W anderson

OBTENÇÃO DO SANGUE PARA ANÁLISE

Para realizarmos os exames laboratoriais, podemos obter o sangue venoso, sangue arterial ou sangue capilar.

COLETA DE SANGUE

Para garantirmos a qualidade dos exames realizados em amostras sanguíneas, precisamos ter em mente vários aspectos
que antecedem os exames, como:

Orientação adequada ao cliente, preparo do material de coleta, acondicionamento do material, etc.

O sangue para exames hematológicos deve ser recolhido com pacientes repousado, preferencialmente, sendo o jejum
opcional, exceto em casos em que serão executados outros exames onde o jejum é obrigatório (VHS, Glicose, Colesterol
total e frações, Triglicérides, etc.).
A amostra não poderá conter hemólise (quebra das hemácias), nem coágulos; deverá ser colhida com o anticoagulante
indicado e os exames realizados no tempo prescrito.

Anticoagulantes:

EDTA (Ácido etileno diaminotetracético): Hemograma (eritrograma + leucograma), classificação sanguínea e contagem
de plaquetas.
Fluoreto de sódio: Glicose.
Citrato de sódio: TP (Tempo de Protrombina), TTP (Tempo de Tromboplastina Parcial), Atividade de Protrombina, RNI,
Coagulograma.
Oxalato de potássio: Velocidade de Hemossedimentação (VHS).

Sangue Venoso

É o processo mais comum de se obter o sangue para análise. Geralmente puncionamos as veias superficiais do antebraço
(Basílica, mediana e cefálica), as veias do dorso das mãos e dos punhos ou as veias do pescoço (jugulares externas e internas).

Cuidados:

Instalar o paciente da melhor maneira possível.

Ao puxar o êmbolo, firmar a seringa apoiando a mão no braço do cliente para não perder a veia.
Evitar deixar o paciente ficar dobrando o braço ou deixar esfregar o algodão logo após a punção.
Só liberar a paciente após verificar se o sangramento parou.
Em caso de vertigens, abaixe a cabeça da pessoa entre os joelhos, orientando fazer força para cima, ao mesmo tempo em
que você pressiona para baixo a nuca da pessoa, até passar a vertigem, e levando-o para o lugar arejado.

Complicações:
Outras: Desmaios, transmissão de doenças como hepatite, AIDS, etc.

Punção venosa (Coleta utilizando seringa):

1. Preparar o material:

 Cuba rim.
 Seringa descartável com agulha – 25x7 (para criança) ou 25x8 (para adulto).
 Tubos de ensaio – sem anticoagulante e/ou com anticoagulantes apropriados, com tampa.
 Algodão umedecido em álcool 70% e algodão sem álcool.
 Garrote.

2. Receber e orientar e acomodar o cliente.

3. Conferir com atenção na guia do médico quais os exames a serem realizados.
4. Calçar as luvas fazendo assepsia das mesmas com álcool-gel.
5. Separar os tubos que serão utilizados.
6. Colocar o garrote aproximadamente 5 cm acima do local onde será realizada a punção. Nunca deixar o garrote por mais de
1 minuto.
7. Selecionar a veia adequada para a punção.
8. Fazer a assepsia no local utilizando algodão embebido com álcool 70%.
9. Realizar a punção introduzindo a agulha, com o bisel voltado para cima, num ângulo de 15º em relação ao braço. Com a
outra mão, puxar o êmbolo, com tensão suave e constante, até obter o volume desejado. Soltar o garrote.

Obs: Se estiver usando sistema a vácuo, assim que a agulha penetrar a veia empurre o tubo para frente do suporte segurando
firmemente a agulha no local correto. Soltar o garrote quando o sangue começar a fluir. Trocar por outro tubo quando estiver cheio.

10. Colocar o algodão no local da punção, retirar a agulha e orientar o cliente para fazer uma pressão com o dedo indicador
sobre o algodão.
11. Nas coletas com seringa, retirar a agulha, cuidadosamente, com o auxílio de uma pinça. Desprezá-la no recipiente para
descarte de perfurocortantes e transferir o sangue para os tubos de ensaio.
12. Deixar aproximadamente duas gotas de sangue na seringa para se fazer o esfregaço sanguíneo quando houver
Hemograma, Eritrograma, Leucograma, Contagem de Plaquetas e/ou de Reticulócitos. Realizar a extensão sanguínea.
13. Verificar as condições gerais do cliente observando se não há sinais de fraqueza e se o sangramento está controlado.
Colocar o curativo sobre a punção.

