seed lots.
Fig. 2. Gel electrophoresis of polymerase chain reaction products obtained with the ABCsens/rev
diagnostic primers and DNA extracted from pure cultures of various Alternaria brassicae isolates or from pure cultures of A, A. brassicicola isolates or B, A.
japonica isolates or C, isolates from different fungal species recovered from seed. Numbers above the gels correspond to isolate identification codes as
described in Table 1. M lanes were loaded with a DNA ladder (SmartLadder Classic, Eurogentec, Belgium).
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primers designed in this study for A. bras- sicae were found to be not very specific because amplification signals were consis- tently obtained
with DNA from some A. japonica isolates.
In the present study, we used two primer sets, highly specific to A. brassicae, de- signed from two clustered genes corre- sponding to an
NRPS gene and an ABC transporter gene. These two genes may produce and secrete factors associated with the virulence of the fungal
pathogen (i.e., host-specific peptidic toxins or sideropho- res).
The conventional PCR-based seed assay that we developed specifically detects the presence of A. brassicae in cruciferous seed, even at
infection levels as low as 3% and after only 2 days of incubation. The first major obstacle that we had to over- come was the low levels of
target DNA from the fungi. An incubation of 48 h in MDP liquid nutritive medium was suitable to obtain an optimal increase of the fungal
biomass (8); therefore, the amount of fun- gal genomic DNA recovered generally was sufficient for amplification of the target

Fig. 4. Standard curve of Alternaria brassicae DNA concentration standards against the cycle thresh- old (CT). CTs were determined, using real-time PCR
and 115sens/rev diagnostic primers, as the cycle at which the fluorescent signal exceeded background fluorescence. CTs obtained with DNA extracted from
100% () and 10% () artificially contaminated radish seed or 10% naturally infected radish seed () are indicated on the plot.

Fig. 3. Gel electrophoresis of polymerase chain reaction products obtained with internal transcribed spacer (ITS) 1/2 universal primers or ABCsens/rev
diagnostic primers and DNA extracted from seed artificially infected with Alternaria brassicae. Seed contamination levels are indicated above the gels.
Lanes labeled T+ were loaded with DNA extracted from a pure culture of A. brassicae and lanes labeled M were loaded with a DNA ladder (SmartLadder
Classic, Eurogentec, Seraing, Belgium).
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Plant Disease / Vol. 88 No. 5

DNA sequences. The nutritive medium used for macerating seed was chosen on the basis of our previous observations. Two other
liquid incubation media (i.e., clari- fied V8 broth and CW; 30), also were tested by Iacomi-Vasilescu et al. (8). Simi- lar results were
obtained with MDP or V8 media, but MDP was preferred because of easier handling during a subsequent filtra- tion step, whereas no signal
was obtained with the CW medium. PCR inhibitors
represent another obstacle commonly en- countered when conducting assays using complex samples (3,9). These inhibitors often have seed
component origins (19). In this study, the seed were removed after incubation and prior to DNA extraction and fungal mycelia and conidia
were col- lected using a spin filter unit. For technical reasons (e.g., size of the spin filter), we used seed batches containing only 100 seed.
Thus, infection levels lower than 3%
were not detected with good repeatability. In the original PCR diagnostic method described for A. japonica and A. brassici- cola (8), phenolchloroform extraction followed by an isopropanol precipitation step were sufficient to obtain a crude DNA preparation that subsequently
could be used as template for amplification without any further treatment. In the present work, we demonstrated that this DNA isolation
procedure could be replaced successfully
Table 2. Infection level (%) of seed lots naturally infected with pathogenic Alternaria spp. used in the present study
Infection level (%) of seed lot number
Fungal species
Alternaria brassicae
A. brassicicola
A. japonica
A. alternata
Fusarium sp.
Phoma sp.

A (cabbage)

B (radish)

C (radish)

D (radish)

E (radish)

F (radish)

0
8
0
19
2
1

0
0
1
39
0
0

2
0
0
11
0
0

3
0
0
38.5
1
1.5

9.5
0
0
27
0
0

10
0
0
13.5
0.5
0

Fig. 5. Gel electrophoresis of polymerase chain reaction products obtained with A, ABCsens/rev diagnostic primers or B, internal transcribed spacer (ITS)
1/2 universal primers and DNA extracted from seed. Samples were prepared with seed naturally infected with Alternaria spp. from seed lots A to E. Lanes

