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Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas de la Salud
Licenciatura en Qumica Farmacutica Biolgica
Obtencin de Metabolitos de Inters Industrial para la Salud
OBTENCIN DE
-FRUCTOFURANOSIDASA POR
K l u y v e r o m i c e s m a r x i a n u s A PA R T I R
DE SACAROSA COMO FUENTE DE
CARBONO
Contenido
Introduccin ............................................................................................................... 1
Marco terico ............................................................................................................. 1
Enzimas.............................................................................................................................. 1
Levadura ............................................................................................................................ 2
Kluyveromices marxianus ............................................................................................... 2
-fructofuranosidasa o invertasa (EC 3.2.1.26)............................................................. 2
Produccin y regulacin catablica de enzimas .......................................................... 3
Mtodos analticos ........................................................................................................... 4
Cintica enzimtica ................................................................................................................................. 4
Concentracin de substrato................................................................................................................... 4
VMX ........................................................................................................................................................... 6
KMX ........................................................................................................................................................... 6
Efecto del pH sobre la actividad enzimtica ....................................................................................... 7
Temperatura ............................................................................................................................................ 8
Concentracin de enzima ...................................................................................................................... 9
Inhibicin enzimtica .............................................................................................................................. 9
Hiptesis................................................................................................................... 10
Objetivos .................................................................................................................. 10
Metodologa ............................................................................................................. 10
Microorganismo .............................................................................................................. 10
Medios de cultivo ............................................................................................................ 10
Inculo .................................................................................................................................................... 10
Fermentacin ......................................................................................................................................... 11
REFERENCIA ........................................................................................................... 18
Introduccin
La importancia de las enzimas en la biotecnologa ha ampliado su campo de aplicacin en
la industria utilizndolas como herramientas para mejorar la produccin y la obtencin de
metabolitos.
Para la produccin de estos metabolitos se utilizan microorganismos los cuales pueden
ser bacterias, hongos y levaduras.
De estas ltimas podemos localizar al Kluyveromices marxianus, que forma parte de la
clase Ascomicetos, familia Saccharomycetaceae, sub-familia Saccharomycetoideae, del
gnero Kluyveromices y de la especie marxianus.
K. marxianus es una levadura utilizada en la industria debido a que una de sus
propiedades ms importante es la produccin de enzimas nativas, como fructofuranosidasa, -galactosidasa y pectinasas. La -fructofuranosidasa es un tipo de
enzima reprimible con actividad de invertasa.
Marco terico
Enzimas
Las enzimas presentan diversas ventajas sobre los catalizadores qumicos. Una de las
ms importantes es su especificidad para determinadas reacciones. Esta especificidad se
limita a una sola o a un grupo muy restringido de sustancias qumicas relacionadas con
ella, y excluye reacciones colaterales, con lo que se eliminan subproductos indeseables;
traducindose esto en un incremento de la productividad.
Estas catalizan las reacciones bajo condiciones moderadas de temperatura, presin y pH.
Esto disminuye los requerimientos energticos, y por tanto, los costos de produccin.
Las enzimas se encuentran en cualquier organismo vivo: plantas, animales o
microorganismos. Estos ltimos son la fuente preferida a nivel industrial, debido a que
presentan ventajas importantes en su produccin, como:
La sntesis de enzimas es ms predecible y controlable
Se cuenta con un amplio espectro de caractersticas, tales como intervalos de pH,
resistencia a altas temperaturas
Existe suficiente disponibilidad de materias primas con una composicin
relativamente constante
Su produccin no est sujeta a variaciones estacionales, ni existe riesgo de
escasez por cambios climticos o situaciones geogrficas
La manipulacin gentica ha incrementado considerablemente las posibilidades de
optimizar los rendimientos a travs de mutaciones, de seleccin de cepas y de
condiciones de crecimiento y ms recientemente, mediante la tecnologa del DNA
recombinante.