Obs: Os tubos que contêm anticoagulantes devem ser tampados e homogeneizados por inversão. O tubo sem anticoagulante deve
ser levado ao banho-maria a 37 ºC por, aproximadamente, 15 minutos para facilitar a separação do soro. Após a coagulação este
tubo é centrifugado a 3 500 RPM por 5 minutos.

Coleta de sangue a vácuo:

1. Preparar o material a ser utilizado na coleta.

2. Receber, orientar e acomodar o cliente.
3. Conferir com atenção no pedido do médico quais os exames a serem realizados.
 4. Consultar o manual de coleta para certificar que material (soro, plasma, sangue total) deverá ser coletado.
5. Calçar as luvas fazendo assepsia das mesmas com álcool-gel.
6. Separar todos os tubos necessários à coleta.
7. Colocar o garrote quatro dedos acima do local onde será realizada a punção. Nunca deixar o garrote por mais de 1 minuto.
8. Selecionar a veia adequada para a punção.
9. Embeber o algodão em álcool 70% e realizar a assepsia local, de baixo para cima.
10. Realizar a punção observando que a agulha penetre num ângulo de 15 graus em relação ao braço, com o bisel da agulha
voltado para cima. Seguir o trajeto da veia com a agulha. Soltar o garrote quando o sangue começar a fluir.
11. Assim que a agulha penetrar a veia, empurre o tubo para frente do suporte segurando firmemente a agulha no local
correto. Trocar por outro tubo quando estiver cheio.
12. Após o encerramento da coleta, solicitar ao paciente que relaxe o braço, colocando um chumaço de algodão seco sobre o
local da punção.
13. Pressione o local da punção somente após a retirada da agulha.
14. Para coletar sangue arterial selecionar preferencialmente a artéria radial, em seguida a braquial e por último, a femural.
15. Homogeneizar os tubos que contêm anticoagulante e realizar a confecção do esfregaço sanguíneo quando necessário.
16. Proceder a identificação das amostras (numerar).
17. Colocar o curativo sobre a punção.

Obs: Verificar as condições gerais do cliente verificando se não há sinais de fraqueza e se o sangramento está controlado.

Sangue Capilar

É obtido através da punção da polpa digital, da superfície plantar do calcanhar ou do lóbulo da orelha. Esta punção é
pouco usada na rotina, devido à pequena quantidade de sangue obtida.
Exemplos de exames que podem ser realizados pelo sangue capilar:

Pesquisa de parasitas intra-eritrocitários.

Estudo da morfologia dos Leucócitos.
Hemograma.
Classificação sanguínea.

A punção capilar é uma alternativa para quando não conseguimos obter o sangue de outra forma. A grande desvantagem
deste método é o fato de precisarmos fazer uma repetição, uma nova punção terá que ser feita, e, muitas das vezes, isso nem é
possível.

Técnica:

1. Escolher o local da punção.

2. Fazer a anti-sepsia com álcool a 70% e algodão.
3. Esperar o álcool secar e com uma lanceta descartável fazer a incisão (perfurar).
4. Desprezar a primeira gota e logo após deixando o sangue fluir livremente, aspirá-lo com o auxílio de uma micropipeta ou
pingar as gotas diretamente nas lâminas.

Cuidados:

Não lancetar área edemaciada (inchada)

Não lancetar pele fria ou cianótica
Não espremer o local
Esperar o álcool secar
Não soprar o local.
Sangue Arterial

Principais artérias a serem puncionadas: radial (45º), braquial (45º) e femural (90º).

Pressionar mais tempo (no mínimo 5 minutos).

Não garrotear.

Técnica:

1. Preparar o material:

 Cuba rim.
 Seringa descartável com agulha – 25x7 (para criança) ou 25x8 (para adulto).
 Tubos de ensaio – sem anticoagulante e/ou com anticoagulantes apropriados, com tampa.
 Algodão umedecido em álcool 70% e algodão sem álcool.

2. Conferir com atenção na guia do médico quais os exames a serem realizados.

3. Separar os tubos e frascos que serão utilizados.
4. Receber e orientar o cliente.
5. Calçar as luvas fazendo assepsia das mesmas com álcool-gel.
6. Selecionar a artéria adequada para a punção.
7. Fazer a assepsia no local utilizando algodão embebido com álcool 70%.
8. Realizar a punção introduzindo a agulha, com o bisel voltado para cima, num ângulo de 45º em relação ao braço. Com a
outra mão, puxar o êmbolo, com tensão suave e constante, até obter o volume desejado.