labeled T+ were loaded with DNA extracted from a pure culture of Alternaria brassicae and lanes labeled M were loaded with a DNA ladder (SmartLadder
Classic, Eurogentec, Seraing, Belgium).
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by treating the fungal mycelium with a lysis buffer initially designed for process- ing food samples, and purifying DNA us- ing an
affinity-based method with silica membranes from a commercial kit. This DNA extraction procedure potentially could be used for
routine analysis of seed lots and is amenable to automation. In the same vein, routine analyses require an alternative method for
electrophoretic separation of the amplification products. Our preliminary results with real-time PCR using SYBR green are encouraging.
This fluorescent reporter dye binds double- stranded DNA; therefore, increasing fluo- rescence may be monitored continuously during the
amplification procedure, thus eliminating the need for post-PCR analy- sis. Real-time PCR assays have been im- plemented for the detection
of fungal plant pathogens in several recent studies (2,5,13,29,31). This technique should soon be useful for seed health testing, and Tay- lor et
al. (23) already have used it for the detection of Microdochium nivale in wheat seed. We showed here that rapid and spe- cific detection of A.
brassicae is possible using real-time PCR in the presence of SYBR green with a primer set designed from an NRPS gene sequence. This
primer set gave satisfactory results with a wide range of target DNA concentrations, thus allowing accurate quantification of seed
infection levels. We obtained similar CT values with DNA extracted from naturally contaminated seed (10% infection, as esti- mated by the
standard plating method) or from seed artificially infected with A. brassicae at a level of 10%. Real-time PCR was found to be more
sensitive than the standard amplification procedure, and a successful amplification was obtained with a seed lot with 2% A. brassicae infection. According to the Internal Seed Testing Association, this corresponds to the maximal level of infection of com- mercial
cruciferous seed by pathogenic Alternaria spp.
The PCR diagnosis method described here, which combines DNA extraction from seed using the Nucleospin Food kit and real-time
PCR in the presence of SYBR green and primers designed from an NRPS gene, is readily amenable to auto- mation. With this method,
after ap- proximately 50 h, A. brassicae can be accurately and sensitively detected in in- fected seed. Homologous sequences have been
identified in the A. japonica and A. brassicicola genomes; therefore, the same method also may be applied for the detec- tion of these two
seed pathogens, provided that relevant primers are designed. More- over, although many tests probably will be necessary to accurately
correlate the amount of DNA extracted from infected seed and their level of infection (particularly when testing seed lots with very low
infection levels), it should be
possible to further develop this method to make it quantitative.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank the Agence Universitaire de la Fran- cophonie for providing B. Iacomi-Vasilescu with a post-doctoral fellowship.
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496

Plant Disease / Vol. 88 No. 5

ESPAOL

Pgina 1

Convencional y en tiempo real el ensayo de PCR-base para la deteccin

Brassicae Alternaria patgena en Semilla Cruciferous
Thomas Guillemette, UMR 77 Pathologie Vgtale, Facult des Sciences, Angers,
Francia; Batrice IacomiVasilescu, UMR 77 Pathologie Vgtale, Francia y USAMV, Departamento de Proteccin
Vegetal, Bucarest, Rumania;
y Philippe Simoneau, UMR 77 Pathologie Vgtale, Francia
RESUMEN
Guillemette, T., Iacomi-Vasilescu, B., y Simoneau, P. 2004. convencional y PCR en tiempo real
para la deteccin de ensayo basado Alternaria patgena
brassicae en las semillas de las crucferas. Dis Planta. 88: 490496.
Alternaria brassicae es un importante hongo patgeno transmitida por semilla responsable de
la enfermedad de la mancha negro de las crucferas. Control sanitario de comercial
semilla es necesario limitar la propagacin de este patgeno. Mtodos de deteccin actuales,
basados en la cultura y la identificacin morfolgica de los hongos, son
consume mucho tiempo, laboriosa, y no siempre fiable. Por lo tanto, una reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR) fue desarrollado con base en A. brassicae cebadores especficos diseados sobre la base de la secuencia de dos genes agrupados
potencialmente implicados en la patogenicidad. Se seleccionaron dos grupos de cebadores
para convencional y PCR en tiempo real, respectivamente. En ambos casos, A. brassi- cae se
detect especficamente utilizando ADN extrado de la semilla. El Real-

mtodo basado en la PCR en tiempo que aqu se presenta se puede automatizar fcilmente y los
resultados preliminares indican que es eficaz para la estimacin cuantitativa de las semillas
infeccin.
Palabras clave adicionales: ABC transportador, diagnstico molecular, no ribosomal pptido
sintasa
semillas (1), lo que complica patgeno identificacin. Algunos aislamientos esporulan
escasamente o producen micelio estril bajo laboratorio
condiciones. La identificacin morfolgica es imposible cuando esto ocurre.
Enfoques moleculares, principalmente la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), con
frecuencia se han utilizado como herramientas para la deteccin de numerosos
hongos patgenos (4,14,17). Un ensayo de PCR sensible y rpido, basado en la amplificacin
de secuencias del espaciador transcrito interno (ITS)
regiones del ADN ribosomal, recientemente se ha desarrollado para
detectar A. brassicicola o A. cin japonica infeccin de las semillas de las crucferas (8).
Desafortunadamente, este mtodo no gener un diagnstico fiable cuando estaban
contaminados de semillas
con un. brassicae porque reacciones cruzadas
con otras especies de hongos en otro tiempo estabais
observado.
El gnero Alternaria comprende saproftico y especies patgenas de hongos filamentosos tous. Patgenos de las plantas de este
gnero tienen una gama de huspedes distinta y limitada. Ha sido
sugiere fuertemente que tanto la virulencia y especificidad de acogida son parte de- pendiente
de la produccin de toxinas especficas de servidor (HSTS; 18,27). La
complejo de tres especies, A. brassicae, A. brassicicola, y A. japonica (anteriormente
llamado A. raphani), es el responsable del punto negro
enfermedad de las crucferas y se transmite por la semilla de muchas especies pertenecientes a
los gneros Brassica y Raphanus. La enfermedad es de gran
importancia en crucferas cultivadas en todo el mundo, con la mayora de cultivares
comerciales siendo susceptible (25). Ocurre en todo el crecimiento planta husped
etapas, en las partes areas, y es identificable por lesiones negras, a menudo rodeados por
zonas clorticas (26). La enfermedad tambin puede ser destructivo
para los productores de semillas porque la infeccin a menudo conduce a aicos pod prematuro
y semilla arrugada, con una eficiencia de germinacin alterada, como
observado en varios hosts de crucferas, tales como Brassica juncea,
B. campestris, y B. rapa (20,21). La enfermedad mancha negra en
una seria reduccin de los rendimientos de los cultivos, como la reduccin de la calidad del
mercado de cabezas de coliflor y la calidad del aceite en la familia Brassicaceae oleaginosa
especies. Los hongos pasan el invierno en los residuos infectados de cultivos, semillas y
cualquier especie de malezas crucferas relacionadas. Pueden ser transmitidos por semilla a
travs de micelios
dentro de la semilla o esporas de transitorios en la superficie de la semilla. Las esporas son
fcilmente arrastrados por el viento y pueden dispersarse a grandes distancias pasantes a cabo
la
estacin de crecimiento.