Levadura
Las levaduras son los microorganismos ms importantes desde el punto de vista
industrial, porque muchas de las especies pueden convertir los azucares en alcohol etlico
y dixido de carbono. Participan en la produccin de cerveza, vino, glicerol y dems. Las
clulas de levadura se utilizan tambin en la industria de la panificacin y como alimento
animal y humano, por su alto contenido proteco. (Hernndez, 2001)
Las levaduras son hongos microscpicos que, en un estadio de su ciclo biolgico, se
presentan en forma unicelular y se multiplican por gemacin. Este grupo de
microorganismos comprende unos 60 gneros y unas 500 especies. Se agrupan
principalmente en dos clases Ascomycotina y Basidiomycotina.
Entre las levaduras de uso industrial se encuentran Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces ellipsoideus, Kluyveromices marxianus. Siendo esta ultima el eje de la
investigacin.
Kluyveromices marxianus
Kluyveromices marxianuses una de las dos levaduras que ms abundan en los productos
lcteos. Produce -galactosidasa y son fermentadoras potentes de los azcares, incluida
la lactosa (Jay, 1999), es capaz de hidrolizar la lactosa y de fermentar la galactosa. Posee
estatus GRAS (Generally Recognized As Safe) y QPS (Qualified Presumption of Safety),
es decir, se considera segura para su uso en la industria de alimentos.
K. marxianus sintetiza dos tipos de invertasa; interna y externa, ambos tipos de enzima
presentan la misma actividad especfica sobre sacarosa.
qumicas que podran ser trasladadas y amplificadas por monofosfato de adenina cclico
(cAMP) en el ncleo celular comenzando la induccin de la sntesis de invertasa a nivel
de ADN. El ARNm podra trasladar la informacin de la sntesis de invertasa a los
ribosomas, para despus ser sintetizada y secretada al espacio periplsmico, o bien en la
pared celular. (Figura 1)
Mtodos analticos
Cintica enzimtica
La cintica enzimtica estudia el mecanismo, velocidad y los factores que modifican las
reacciones catalizadas por enzimas. Los factores que estudiaremos son la concentracin
de substrato, temperatura, pH, concentracin de enzima, e inhibidores enzimticos.
Concentracin de substrato
La concentracin del substrato tiene un efecto importante en la velocidad de las
reacciones enzimticas. El anlisis del efecto del cambio de concentracin de substrato,
proporciona informacin respecto del mecanismo de reaccin, especificidad y
propiedades cinticas de las enzimas.
En 1902, al estudiar la cintica de la hidrlisis de Sacarosa, Adrian Brown descubre la
saturacin de la enzima Invertasa (EC 3.2.1.26) y propone que la reaccin se efecta en
dos etapas, primero la enzima (E) y el sustrato (S), se unen para formar un complejo (ES):
Con base en este supuesto, proponen el modelo del Equilibrio Instantneo para
determinar la relacin entre la concentracin de substrato y la velocidad de las reacciones
enzimticas y obtienen una relacin matemtica que describe dicho efecto, la cual se
conoce como la ecuacin de Michaelis y Menten:
Donde:
v = velocidad de la reaccin
[S] = Concentracin de substrato
VMAX = Mxima actividad enzimtica
KM = Constante de Michaelis
VMX
Es la mxima actividad que puede alcanzar una enzima, tericamente se logra en
condiciones de [S] grande, porque entonces la enzima se satura y trabaja tan rpido como
es posible. En la prctica es imposible que la enzima alcance el valor de VMAX, debido a
limitaciones de difusin de productos y sustratos, desde y hacia el sitio activo. (Aldave,
2004)
KMX
Si la suposicin de Michaelis y Menten es vlida, KM es la constante de disociacin de ES
a E + S, igual a k-1/k1. Por lo tanto, es una medida de la afinidad de la enzima por su
substrato. Si KM es grande significa que k-1 es grande o que k1 es pequea por lo que la
reaccin inversa es ms favorecida que la reaccin directa y con ello la afinidad de la
enzima por su substrato es baja. Por el contrario, si KM es pequea, la afinidad de la
enzima por el substrato es grande.
Por otro lado, segn Briggs y Haldane, KM representa el cociente (k-1 +k2)/k1, este
cociente sigue siendo la constante de disociacin de ES, pero ahora tanto hacia S como
hacia P, porque se supone que k2 contribuye en forma significativa a la desaparicin de
ES. De cualquier manera, valores de KM grandes representan baja afinidad por el
substrato y valores pequeos afinidad alta.