Obs: Se estiver usando sistema a vácuo, assim que a agulha penetrar a veia, empurre o tubo para frente do suporte segurando
firmemente a agulha no local correto. Trocar por outro tubo quando estiver cheio. Se estiver coletando sangue para gasometria,
utilize sempre seringa, após a coleta, segurando a seringa na posição vertical, retire todo o ar empurrando o êmbolo até o
surgimento de uma gota de sangue no bisel. Tampe a agulha utilizando rolha de borracha para evitar o contato com o ar.

9. Colocar o algodão no local da punção, retirar a agulha e orientar o cliente para fazer uma pressão com o dedo indicador
sobre o algodão por, aproximadamente, 5 minutos.
10. Nas coletas com seringa, retirar a agulha, cuidadosamente, com o auxílio de uma pinça. Desprezá-la no recipiente para
descarte de perfuro-cortantes e transferir o sangue para os tubos de ensaio.
11. Deixar aproximadamente duas gotas de sangue na seringa para se fazer o esfregaço sanguíneo quando houver
Hemograma, Eritrograma, Leucograma, Contagem de Plaquetas e/ou de Reticulócitos. Realizar a extensão sanguínea.
12. Verificar as condições gerais do cliente observando se não há sinais de fraqueza e se o sangramento está controlado.
Colocar o curativo sobre a punção.
13. Acompanhar o cliente até a porta.

Atividades

1. Cite quatro causas de erros na coleta de sangue.

2. Qual o melhor local de se fazer a punção venosa?
3. Qual a melhor veia para se fazer coleta? Por quê?
4. Por que não se deve usar garrote na coleta arterial?
5. Por que a coleta na artéria radial é mais segura que na braquial?
 AULA PRÁTICA

Noções Básicas de Microscopia Óptica:

 Lentes:

Oculares: Aumento 10X (Uniocular, Binocular, Tri-ocular e Tetra ocular.

Objetivas: 4x, 10x, 40x, 100x. Aumentos em 40x, 100x, 400x, 1000x.

Para se obter o aumento final, basta multiplicarmos o valor da objetiva pelo valor da ocular. Exemplo: Ao usarmos a
objetiva de 40x, teremos um aumento de 400 vezes (40 x 10 = 400).

 Parafusos: Macrométrico e Micrométrico (ajustar o foco).

 Charriot: Vertical e Horizontal (mudar os campos microscópicos).

 Controle de luminosidade: Potenciômetro (Liga/Desliga), Condensador e Diafragma.

 Mesa: Local onde se coloca a lâmina para ser analisada.

Noções de Espectrofotometria:

Espectrofotômetro é um aparelho utilizado para determinar a concentração de substâncias que foram submetidas a reações
colorimétricas. Esta determinação é feita por passar um feixe de luz através de uma solução. Uma fonte de luz policromática
fornece um feixe de luz que passa por um prisma que dispersa a luz em um espectro. A luz, agora monocromática passa por uma
fenda e atravessa a cubeta que contem a substância a ser dosada (colorida). Uma porção de luz é absorvida (Absorbância) e outra
passa (Transmitância) pela solução. A luz que passa pela solução é detectada pela célula fotoelétrica, que a converte em corrente
elétrica a qual é registrada por um galvanômetro.

Espectrofotometria em ensaios bioquímicos:

A espectrofotometria na região visível é um dos métodos de rotina mais práticos para a quantificação de substâncias em
solução. Nas aulas práticas de Bioquímica, utilizamos a espectrofotometria para determinar a concentração de glicose, colesterol,
triglicérides, ácido úrico, proteínas, ureia, creatinina, dentre outros compostos presentes no nosso sangue. Por fim, recorrer-se à
espectrofotometria para determinar atividades enzimáticas.

Radiações e luz:

A título de curiosidade, as sete cores observadas nos arco-íris resultam precisamente da decomposição da luz branca nas
radiações que a constituem. Em estudos espectrofotométricos as radiações com interesse resumem-se às que possuem cor gama
“visível” (cujo comprimento de onda varia de 320 a 800 mm) e às ultravioletas, as quais constituem uma pequena parte do
espectro (comprimento de onda varia de180 a 320 nm). O comportamento da luz pode ser descrito como um feixe de partículas, ou
como uma radiação eletromagnética. Recorre-se ao último para compreender os ensaios espectrofotométricos onde, partindo-se da
medida absorção da radiação eletromagnética de faixa de comprimento de onda definida (luz monocromática), é possível se
determinar a concentração de diversas substâncias.