Las prcticas comunes para prevenir la enfermedad no siempre proporcionan un control

satisfactorio de la infeccin. Control gentico podra ser el ms
cultivares estrategia eficaz, pero la mayora disponibles comercialmente muestran poca
resistencia al patgeno. Enfermedad del punto negro podra ser controlado
con fungicidas, pero aislados de campo de A. brassicicola expresar resistencia cruzada a los
fungicidas de amplio espectro comunes fueron recientemente
identificado en Francia (7). Las rotaciones con cultivos noncruciferous, la destruccin de
residuos de cultivos y control de malas hierbas tambin pueden ayudar a reducir la incidencia
de esta enfermedad. Ms an, el uso de semilla libre de patgenos es esencial para limitar la
propagacin y la incidencia de la enfermedad. La rutina actual
tcnica utilizada para evaluar los niveles de patgenos Alternativo naria spp. la contaminacin
de las semillas de las crucferas se basa en la cultura de los hongos por las semillas
en medios nutritivos y posterior caracterizacin morfolgica. Este es un proceso que consume
tiempo, por lo que se necesitan al menos 1 semana para obtener una
diag- resultado tic. El diagnstico exacto no es fcil porque numerosos
saproftica Alternaria spp. comnmente se encuentran en las crucferas
Johnson et al. (10) describieron recientemente el uso de una tcnica basada en PCR que
utilizan cebadores diseados a partir de un gen implicado en la patogenicidad
(Sntesis de la espe- AM-toxina acogida espe-) para detectar especficamente A. patotipos
manzana Alternaria entre Alternativo campo naria asla. Anfitrin
especificidad-tpico de varias spp.- Alternaria patgena depende principalmente de la
produccin de toxinas; por lo tanto, sondas moleculares eficaces
podra ser desarrollado para tcnicas de diagnstico por la clonacin de genes implicados en la
virulencia.
En el presente estudio, hemos desarrollado ensayos de PCR para la deteccin
de A. brassicae en lotes de semillas. Estos mtodos utilizados oligonucleo- mareas
complementaria a secuencias localizadas en un grupo de genes que pueden ser necesarios para
la patogenicidad del hongo. La especificidad y
idoneidad de los cebadores diseados se ensayaron usando estndar y PCR en tiempo real.
MATERIALES Y METODOS
Cepas y condiciones de cultivo de hongos. Los aislamientos de Alternaria spp. y otra era
generacin (Tabla 1) se recuperaron de la semilla. Los cultivos fueron
crecer y se mantuvieron en placas de Petri sobre agar de dextrosa de patata. aislamientos de
Alternaria se identificaron sobre la base de criterios de morfologa (11,16).
Identificaciones luego fueron confirmados por PCR utilizando pares de cebadores especficos
SUS (8) de Alternaria spp. patgenos para las crucferas.
Preparacin de muestras de semillas. Se prepararon muestras de semillas de la semilla
contaminada de rbano y repollo como se describe por IacomiVasilescu et al. (8).