El valor de KM tambin corresponde a la concentracin de S en la cual v = V MAX/2, que se
interpreta como la concentracin a la cual la enzima est saturada slo a la mitad.
corporales o de tejidos por dao o muerte celular, puede ocasionar la desnaturalizacin de las enzimas.
2. Las variaciones de pH ms pequeas, entre 4 y 10, afectan a un nmero menor de
grupos ionizables, pero si stos estn presentes en el sitio activo, la actividad
enzimtica cambia en forma importante. Sin embargo, este cambio normalmente
es reversible.
3. La variacin del pH tambin puede alterar la ionizacin del substrato, y modificar la
unin enzima substrato.
Para muchas enzimas, el efecto del pH tiene forma de campana con un valor de pH
ptimo bien definido, pero para otras, la forma de la curva es muy diferente; por ejemplo,
cuando en la interaccin enzima substrato participan muchos grupos ionizables. Los
puntos de inflexin de la curva pH/actividad corresponderan a los pK de los grupos
responsables de la dependencia frente al pH. Este tipo de informacin se ha utilizado para
identificar de los aminocidos del sitio activo.
Temperatura
Igual que ocurre en las reacciones qumicas, al aumentar la temperatura aumenta la
velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Esto se debe a que un mayor
nmero de molculas alcanzan la energa cintica necesaria para superar la energa de
activacin de la reaccin. Sin embargo, el aumento de temperatura tambin disminuye la
estabilidad de la estructura de las protenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse,
de modo que a medida que aumente la temperatura la actividad enzimtica tiende a bajar.
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura, existe una
Temperatura ptima en la cual la actividad enzimtica tiene un mximo. Es de suponer
que a la temperatura normal de los organismos las enzimas sean estables, y por lo tanto
estn por debajo de su temperatura ptima. (Aldave, 2004)
Concentracin de enzima
Como se explic antes, la velocidad de la actividad enzimtica, depende de la constante
cataltica y la concentracin del complejo enzima substrato
Inhibicin enzimtica
Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a las enzimas y disminuyen su
actividad. Las clulas emplean como inhibidores molculas de intermediarios metablicos
Hiptesis
La enzima -fructofuranosidasa producida por K. marxianus a partir de un medio rico en
sacarosa, presenta actividad enzimtica. Si se cambian las condiciones ptimas de
temperatura, pH y efecto de cationes modificara su actividad enzimtica
Objetivos
Analizar la actividad de la enzima -fructofuranosidasa mediante ensayos enzimticos y
parmetros cinticos de crecimiento.
Obtencin de la enzima -fructofuranosidasa.
Compara la actividad enzimtica mediante dos fuentes de carbono (sacarosa y
glucosa)
Modificar y evaluar las condiciones de la -fructofuranosidasa (pH, temperatura y
efecto de cationes).
Determinar parmetros cinticos y obtencin de Vmx y Km.
Metodologa
Microorganismo
Para este estudio se utilizara la levadura Kluyveromyces marxianus.
Medios de cultivo
Inculo
Se prepararan 50 mL del medio. Con una composicin de 5% de sacarosa, 0.5% de
extracto de levadura y 5 mg de ampicilina.
10
Fermentacin
Se utilizaran 2 medios de cultivo para la fermentacin, de acuerdo al control que se
requiere:
Control negativo
Se prepararan 150 mL con una composicin de 0.5 % de extracto de levadura y 1% de
glucosa.
Control positivo
Se prepararan 150 mL con una composicin de 0.5% de extracto de levadura y 1% de
sacarosa.
Todos los medios de cultivo se preparan en matraces de 250 mL con tapn de algodn, y
se ajustan a un pH de 4.5, esterilizar a 10 lb de presin por 10 minutos.
Condiciones de cultivo
Todos los medios de incuban a 30C con agitacin de 180 rpm.
Mtodos analticos.