Espectrofotômetros e medições de quantidades de luz:

A medição de quantidades de radiação absorvida por soluções pode ser realizada experimentalmente em aparelhos
designados espectrofotômetros.
 As radiações são produzidas a partir de uma fonte luminosa (lâmpada) que emite uma luz policromática que, ao passar
pelo filtro (prisma), se transformará numa luz monocromática, selecionável conforme o comprimento de onda adequado para a
análise em questão. O comprimento de onda ( ) utilizado numa análise será aquele correspondente à cor complementar da amostra.
Esta luz monocromática com uma intensidade inicial (I0) atravessa uma cubeta onde se encontra colocada a "amostra", até atingir
um detector que mede a intensidade de luz restante (I).

Teoria subjacente à medição de quantidades de luz:

A absorção de radiações eletromagnéticas pela matéria obedece aos seguintes princípios:

A relação entre luz absorvida e número de moléculas de soluto numa solução (traduzida pela sua concentração) é
exponencial.
A absorção de luz relaciona-se exponencialmente com o comprimento da distância que a luz percorre através da amostra.
Estes dois princípios foram integrados na expressão designada de "Beer-Lambert", que serve de base a todo e qualquer
ensaio espectrofotométrico quantitativo. A tradução matemática desta lei implica a definição de dois parâmetros:
a Absorvância (A) (referida nos manuais menos recentes como densidade óptica) e a Transmitância (T).
A percentagem de radiação que atravessa uma solução homogênea é designada por Transmitância (T) e apresenta
unidades (%) (expressão I.C). Contudo, os resultados espectrofotométricos são expressos geralmente em Absorvâncias
(A) que correspondem aos simétricos dos logaritmos das transmitâncias (expressão I.D). Este parâmetro é desprovido de
unidades e apresenta sobre a transmitância a vantagem de variar linearmente com a concentração das amostras, segundo a
lei de Beer-Lambert (expressão I.E). Estas expressões, extremamente úteis do ponto de vista prático, deixam em aberto a
relação entre luz e absorvida e concentrações, que foi condensada na expressão de Beer-Lambert (expressão 1.E.)

I.C. T = I / I0
I.D. A = -log T
I.E. A = e x l x c, onde e (coeficiente de absortividade molar (cm-1 x M-1), l (comprimento do percurso da luz através da
amostra (cm) e c (concentração da amostra; M).

As medições de Absorvância são realizadas em comprimentos de onda específicos de forma que, a luz que irá incidir
sobre a amostra, tenha cor complementar à cor da amostra.

Zonas de aplicabilidade:

É importante notar que a linearidade constatada na lei de Beer-Lambert se restringe a zonas de aplicabilidade
características de cada método para as condições experimentais utilizadas. Efetivamente, a concentrações de amostra
excessivamente reduzidas ou elevadas, poderão ocorrer erros originados, respectivamente, pela falta de sensibilidade do método,
ou pela acentuação da turbidez das soluções. As zonas de aplicabilidade de cada ensaio devem ser determinadas
experimentalmente, antes de ensaiar qualquer amostra, por forma a garantir a validade dos resultados experimentais obtidos para as
soluções problema.
Considerações práticas:

A proporcionalidade direta existente entre a quantidade de luz absorvida a comprimentos de onda específicos e a
concentração de soluções, permite a utilização da espectrofotometria como método quantitativo. Para o efeito, é necessário possuir
valores de referência ou, melhor ainda, uma relação entre Absorvâncias registadas experimentalmente para uma série de
concentrações de soluções. Na prática isso equivale à construção de retas de calibração.
Quando forem conhecidos valores de absorvância de soluções problema - obtidos experimentalmente - o recurso às retas
de calibração permite determinar matematicamente as concentrações respectivas. Para determinar a equação da reta de calibração,
procede-se da seguinte forma:

1. Soluções padrão: preparam-se soluções de concentrações conhecidas e diferentes (geralmente pesa-se um sólido para fazer
um stock concentrado, que é diluído em proporções diferentes para se obter as outras soluções padrão).
2. Executa-se o procedimento experimental de doseamento simultaneamente para as amostras e para as soluções padrão.
3. Avalia-se a zona de aplicabilidade do método.
4. Determina-se a relação existente absorvância de soluções padrão e respectivas concentrações, traçando (papel
milimétrico) ou determinando a equação (regressão linear) da reta resultante. A vantagem das representações gráficas
reside no fato de se poderem distinguir os resultados que se encontram dentro das zonas de aplicabilidade.