Para contaminaciones artificiales, semillas se desinfectaron con

Pgina 2

490 Plant Disease / Vol. 88 No. 5

Hipoclorito de sodio al 1%, se enjuaga con agua estril, empapado durante 1 h en una
suspensin de esporas calibrado (106 esporas / ml), y se sec a habitacin
temperatura sobre papel de filtro estril. Desinfeccin y la inoculacin precisa picante se
confirm mediante la colocacin de 20 semillas en la superficie de malta-agar
placas durante 1 semana a 25 C. Se seleccionaron y se mezclan lotes de semillas que
muestran 0% (desin- semilla infectado) o 100% (semilla inoculada) infeccin
juntos para preparar muestras de semillas con diferentes niveles de contaminacin (0, 5, 10, 50,
y
100%).
Las muestras fueron producidos colocando
20 semillas (contaminado artificialmente) o 100 semillas (contaminada de manera natural) en
un tubo estril y se les cubre con 0,5 y 3 ml, respectivamente, de
MDP medio de cultivo lquido (extracto de malta 2%, 2% de dextrosa, 0,1% PEP-tono). Los
tubos se incubaron a 25 C durante
48 h con agitacin ocasional. Este paso de incubacin es una fase de enriquecimiento que
permite un aumento ptimo de la biomasa fngica a partir de semillas.
Los tubos se agitaron brevemente a continuacin para separar el micelio y conidios de la
semilla. La semilla se descartaron y las estructuras fun- gal eran
recogido en filtros migrantes crocentrifuge (tamao de poro: 0,45 m; Ultrafree-Mc Millipore,
Bedford, MA) por centrifugacin a 5000 g durante 10 min.
ADN manipulacin. El ADN se extrajeron a partir de micelios de hongos y conidios
cosechada por raspado de la superficie de cultivos en placas de Petri
(Extraccin de las culturas por hongos) o recogidos en los filtros de microcentrfuga
(extraccin de muestras de semillas). Se aislaron los cidos nucleicos
de acuerdo con el procedimiento miniprep de microondas se describe por Goodwin y Lee
(6). Alternativamente, el ADN fue extrado por medio de la Nukit de Alimentos cleospin (Macherey-Nagel, Dren, Alemania) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Ensayo basado en PCR.
Utilizando el software apropiado (Primer 3 en lnea y ABI PRISM Primer Express). Los dos
ORFs se dedujeron a partir de la secuencia de nucletidos. El genotipo fragmento de
ADN brassicae identificado despus de cribado de una cosmediados biblioteca con una sonda
correspondiente a una parte de Thase el pptido no ribosomal sin- gen (NRPS). Con el fin de
probar la especificidad de los pares de cebadores contra A. brassicae asla, amplificaciones se
realizaron utilizando ADN extrado a partir de cultivos puros de hongos a partir de una gama
de Alternaria spp. y otros hongos aislados a partir de semillas. A continuacin, el
procedimiento de PCR se aplic para detectar la contaminacin de la semilla. El cebador
universal
par ITS1 / ITS2 (28) se utiliz como control positivo para evaluar la calidad del ADN
extrado. PCR convencional se realiz con 2 l
de preparados diluidos de ADN bajo las siguientes condiciones: Tris-HCl, pH 9,0, 20 mM (NH

4
)2SO4
, 0,01% (peso / vol)
, 200 mM de cada trifosfato cleotide desoxirribonucletidos, y 1 unidad de ADN polimerasa
ter- resistente a la deformacin .
Un termociclador se utiliz por 3 min a 95 C; seguido por 35 ciclos de 30s a 95 C, 50 s a
60 C y 1 min a 72 C; y una etapa final de 10 min a 72 C.
Los resultados se visualizaron despus de la electroforesis de una alcuota
Fig. 1. Gel de electroforesis de los productos de reaccin en cadena de la polimerasa
obtenida con espaciador transcrito interno (ITS) 1/2 cebadores universales y con
Page 3

ABCsens / rev cebadores de diagnstico. Se extrajo ADN de Alternaria

brassicae culturas puro o a partir de semillas de rbano infectado
con A. brassicae, utilizando el Nukit de Alimentos cleospin. Lanes M se cargaron con una escalera de ADN (Smartladder
Classic, Eurogentec, Seraing, Blgica).
Plant Disease / Mayo 2004 491
1,2% de gel de agarosa. Los PCR en tiempo real las reacciones se llevaron a cabo en un
volumen final de 25 l que contiene: 2,5 l de ADN, 12,5 l de SYBR
Green PCR Master Mix 2X (Aplicado Biosystems, Courtaboeuf, Francia),
300 nM adelante y atrs primers y H
2
O hasta 25 l. Un ABI PRISM 700 Se- Sistema de Deteccin de secuencia (Applied
Biosystems) fue
se utiliza con los siguientes pasos: 2 min a 50 C, 10 min a 95 C y 40 ciclos consistentes en
un paso a 95 C durante 15 s, seguido de un paso a
60 C durante 1 min. Los cidos nucleicos se cuantificaron en muestras desconocidas por
comparacin directa a un estndar. El ADN utilizado como estndar era
extrajeron a partir de cultivos de hongos, con la concentracin medida mediante ensayo
fluoromtrico (Turner Diseo Inst. 700, Sunnyvale, CA) antes
dilucin.
RESULTADOS
La seleccin de la PCR de diagnstico cebado res. Los genes de bacterias y hongos que
participan en la produccin de toxinas se utilizo para desarrollar herramientas de diagnstico
molecular. Por lo tanto, los pares de cebadores fueron sobre la base de la secuencia de
nucletidos de dos genes que codifican una A. brassicae.
Estos genes involucrados en un metabolito pptido txico producido por A. brassicae y son
adecuadas para PCR deteccin basada de este patgeno.
Se esperaba encontrar genes homlogos en patgena relacionada Alternaria spp, Por lo tanto,
la deteccin por PCR de la A. japonica y A. brassicicola se realiz usando cebadores que
abarcan el A. brassicae.

