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Fasi cruciali

Scelta della patologia da analizzare


Scelta del campione da analizzare
Scelta dellapproccio da utilizzare
Scelta della tecnica da utilizzare
Analisi statistica del dati
Conferme con approcci indipendenti

Patologie da analizzare
Patologie con base genetica dimostrata
Analisi della ricorrenza familiare

Patologie ad ampia diffusione nella popolazione


Necessit di campioni numerosi

Patologie per le quali la conoscenza delle basi


genetiche porti un beneficio
Comprensione delle basi biologiche
Messa a punto di nuove strategie terapeutiche
Prevenzione

Scelta del campione da analizzare


Accurata valutazione clinico-strumentale
Selezione scrupolosa dei controlli
Sovrapponibilit dei gruppo dei pazienti e di
quello dei controlli per:
Sesso
Et
Etnia

Scelta dellapproccio da utilizzare


Analisi di linkage
Studi di associazione
Approccio del gene candidato

MUTAZIONE

POLIMORFISMO:

< 1% popolazione

> 1% popolazione

Alterazioni sul DNA


Diversa la loro frequenza!

Mutazioni e polimorfismi
In regioni codificanti (esoni):
Cambio di nucleotidi:
-silente (non cambia amminoacido)
- di senso (cambia aa)
-di non senso o di stop (codone per un aa diventa
codone di stop: proteina tronca)
Inserzioni o delezioni:
-frameshift (slittamento del codice di lettura)

Polimorfismi
In regioni ripetute non codificanti:
Cambio del numero di ripetizioni

Scelta dellapproccio da utilizzare


Analisi di linkage
Studi di associazione
Approccio del gene candidato
Consentono di identificare geni che si presume siano coinvolti
nell'insorgenza di diverse malattie

Analisi di linkage

Si basa sullo studio della trasmissione di marcatori di


DNA allinterno di famiglie in cui segrega una certa
malattia

Utili per localizzare loci di malattie monogeniche

Analisi di linkage
Ricordando che per la II legge di Mendel due caratteri differenti sono
ereditati in modo indipendente
lanalisi di linkage parte dal presupposto che due marcatori vicini NON
segregano in modo indipendente

Analisi della co-segregazione degli alleli di diversi marcatori


allinterno di una famiglia di individui.
E possibile in questo modo costruire gruppi di marcatori la cui
probabilit di essere associati significativamente pi elevata
della probabilit di essere indipendenti
Limite principale: scarso potere di risoluzione
(indicano una regione contenente potenziali geni di suscettibilit ma non
consentono di localizzare tali geni)

Studi associazione genome wide


Analizzano la
associazione tra
alcuni marcatori
genici e soggetti
affetti e non affetti
nella popolazione
indipendentemente
dalla familiarit

Utile per lo studio di


tratti complessi

Studi associazione genome wide


verificano lesistenza di una correlazione tra alleli specifici ed una
determinata malattia in una popolazione
basandosi sulla comparazione delle frequenze alleliche di varianti geniche
polimorfiche nei pazienti e nei controlli sani (popolazione di controllo)
Genotipo positivamente associato con la malattia (o predisponente):
se presente in maniera significativamente pi frequente nei malati rispetto
ai controlli
Genotipo negativamente associato con la malattia (o protettivo):
se presente in maniera significativamente pi frequente nei controlli
rispetto ai pazienti
Gli studi di associazione sono pi sensibili degli studi di linkage ma richiedono
lanalisi di una enorme mole di tratti di DNA oppure la conoscenza a priori di
regioni geniche candidate (implicate nella patogenesi della malattia).

Approccio del gene candidato

Si basa sullo studio in pazienti affetti e in popolazioni di controllo di geni la


cui funzione possa ipoteticamente essere correlata al carattere oggetto di
studio.

Scelta della tecnica da utilizzare


Estrazione del DNA
Amplificazione del DNA
Sequenziamento del DNA

Estrazione di DNA
Varie metodiche per
estrazione DNA
Estrazione manuale:
vari kit in commercio
(spin basket, biglie
magnetiche)
Estrattori automatici

Reazione a catena della polimerasi


(PCR)
Mezzo rapido ed economico per ottenere
grandi quantit (amplificazione) di una
specifica sequenza di DNA o RNA

Sfrutta la capacit della polimerasi di


catalizzare la sintesi di acidi nucleici a partire
da un filamento stampo

Verifica prodotti di PCR mediante


elettroforesi di acidi nucleici
Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un
campo elettrico applicato
Permette di separare i frammenti amplificati
mediante PCR

Gel Documentation System

Elettroforesi su gel

Il concetto di variante genica


La correlazione di un gene di suscettibilit con
una patologia non legata alla presenza o
assenza di quel gene, ma alla presenza di
specifiche varianti di sequenza
Per valutare la presenza di tali varianti,
necessario procedere ad una lettura della
sequenza del gene, altrimenti detta
sequenziamento genico.

Sequenziamento diretto del DNA

Mutazione in eterozigosi

Mutazione in omozigosi

Analisi statistica del dati


Poich nella genetica del comportamento la
componente genetica di suscettibilit e non
deterministica, ci si deve attendere che anche
un certo numero di controlli presenti le
varianti geniche associate alla patologia
Le analisi statistiche servono a valutare se le
differenze riscontrate tra casi e controlli siano
significative o no.

Conferme con approcci indipendenti


Per valutare se una certa variante genica sia
effettivamente associata ad un disturbo del
comportamento, necessario verificare se la
funzione svolta dal gene sia compatibile con
una sua correlazione alla patologia.

Studi di espressione genica

Modelling proteico

Studi su animali knock out


o transgenici
Permettono di verificare quale fenotipo
comportamentale si associa alla eliminazione
(KO) o allinserimento (transgene) di uno
specifico gene