E quando a substância a detectar/dosear for invisível?

Na sua maioria, as soluções de biomoléculas são transparentes. Tal fato levou ao desenvolvimento de diferentes tipos de
abordagens à sua quantificação:

1. Uso de radiações da região Ultravioleta do espectro (por exemplo, proteínas e ácidos nucleicos absorvem radiações aos
260 e 280 nm, respectivamente).
2. Transformação da biomolécula num composto corado, por ligação específica de um corante (por exemplo, doseamento de
proteínas pelos método de Biureto: a ligação peptídica forma um complexo violeta com Cu 2+ na reação do Biureto).
3. Transformação da biomolécula num composto corado, por uma reação química específica (por exemplo: quantificação de
colesterol pelo método de Liebermann-Burchard).
4. Reconhecer alguns fatores importantes em ensaios espectrofotométricos aplicados a moléculas biológicas.
5. Aplicar a espectrofotometria para testar a presença de substâncias coloridas.
6. Perceber a linguagem utilizada em ensaios espectrofotométricos.
7. Determinar a concentração de soluções de biomoléculas.
8. Compreender os fundamentos e procedimento de ensaios espectrofotométricos quantitativos.

O espectrofotômetro permite fazer leituras das Absorbâncias ou das Transmitâncias de amostras submetidas a reações
colorimétricas. Normalmente em Bioquímica, as leituras são feitas em Absorbância (A).

Reações colorimétricas:

São aquelas nas quais os reagentes e a amostra (geralmente o soro) interagem, produzindo substâncias coradas ao final da
reação.
Ex: Reagente de cor de Glicose + Soro  Produto Corado
(Amostra)

A intensidade da cor do produto formado será tanto maior, quanto maior for a concentração da amostra.

Lei de Beer:

“A concentração da substância é diretamente proporcional a sua Absorbância”.

Substâncias que seguem a Lei de Beer:

Sendo assim, para as substâncias que seguem a Lei de Beer, podemos montar a seguinte regra de três:
 Concentração padrão Absorbância do padrão
Concentração da amostra Absorbância da amostra

Considerando: CP = Concentração padrão

AP = Absorbância do padrão
CA = Concentração da amostra
AA = Absorbância da amostra

Teremos:

CP AP
CA AA

Resolvendo a regra de três:

CpAA Cp
CA x AP = CP x AA  CA Ap  CA xAA
Ap  Fc x AA

Fator de Calibração

Desta forma, uma das maneiras de se determinar a concentração de substâncias que seguem a Lei de Beer, é multiplicar o
fator de calibração (Fc) pela absorbância da amostra (AA).
Outra forma de se determinar a concentração de substâncias que seguem a Lei de Beer, é a construção da Reta de
calibração, uma vez que a concentração é diretamente proporcional à absorbância. Para isto devemos fazer as leituras das
absorbâncias da substância a ser analisada em diferentes concentrações. No eixo X colocamos os valores das concentrações
conhecidas (diversas diluições do padrão) e no eixo y colocamos os valores das respectivas absorbâncias lidas no
espectrofotômetro. Construído o gráfico (Reta de calibração), a amostra será dosada e o valor de sua absorbância lida no
espectrofotômetro será colocada no eixo Y, a seguir, encontramos o valor da concentração da amostra no eixo X.
Exemplos de substâncias não seguem a Lei de Beer: Glicose, colesterol, triglicérides, ácido úrico, ureia, creatinina, etc.
 Para determinarmos a concentração de amostra que seguem a Lei de Beer utilizando o gráfico (Reta de calibração)
devemos fazer a leitura da absorbância da amostra, procurar o valor no eixo da absorbância e a seguir encontrar o valor
correspondente no eixo da concentração. Exemplo: Se a absorbância da amostra (AA) lida no espectrofotômetro fosse 0,310, ao
jogarmos este valor no gráfico, descobrimos que a concentração da amostra (CA) é 30 U/mL.
Na prática laboratorial, a concentração das substâncias que seguem a Lei de Beer é determinada multiplicando o Fator de
Calibração (Fc) pela Absorbância da amostra (AA).