seleccionar cebadores para la deteccin especfica de A. brassicae. Dos pares de cebadores

fueron diseados: uno para los ensayos de PCR estndar, llamado ABCsens / ABCrev, situado cerca del extremo 3 'del gen transportador ABC secuencia de
codificacin; y otro para los ensayos de PCR en tiempo real, llamado
115sens / 115rev, ubicado en Aproximadamente 10 kb de los PNR codn de inicio del gen.
La extraccin de ADN a partir de semillas. Se extrajo el ADN del micelios de hongos de las
muestras de semillas, para estraccion se uso kit de alimentos que fue muy eficiente. Para aislar
cidos nucleicos, patrones de amplificacin similares se obtuvieron con ambos pares de
cebadores universales y especficos
El ADN obtenido con el kit de Alimentos tambin fue probado con xito como molde para la
PCR en tiempo real
Especificidad de las imprimaciones PCR seleccionados. Para probar la especificidad de A.
brassicae se utilizaron cebadores mediante reaccin de PCR con ADN genmico extrado de
cultivos puros de micelio de diferentes aislados fngicos (Tabla 1).
Estos fueron seleccionados para
representar una gama de hongos que se encuentran comnmente en las semillas de crucferas,
incluyendo los tres patgeno Alternaria spp. A. brassicicola (cinco aislamientos),
A. japonica (cinco aislamientos), y A. brassicae (cinco aislamientos), as
como Alternaria asla (dos aislamientos), y los aislados de
Fusarium spp. (dos aislamientos), penitente Cillium spp., Aspergillus spp., y Phoma spp. (Uno
aislar cada uno). Otra Alternaria sp transmitida por semilla. (A.
dauci) y aislados de los gneros estrechamente
relacionados Ulocladium y Stemphylium tambin fueron probados, junto con uno de Botrytis
cinerea cepa
aislado de semillas de girasol. Una muestra de gel representativo se muestra en la Figura 2.
Despus de la optimi- zacin de los parmetros de ciclacin, ducto PCR
ductos del tamao esperado (780 pb) se obtuvieron de A. brassicae asla solamente. No
hibridacin cruzada se observ con
Tabla 1. Los nombres y orgenes de las especies y los aislamientos utilizados en el presente
estudio

Deteccin por
Especies
Aislar no.
Origen
CONV-PCR
un
Q-PCR
b
Alternaria brassicae
Bre14
Semilla de rbano

+
+ A. brassicae
Bre16
Rbano
semilla
+
+ A. brassicae
Bre39
Semilla de rbano
+
+ A. brassicae
Bre103
Semilla de rbano
+
+ A. brassicae
Bre112
Semilla de rbano
+
+ A. brassicicola
Bra3
Semilla de rbano
- A. brassicicola
Bra18
Semilla de rbano
- A. brassicicola
Bra40
Semilla de rbano
- A.
brassicicola
Bra41
Semilla de rbano
- A. brassicicola
Bra43
Rbano
semilla
- A. japonica
Jap4
Semilla de rbano
- A. japonica
Jap19

Semilla de rbano
- A. japonica
Jap52
Semilla de rbano
- A. japonica
Jap63
Semilla de rbano
- A. japonica
Jap108
Semilla de rbano
- A. Alternaria
Alt62
Semilla de rbano
- A. Alternaria
R7404
Semillas de col
- A. dauci
R9228
Semillas de berro
Nuevo Testamento
otra Alternaria patgena crucferas
2A y 2B), con no patgeno A. alternativas hongos ensayados nata u otros (Fig. 2C). Seales se
obtuvieron con todos los hongos ensayados cuando el
universal de par de cebadores ITS1-ITS2 se utiliz como un control de la calidad del
ADN (datos no mostrados).
La especificidad de los cebadores de PCR en tiempo real se comprob usando 100 pg de ADN
extrado de cultivos puros de hongos listados en la Tabla 1. Todos
de los hongos seleccionados origi- nado a partir de semillas de las crucferas. No hay seal
fluorescente creciente exceda la fluorescencia de fondo (lnea de base
umbral) se observ excepto cuando A. ADN brassicae fue utilizado como plantilla. En ese
caso, las curvas de amplificacin fluorescentes estndar
que representa un crecimiento exponencial de productos de PCR fueron grabadas y una media
26.65
Stemphylium botryosum
C27381
Semillas de col
- S. botryosum
R7410

Semillas de col
- Botrytis cinerea
FC40
Semilla de girasol
nt Fusarium
sp.
FU6
Semilla de rbano
- Fusarium sp.
FU7
Semilla de rbano
- Phoma sp.
Pho1
Semilla de rbano
- Penicillium sp.
P1
Semillas de col
- Aspergillus sp.
A2
Semillas de col
Pgina 4