Determinacin de azcares reductores
Realizar una curva de calibracin y cuantificar los azucares reductores por el
mtodo propuesto Miller,G.L.(1959)
11
Glucosa
H2O
H2O
(ml)
(ml)
0.0
1.5
1.5
5 min
7.5
0.1
1.4
1.5
100
5 min
7.5
0.2
1.3
1.5
200
5 min
7.5
0.4
1.1
1.5
400
5 min
7.5
0.6
0.9
1.5
600
5 min
7.5
0.8
0.7
1.5
800
5 min
7.5
1.0
0.5
1.5
1000
5 min
7.5
(ml)
Cuantificacin de protenas.
Realizar la curva de calibracin con BSA como estndar y cuantificar las protenas
mediante la tcnica propuesta por Lowry,H y cols. (1951) Tabla 2.
Preparar la solucin estndar y procedimiento:
12
Std albmina
(ml)
Folin 1:1
(ml)
0.3
0.125
12.5
0.875
0.3
0.250
25
.750
0.3
0.500
50
.500
0.3
0.750
75
.250
0.3
1.0
100
0.3
Actividad enzimtica
0.8
4.0
50 C
0.1
DNS
despus
de
30
min
3
0.1
13
pH
4.0
Muestra Agua
de
destilada
clulas
(mL)
(mL)
0.2
0.8
Sol.
Estndar
de
sacarosa
5%(mL)
Temperaura
de
incubacin
4.0
50 C
Muestra
T=0
min
(mL)
Muestra
T=30
min
(mL)
0.1
3
0.1
5.0
0.2
0.8
4.0
50 C
0.1
0.2
0.8
4.0
50 C
0.1
0.2
0.8
4.0
50 C
0.1
0.2
0.8
4.0
50 C
3
3
0.1
8.0
3
3
0.1
7.0
3
3
0.1
6.0
DNS
despus
de
30
min
0.1
3
3
0.1
14
Efecto de la temperatura.
Preparar una solucin estndar de sacarosa 5% en amortiguador de acetatos pH
5.0. Esta reaccin deber realizarse a diferentes temperaturas, durante 30 min,
con agitacin constante. Tabla 5.
Tabla 5.Determinacin de temperatura
Muestra
de
clulas
libres
(mL)
Agua
destilada
(mL)
Sol. Std
Sacarosa
(mL)
Temperatura
Muestra
1
Muestra
2
T=0 min
T=30 min
(mL)
(mL)
0,1
0.1
DNS
despus
de 30
min (mL)
3
0.2
0.8
40 C
3
3
0.2
0.8
50 C
0.1
0.1
3
3
0,2
0.8
60 C
0.1
0.1
3
3
0.2
0.8
70 C
0.1
0.1
3
3
0.2
0.8
80 C
0.1
0.1
3
15
Mg2+
0.2
0.8
4.0
50 C
0.1
3
0.1
Fe3+
0.2
0.8
4.0
50 C
0.1
3
0.1
Cu2+
0.2
0.8
4.0
50 C
0.1
0.2
0.8
4.0
50 C
0.1
3
3
0.1
3
3
0.1
Zn2+
Observar Tabla 7.
16
t1
t2
t3
10
2.5
0.5
0.25
17
REFERENCIA
1. Hernndez, A. (2001) Microbiologa Industrial Ed. Trillas, 1ra Ed. pg. 7
2. Jay, M. (1999) Microbiologa moderna de los alimentos 4ta edicin Editorial
ACRIBIA, S.A.
3. Monroy. M, Ordorica, M. A. (2004), Termodinmica, Cintica y Enzimas
file:///C:/Users/V5%20Touch/Documents/Unidad41.pdf Actual 06/03/14 1:47 p.m.
4. Aldave, M. Jorrn J. (2004) Estudio cintico de la actividad invertasa de levadura
de panadera. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular.
5. Hestrin S, Feingold DS, Schramm M (1998): -Fructofuranosidade (invertase) from
yeast. Methods in Enzymology 1: 251-257.
6. Lampen JO (1980): Yeast and Neurospora invertases. En: Boyer PD (ed): The
Enzymes, 3 ed. Vol V. Academic Press (New York, USA), pp 291-305.
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