CA = Fc x AA

Exemplos:

1. Calcule a concentração de Hemoglobina da amostra abaixo:

Dado: Cp = 10 g/dL
Leituras: Ap = 0,420
AA = 0,519

2. Calcule a concentração de Glicose das amostras abaixo:

Dado: Cp = 100 mg/dL

AA1= 0,420
AA2 = 1,240
AA3= 0,980
AA4 = 0,210
Ap = 0,350
Linearidade = 500 mg/dL

Linearidade

Quando a linearidade for ultrapassada, ou seja, quando a concentração da amostra for maior que a linearidade, a amostra
deve ser diluída até que sua concentração esteja dentro da linearidade. A concentração da amostra diluída será obtida
multiplicando-se a absorbância da amostra diluída pelo fator de calibração. Por fim, a concentração da amostra será obtida
multiplicando-se a concentração da amostra diluída pelo fator de diluição.
 Observe o gráfico abaixo. A partir do ponto marcado na reta de calibração, a proporcionalidade entre a concentração e a
absorbância deixa de existir, note que o gráfico passa a ser uma curva. Neste caso, dizemos que a concentração da amostra
ultrapassou a linearidade.

Se no exercício anterior, a absorbância da amostra 5 fosse igual a 1,760 (AA5 = 1,760), ao determinar sua concentração
obteríamos 502,8 mg/dL.
CA5 = Fc x AA5
CA5 = 285,7 x 1,76
CA5 = 502,8 mg/dL
Dessa forma a amostra deveria ser diluída, pois o valor é superior à linearidade dada (500 mg/dL). Se após a diluição 1:2,
a nova absorbância for igual a 1,000. Assim sendo, para determinar a real concentração dessa amostra, devemos proceder ao
seguinte cálculo.

CA5 diluída 1:2 = Fc x 1,000 = 285,7 x 1,000 = 2,857

A concentração da amostra diluída é obtida multiplicando-se o fator de calibração pela absorbância da amostra diluída.

CA5 = CA5 diluída 1:2 x Fd = 2,857 x 2

CA5 = 571,4 mg/dL
Para descobrirmos a concentração da amostra, multiplicamos a concentração da amostra diluída (que debe estar dentro da
linearidade) pelo seu fator de diluição.

Obs: Quando, mesmo após a diluição, ao multiplicarmos a absorbância da amostra diluída pelo fator de calibração, obtivermos um
valor acima da linearidade, a amostra deverá ser diluída novamente, até que a concentração da amostra diluída esteja dentro da
linearidade.

3. Determine as concentrações das amostras abaixo:

Dado: Linearidade = 300 mg/dL

Cp = 200 mg/dL
Ap = 0,194

AA1 = 0,210 AA4 = 0,610

AA1Dil.1:2 = 0,105 AA4 Dil.1:2 = 0,318
AA2 = 0,302 AA4 Dil.1:3 = 0,111
AA3 = 0,520
AA3 Dil.1:3 = 0,175
 Não precisa ser diluída, pois a concentração da
200 A1 foi menor que Linearidade.
CA
1 0
,210
,194  216,5 mg/dL
0
200 Não é possível determinar a concentração, pois a mesma
CA
2 0,302
0,194  311,3 mg/dL ultrapassou a linearidade. A mostra deve ser diluída.
200
CA
3 0
,520
0,194  536,1 mg/dL
CA3Dil.1:3 = 0,175 x Fc = 184 x Fd = 541,2 mg/dL
200
CA
4 0
,610
,194  628,8 mg/dL
0
CA4 Dil.1:2 = 0,318 x Fc  327,8 mg/dL

CA4 Dil.1:3 = 0,111 x Fc = 114,4 x Fd = 343,2 mg/dL

Substâncias que não seguem a Lei de Beer:

Para as substâncias onde a concentração não é diretamente proporcional à absorbância, não será possível calcular a
concentração aplicando a fórmula Ca = Fc x Aa.
A concentração da amostra será obtida a partir do gráfico (Curva de calibração), que será construído através de leituras
das absorbâncias de diversas (no mínimo 5) diluições do padrão (Substância de concentração conhecida). No eixo X colocamos os
valores das concentrações conhecidas (diversas diluições do padrão) e no eixo y colocamos os valores das respectivas absorbâncias
lidas no espectrofotômetro. Construído o gráfico (Curva de calibração), a amostra será dosada e o valor de sua absorbância lida no
espectrofotômetro será colocada no eixo Y, a seguir, encontramos o valor da concentração da amostra no eixo X.