Verticillium sp.
V1
Tomate de semillas
Nuevo Testamento
un
conv-PCR se refiere a la reaccin en cadena de la polimerasa convencional (PCR) con el
conjunto de cebadores ABCsens-ABCrev.
b
Q-PCR se refiere a la PCR en tiempo real con el conjunto de cebadores 115sens-115rev; + =
Amplificacin, - = sin amplificacin, y nt = no ensayado.
perfiles de temperatura de los productos de PCR en el extremo de las reacciones cclicas se
determinaron con muestras que contienen A. ADN brassicae. La
pico disociacin solo del aumento de la fluorescencia se obtuvo para el cebador especfico
115sens-115rev a una temperatura de fusin de 83 a

84 C (datos no mostrados). Esto indica que la amplificacin especfica obtenida no implicaba

la hibridacin cruzada con otra A.
secuencias brassi- CAE- relacionadas o la formacin de dmeros de cebadores.
492 Plant Disease / Vol. 88 No. 5
Deteccin de PCR en muestras de semillas. En un experimento preliminar, la prueba de
deteccin de PCR se aplic a rbano y col lotes de semillas
contaminado artificialmente con A. brassicae (aislar Bre112). Se extrajo el ADN de las
diferentes muestras de semillas y se utiliza como una plantilla en
Experimentos de PCR, ya sea con la pareja ABCsens-ABCrev imprimacin (ensayos estndar)
o la 115sens115rev par de cebadores (PCR en tiempo real). En este ltimo caso, experimentos paralelos
con diluciones seriadas de un calibrado A. extracto de ADN fueron brassicae
llevado a cabo. A. brassicae se detect utilizando el procedimiento de PCR convencional en
todos los lotes de semillas contaminadas (Fig. 3), incluso a
los niveles de contaminacin tan bajas como 5% (Fig. 3B). Como era de esperar, una seal
tambin Nal se observ con el control positivo (ADN extrado de una
cultivo puro del micelio de la A. brassicae aislar) pero no con el control negativo (semilla
infectado desin-). Ampliaciones utilizando el
universal de par de cebadores ITS1 / ITS2 tuvieron xito con todas las muestras, indicando que
el ADN extrado era adecuado para PCR (Fig. 3A).
Sin crecimiento de hongos se observ con semilla desinfectada chapada en medio de
crecimiento slido; por tanto, el de seal obtenidos con estos descendencia despus
la amplificacin con los cebadores no especficos probablemente se origin a partir de coextrados planta husped ADN.
Cuando se utiliz la PCR en tiempo real con diluciones serial de una A. extracto
brado brassicae ADN cali- como molde, de una curva estndar se traz
usando cantidades conocidas de A. ADN brassicae contra de la C
T
calculada con el ABI Prism 7000 secuencia sistema de deteccin (SDS) de software (Fig.
4). Esta curva revel que el conjunto de cebadores usado en este experimento era bastante
precisa en un rango lineal de al menos 3,5 rdenes de magnitud
y que las correlaciones entre C
T
y las cantidades de ADN fueron altas (R
2
= 0,986). La media C
T
valores obtenidos con 100 y
10% de rbano contaminadas artificialmente lotes de semillas fueron 25,56 y 32,55,
respectivamente, correspondiente a aproximadamente 250 y 3,5 pg de A.
ADN brassicae, respectivamente.
Estos resultados se obtuvieron con ficial semilla contaminada cialmente libre de otro gal fun- o
contaminaciones bacterianas. A continuacin, fue necesario
comprobar este enfoque diagnstico molecular con la col y el rbano semillas naturalmente
contaminados con patgenos Alternaria spp. Seis diferentes

lotes de semilla fueron probados (Tabla 2). Los niveles de infeccin eran de- minada de 200
semillas utilizando la tcnica de recubrimiento estndar. Ampliaciones utilizando el
inespecfica par de cebadores ITS1-ITS2 tuvieron xito con todo el ADN extrado de muestras,
lo que indica que este ADN era adecuado para
amplificaciones adicionales (Fig.
5B). Cuando el ABCsens / par de cebadores rev
PCR en tiempo real se llev a cabo con muestras preparadas con los seis lotes de semillas de
rbano. Curvas de amplificacin se obtuvieron solamente con DNA
extrado de lotes C a F. Similar C
T
Se tom nota de los lotes de semillas E y F (Fig. 4): valores (32,54 media). Este valor medio es
similar a la
obtenido con el 10% contaminado artificialmente por lotes de semillas. El C
T
valor para el lote de semillas C, con una A. nivel de infeccin brassicae del 2%, fue
34.28.
DISCUSIN
Las pruebas convencionales utilizan para detectar A. brassicae en las semillas de implicar una
combinacin de ensayos de patogenicidad y la caracterizacin morfolgica.
Sin embargo, el inconveniente de tales mtodos es que la identificacin de patgenos exacta
puede ser difcil y consume mucho tiempo. Por lo tanto, hay una
urgente necesidad de una prueba sensible y rpido que pude
detectar transmitida por semilla A. tcnicas brassicae. Con ad- adelantos en biologa molecular,
desarrollados ms recientemente para la deteccin de microorganismos
involucrar a anlisis de PCR. Las ventajas de los ensayos basados en PCR incluyen
especificidad, sensibilidad y velocidad. Por lo tanto, tales ensayos han sido
diseado para la deteccin de varios patgenos de plantas, hongos in- transmitida por semilla
INCLUYENDO (22,24). Unos mtodos basados en PCR ya han sido
reportado para la deteccin de Alternaria spp. en la zanahoria (12,19), semillas de lino (15), y
crucferas (8) de semillas, as como en los tejidos del husped (15) o comida
productos (32). La regin ITS del ADNr nuclear (8,12,15,32) es la principal regin genmica
especfica para el desarrollo de cebadores de PCR. Recientemente,
Iacomi- Vasilescu et al. (8) report un ensayo de diagnstico PCR sensible y rpido para la
identificacin de A. brassicicola y A. japonica en
semillas de crucferas. Sin embargo, el ITS
se utiliz, A. Se detectaron contaminaciones brassicae hasta 3% (semilla lote D) (Fig. 5A). No
hay seal de amplificacin se obtuvo con el ADN
extrado de los lotes de semillas A, B y C.
Fig. 2. Gel de electroforesis de los productos de reaccin en cadena de la polimerasa obtenida
con el ABCsens / rev
cebadores de diagnstico y ADN extrado de cultivos puros de varios aislamientos
de Alternaria brassicae o a partir de cultivos puros de A, A. brassicicola asla o B, A.
japonica asla o C, aislados de diferentes especies de hongos recuperados a partir de
semillas. Los nmeros encima de los geles corresponden a aislar cdigos de identificacin
como