Exemplos de substâncias que não seguem a Lei de Beer:

TGO (Transaminase Oxalacética)

TGP (Transaminase Pirúvica).

A determinação da concentração destas substâncias é feita utilizando a Curva de Calibração.

Uso do espectrofotômetro
 1. Ligar o aparelho (na parte posterior) e esperar estabilizar.
2. Selecionar o λ (comprimento de onda).
3. Colocar o “branco” na cubeta, limpá-la com gaze ou papel, colocá-la na posição correta no aparelho e tampar.
4. Selecionar transmitância e colocar em T = 100.0 (100%).
5. Selecionar absorbância e zerar em A = 0.000 (zero)
6. Retirar a cubeta, voltar o “branco” para o seu tubo; tocar a cubeta na posição invertida na gaze, para secar a última gota.
7. Transferir o “padrão” para a cubeta, limpá-la com gaze ou papel, colocá-la na posição correta no aparelho e tampar.
8. Fazer a leitura da absorbância do padrão (Ap).
9. Voltar o “padrão” para o seu tubo e secar a última gota.
10. Colocar a “amostra” na cubeta, limpá-la com gaze ou papel, colocá-la na posição correta no aparelho e tampar.
11. Fazer a leitura da absorbância da amostra (Aa).
12. Colocar a “amostra” em seu tubo.
13. Determinar a concentração da amostra.

Atividades:

1. Determine a concentração da amostra:

Dado: λ (comprimento de onda) = 505 nm

Cp = 200 mg/dL

Leitura do Padrão = ___________

Leitura da Amostra = ___________
CA = __________

Técnica:

Branco Padrão Teste

Reagente de cor 2 mL 2 mL 2 mL
Padrão ----- 20 L -----
Amostra ----- ----- 20 L

Homogeneizar
Incubar no banho-maria a 37 ºC por 5 min.
Ler no espectrofotômetro ( = 505 nm) as absorbâncias do padrão e da amostra.
Realizar o cálculo da concentração da amostra.

Cálculo:

Cp
CA AA
Ap  CA = _____________

2. Determine a concentração de glicose:

Dado: λ = 500nm
Cp = 100mg/dL

Leitura do Padrão = ___________

Linearidade = 400mg/dL
Leitura da Amostra = ___________
CA = __________
Técnica:
 Branco Padrão Teste
Reagente de cor 2 mL 2 mL 2 mL
Padrão ----- 20 L -----
Amostra ----- ----- 20 L

Homogeneizar
Incubar no banho-maria a 37 ºC por 5 min.
Ler no espectrofotômetro ( = 520 nm) as absorbâncias do padrão e da amostra.
Realizar o cálculo da concentração da amostra.
Verificar se a concentração da amostra está dentro da linearidade.

Cálculo:

Cp
CA AA
Ap  CA = ___________

Causas de erros nas dosagens bioquímicas

Pipetagem dos reagentes de maneira inadequada (pipeta inclinada, não levantá-la à altura dos olhos, etc.). Obs: quando o
líquido for límpido, zerar pelo menisco inferior, se opaco, zerar pelo menisco superior.
Erro na pipetagem da amostra (não rinçar a ponteira da amostra várias vezes; não observar se o volume aspirado pela
micropipeta está correto; conter bolhas de ar na ponteira da micropipeta; não homogeneizar a amostra corretamente).
Erros no momento da coleta: hemólise devido à coleta difícil; paciente não estar em jejum, quando este for necessário;
paciente garroteado por muito tempo; bater no braço do paciente.
Impurezas, como por exemplo, detergente na vidraria.
A má qualidade dos reagentes.
A má conservação dos reagentes.
A má conservação da amostra.
Má qualidade da água utilizada no preparo dos reagentes.
Não observar o tempo para a estabilização dos aparelhos; não zerar o aparelho corretamente; não utilizar o comprimento
de onda adequado.
Não observar o tempo necessário para que os reagentes atinjam a temperatura ambiente, quando exigido na técnica.
NOÇÕES BÁSICAS DAS COLETAS SANGUÍNEAS
Conhecendo os vasos sanguíneos

Artérias: Vaso muscular elástico, de parede espessa e carregam sangue rico em oxigênio do coração para o corpo. Elas se
ramificam em vasos cada vez menores, que acabam desembocando em capilares. Suas funções são controlar o fluxo de sangue no
interior dos tecidos e transportar sangue sob alta pressão aos tecidos.