se describe en la Tabla 1. M carriles se cargaron con una escalera de ADN (Smartladder

Classic, Eurogentec, Blgica).
Plant Disease / Mayo 2004 493
cebadores diseados en este estudio para A sicae bras-. resultaron ser no muy especfico
porque las seales de amplificacin fueron consistentemente obtienen
con el ADN de algunos A. japonica asla.
En el presente estudio, hemos utilizado dos conjuntos de cebadores, altamente especficos
a A. brassicae, de- firmado a partir de dos genes agrupados correspondiente a un
Gen NRPS y un gen transportador ABC. Estos dos genes pueden producir y secretar factores
asociados con la virulencia de la fngica
patgeno (es decir, el husped especfico toxinas peptdicas o res sideropho-).
El ensayo de semillas basado en la PCR convencional que hemos desarrollado especficamente
detecta la presencia de A. brassicae en las semillas de las crucferas, incluso a
los niveles de infeccin de tan solo el 3% y despus de slo 2 das de incubacin. El primer
gran obstculo que haba que superar era el bajo nivel de
ADN diana a partir de los hongos. Una incubacin de 48 h en medio nutritivo lquido MDP era
adecuado para obtener un aumento ptimo de la fngica
biomasa (8); Por lo tanto, la cantidad de ADN genmico gal fun- recuperado generalmente era
suficiente para la amplificacin de la diana
Pgina 5

Fig. 4. Curva Estndar de Alternaria brassicae normas de concentracin de ADN contra el

ciclo umbral (C
T
). C
T
s se determinaron, mediante PCR en tiempo real
y 115sens / rev cebadores de diagnstico, como el ciclo en el que la seal fluorescente super
la fluorescencia de fondo. C
T
s obtenidos con el ADN extrado de
100% () y 10% (A) contaminado artificialmente semillas de rbano o el 10% de semillas de
rbano infectados naturalmente (") se indican en la parcela.
Fig. 3. Gel de electroforesis de los productos de reaccin en cadena de la polimerasa obtenida
con espaciador transcrito interno (ITS) 1/2 cebadores universales o ABCsens / rev
cebadores de diagnstico y el ADN extrado de las semillas infectadas artificialmente
con Alternaria brassicae. niveles de contaminacin de la semilla se indican encima de los
geles.
Los carriles marcados T + fueron cargados con ADN extrado de un cultivo puro
de A. brassicae y carriles marcados M fueron cargados con una escalera de ADN (Smartladder
Clsico, Eurogentec, Seraing, Blgica).
494 Plant Disease / Vol. 88 No. 5
Page 6

Secuencias de ADN. El medio nutritivo utilizado para las semillas de maceracin fue elegido
sobre la base de nuestras observaciones anteriores. Otros dos lquidos

medios de incubacin (es decir, clari- caldo V8 cado y CW, 30), tambin fueron probados por
Iacomi-Vasilescu et al. (8). Se obtuvieron resultados simi- lares
con MDP o medios V8, pero MDP se prefiere debido a un manejo ms fcil durante una etapa
de filtracin posterior, mientras que no hay seal era
obtenida con el medio de CW. Inhibidores de la PCR
representar un obstculo ms comnmente ES- contrarrestado cuando se realizan ensayos con
muestras complejas (3,9). Estos inhibidores tienen a menudo semilla
orgenes de componentes (19). En este estudio, la semilla se retiraron despus de la incubacin
y antes de la extraccin de ADN y micelios fngicos y conidios
se recopilaron utilizando una unidad de filtro giratorio. Por razones tcnicas (por ejemplo, el
tamao del filtro giratorio), se utiliz los lotes de semillas que contienen slo 100 semillas.
Por lo tanto, los niveles de infeccin menor que 3%
no se detectaron con una buena repetibilidad. En el mtodo de diagnstico de PCR original
descrito por A. japonica y A. brassici- cola (8), fenolextraccin con cloroformo seguido por una etapa de precipitacin con isopropanol fueron
suficientes para obtener una preparacin de ADN crudo que posteriormente
podra ser utilizado como molde para la amplificacin sin ningn tratamiento adicional. En el
presente trabajo, hemos demostrado que este aislamiento de ADN
procedimiento podra ser reemplazado con xito
Tabla 2. Nivel de Infeccin (%) de los lotes de semillas naturalmente infectado con
patgeno Alternaria spp. utilizado en el presente estudio
Nivel de Infeccin (%) de semillas de nmero de lote
Especies de hongos
A (col)
B (rbano)
C (rbano)
D (rbano)
E (rbano)
F (rbano)
Alternaria brassicae
0
0
2
3
9.5
10
A. brassicicola
8
0
0
0
0
0
A. japonica
0
1

0
0
0
0
A. alternata
19
39
11
38.5
27
13.5
Fusarium sp.
2
0
0
1
0
0.5
Phoma sp.
1
0
0
1.5
0
0
Fig. 5. Gel de electroforesis de los productos de reaccin en cadena de la polimerasa obtenidos
con A, ABCsens / rev cebadores o B de diagnstico, espaciador transcrito interno (ITS)
Medio cebadores universales y ADN extrados de la semilla. Las muestras se prepararon con
semillas naturalmente infectados con Alternaria spp. de lotes de semillas de A a E. Lanes
Pgina 7

etiquetada T + se cargaron con el ADN extrado de un cultivo puro de Alternaria brassicae y

carriles marcados M fueron cargados con una escalera de ADN (Smartladder
Clsico, Eurogentec, Seraing, Blgica).
Plant Disease / Mayo 2004 495
tratando el micelio del hongo con un tampn de lisis diseado inicialmente para muestras de
alimentos Processing, y el ADN de purificacin nosotros- ing un
mtodo basado en afinidad con las membranas de slice a partir de un kit comercial. Este
procedimiento de extraccin de ADN potencialmente podra ser utilizado para
anlisis de rutina de lotes de semillas y es susceptible de automatizacin. En el mismo sentido,
los anlisis de rutina requieren un mtodo alternativo para
separacin electrofortica de los productos de amplificacin. Nuestros resultados preliminares
con PCR en tiempo real utilizando SYBR verde son alentadores.
Este colorante indicador fluorescente se une ADN bicatenario; Por lo tanto, el aumento de
fluorescencia se puede monitorizar de forma continua durante el

procedimiento de amplificacin, eliminando as la necesidad de post-PCR anlisis. Ensayos de

PCR en tiempo real han sido im- complementado para la deteccin
de patgenos fngicos de plantas en varios estudios recientes (2,5,13,29,31). Esta tcnica
debera pronto ser til para las pruebas de sanidad de la semilla, y Tay lor et
al. (23) ya lo han utilizado para la deteccin de Microdochium nivale en semillas de
trigo. Mostramos aqu que la deteccin espe- rpida y espe- de A.
brassicae es posible utilizando PCR en tiempo real en presencia de SYBR verde con un
conjunto de cebadores diseados a partir de una secuencia de gen de NRPS. Este
conjunto de cebadores dio resultados satisfactorios con una amplia gama de concentraciones de
ADN diana, permitiendo as la cuantificacin exacta de las semillas
los niveles de infeccin. Obtuvimos similares C
T
valores con ADN extrado de la infeccin contaminada de manera natural de la semilla (10%,
como se estima por la
mtodo de recubrimiento estndar) o de la semilla infectados artificialmente con A. brassicae a
un nivel de 10%. PCR en tiempo real se encontr que era ms
sensible que el procedimiento de amplificacin estndar, y una amplificacin con xito se
obtuvo con un lote de semillas con 2% A. brassicae ininfeccin. De acuerdo con la Seed Testing Association interna, esto corresponde al nivel
mximo de la infeccin de comercial
semilla crucferas por patgeno Alternaria spp.
El mtodo diagnstico de PCR descrito aqu, que combina la extraccin de ADN a partir de
semillas utilizando el kit Nucleospin Alimentos y en tiempo real
PCR en presencia de SYBR verde y los cebadores diseados a partir de un gen de NRPS, es
fcilmente susceptible de Automation. Con este mtodo,
despus de aprox 50 h, A. brassicae se puede detectar con precisin y sensibilidad en la semilla
infectado cin. Las secuencias homlogas han sido
identificado en el A. japonica y A. genomas brassicicola; Por lo tanto, el mismo mtodo puede
aplicarse tambin para la deteccin de estos dos
patgenos de semillas, a condicin de que los cebadores estn diseados pertinentes. Ms an,
a pesar de muchas pruebas, probablemente ser necesario precisin
correlacionar la cantidad de ADN extrado de la semilla infectada y su nivel de infeccin
(particularmente cuando se prueba lotes de semillas con muy baja
los niveles de infeccin), debe ser
posible desarrollar an ms este mtodo para que sea cuantitativa.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Agencia Universitaria de la Francisco cophonie para proporcionar B.
Iacomi-Vasilescu con una beca post-doctoral.
LITERATURA CITADA
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