Subclávias Esquerdas e Direitas levam o sangue aos membros superiores. No braço recebe o nome de braquial, e no
cotovelo se divide em artéria radial e ulnar, que caminham paralelas aos ossos de mesmos nome.
Arteríolos são os últimos pequenos ramos do sistema arterial e atuam como válvulas de controle através das quais o
sangue é liberado para dentro dos capilares.

CLASSIFICAÇÃO QUANTO AO CALIBRE

Elásticas ou Grandes -7 mm (Ex: aorta, subclávia)

Distribuidoras ou Médias - 2,5 e 7 mm (maioria)
Pequeno - 0,5 e 2,5 mm
Arteríola - < 0,5 mm diâmetro
ESCOLHA DO LOCAL DA PUNÇÃO ARTERIAL

Alguns trechos de artérias profundas apresentam trajetos superficiais, disto se aproveitam os médicos para aplicações
práticas. A artéria Radial é superficial na extremidade distal do antebraço. Também a Femoral, Temporal e a dorsal do pé, possuem
trechos superficiais.
Punções arteriais são tecnicamente mais difíceis do que as venosas. O aumento da pressão nas artérias dificulta à cessação
do sangramento, trazendo como consequência a formação indesejável do hematoma. Locais impróprios que não devem ser
escolhidos: Locais irritados, edematosos, próximos a uma ferida ou cicatriz, em área de junção arteriovenosa (AV) ou fístula.
Espasmo arterial é um reflexo da constrição da artéria que diminui o fluxo sanguíneo com possíveis consequências graves
na circulação e perfusão tecidual. Sintomas de desconforto temporário podem ser expressos como dor, palpitação, sensibilidade,
excitamento agudo e cãibra. Às vezes é impraticável ou impossível obter sangue arterial de um paciente.
A Radial é preferida em adultos devido sua localização superficial. A Ulnar proporciona excelente fluxo colateral.
A Braquial tem mau fluxo colateral, próxima ao periósteo, veias e nervos e pode ser difícil de ser comprimida. Músculos e tendões
não sustentam a artéria e ocorre maior risco de lesão das estruturas vizinhas e de hemorragias. Já a Femoral é grande e fácil, porém
há o risco de infecção. Não se pode realizar em idosos com prevalência de arteriosclerose e pacientes com cirurgia vascular.

Veias: São vasos que levam o sangue do corpo ao coração. Suas paredes são menos espessas que as das artérias porque o sangue
circula em seu interior a uma pressão mais baixa. Com frequência, elas estão parcialmente cheias de sangue e, assim parecem
murchas, com é vista na transversal. São importantes reservatórios: a qualquer momento abrigam cerca de 65% do sangue do
corpo. Funcionam como condutores para o transporte do sangue dos tecidos de volta ao coração, mas o que é mais importante –
servem como grande reservatório de sangue. A pressão do sistema venoso é muito baixa, sendo as paredes venosas finas, mesmo
assim são musculares, permitindo a contração ou expansão funcionando como um reservatório controlável para o sangue extra,
quantidade pequena ou grande, dependendo das necessidades do corpo.
ESCOLHA DO LOCAL DA PUNÇÃO VENOSA

As veias superficiais não acompanham artérias. Devido à sua

situação subcutânea, é de escolha para aplicações de injeções e
coleta de sangue.

ERROS DURANTE A PUNÇÃO

LOCAIS QUE DEVERÃO SER EVITADOS

Vaso de pequeno calibre ou muito profundo.

Vaso esclerosado ou trombosado processo patológico de pele, como esclerodermia (pele endurecida e grossa).
Terapia intavenosa por longo período (veias “danificadas” ou ocluidas).
Terapia intavenosa atual (não utilizar esta veia para punção).
Área com sangramento, causadas por deficiência de fatores da coagulação, medicamentos que alteram a função
plaquetária, técnica inadequada de punção, sangramento local por mais de 10 min.
Área com fístual arteriovenosa, ocorrendo risco de lesão traumática.
Área com cicatriz, devido à Fístul.

Capilares: São os mais numerosos vasos sanguíneos, microscópicos com diâmetro equivalente a um décimo de um fio de cabelo e
interpostos entre artérias e veias. A sua função é levar sangue as células, fornecendo-lhes nutrientes e oxigênio, removendo
resíduos inaproveitáveis. Suas paredes finas permitem a troca fácil de matérias entre o sangue e as células.