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Extratos vegetais so, muitas vezes, misturas complexas constitudas

de diversos compostos com grupos funcionais diferentes. O


isolamento destas substncias, seja para identificao ou, em maior
quantidade, para a realizao de ensaios farmacolgicos, um
processo lento que acaba envolvendo grandes quantidades de
solventes extratores. Para que seja possvel separar e identificar
essas substncias removidas da amostra vegetal aps a fase
extrativa necessrio o uso de uma tcnica capaz de diferenci-las
de acordo com suas caractersticas qumicas, como interaes
intermoleculares destas com outras substncias que possam ser
empregadas. Por estes fatores que as tcnicas cromatogrficas so
de enorme importncia.
A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao que se
fundamenta na migrao diferencial dos componentes de uma
mistura devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis:
fase mvel (gs, lquido ou um fluido supercrtico) e fase estacionria
(fixa, colocada em uma coluna ou numa superfcie slida), esta
separao depende da diferena entre o comportamento dos analitos
entre as fases.
A mistura adsorvida em uma fase fixa, e uma fase mvel "lava"
continuamente a mistura adsorvida. Pela escolha apropriada da fase
fixa e da fase mvel, alm de outras variveis, pode-se fazer com que
os componentes da mistura sejam arrastados por eluio
ordenadamente. Aqueles que interagem pouco com a fase fixa so
arrastados facilmente e aqueles com maior interao ficam mais
retidos.
Os componentes da mistura adsorvem-se com as partculas de slido
devido a interao de diversas foras intermoleculares. O composto
ter uma maior ou menor adsoro, dependendo das foras de
interao, que variam na seguinte ordem: formao de sais > pontes
de hidrognio > dipolo-dipolo > Van der Waals.
Ela foi relatada pela primeira vez h pouco mais de 100 anos por
Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919). No perodo de 1899 1901
Tswett trabalhou em sua primeira pesquisa com a estrutura fsicoqumica da clorofila das plantas, sendo que no ano de 1903 relatou
uma nova categoria de anlise adsortiva (ETTRE, 2000). O trabalho de
Tswett foi apresentado em forma de tratado para a Sociedade de
Cincias de Varsvia, no qual descreveu os resultados preliminares de
suas pesquisas com extrato de folhas, utilizando uma coluna de vidro
recheada com carbonato de clcio, separando os constituintes do
extrato pela passagem de ter dietlico (COLLINS, 2006). No entanto,
as denominaes de cromatografia e cromatograma somente
surgiram no segundo trabalho de Tswett, publicado em 1906. A
palavra cromatografia designava o processo de separao, tendo sua

origem do grego chroma, com o significado de cor, e tambm do


grego graphe, significando escrever. J a palavra cromatograma
refere-se s bandas separadas na coluna (COLLINS, 2006; NOGUEIRA,
2006).
Apesar deste estudo e de outros anteriores, que tambm poderiam
ser considerados precursores do uso dessa tcnica, a cromatografia
foi praticamente ignorada at a dcada de 30, quando foi
redescoberta. A partir da, diversos trabalhos na rea possibilitaram
seu aperfeioamento e, em conjunto com os avanos tecnolgicos,
levaram-na a um elevado grau de sofisticao, que resultou no seu
grande potencial de aplicao em muitas reas.
A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos,
por comparao com padres previamente existentes, para a
purificao de compostos, separando-se as substncias indesejveis e
para a separao dos componentes de uma mistura.
As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas
considerando-se diversos critrios, sendo alguns deles listados
abaixo:

1. Classificao pela forma fsica do sistema cromatogrfico


Em relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser
subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar.
Enquanto a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel
(CP), cromatografia por centrifugao (Chromatotron) e
cromatografia em camada delgada (CCD), so diversos os tipos de
cromatografia em coluna, os quais sero mais bem compreendidos
quando classificados por outro critrio.

2. Classificao pela fase mvel empregada


Em se tratando da fase mvel, so trs os tipos de cromatografia: a
cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a cromatografia
supercrtica (CSC), usando-se na ltima um vapor pressurizado, acima
de sua temperatura crtica. A cromatografia lquida apresenta uma
importante subdiviso: a cromatografia lquida clssica (CLC), na qual
a fase mvel arrastada atravs da coluna apenas pela fora da
gravidade, e a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), na qual
se utilizam fases estacionrias de partculas menores, sendo
necessrio o uso de uma bomba de alta presso para a eluio da
fase mvel. No caso de fases mveis gasosas, separaes podem ser
obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de
alta resoluo (CGAR). A diferena entre os dois tipos est na coluna.
Enquanto na CGAR so utilizadas colunas capilares, nas quais a fase

estacionria um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de


maior dimetro empacotadas com a fase estacionria.
3. Classificao pela fase estacionria utilizada
Quanto fase estacionria, distingue-se entre fases estacionrias
slidas, lquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionria
ser constituda por um lquido, este pode estar simplesmente
adsorvido sobre um suporte slido ou imobilizado sobre ele. Suportes
modificados so considerados separadamente, como fases
quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em
seus mecanismos de separao.
4. Classificao pelo modo de separao
Por este critrio, separaes cromatogrficas se devem adsoro,
partio, troca inica, excluso ou misturas desses mecanismos. Para
se ter uma viso mais ampla dos diferentes tipos de cromatografia, os
mesmos esto dispostos no diagrama da Figura 1. Dentre os vrios
tipos de cromatografia, especial nfase ser dada cromatografia em
camada delgada (CCD) e a cromatografia em coluna ou por adsoro
(CC).

FLUXO DAS CROMATOGRAFIAS FIG 01

A cromatografia em camada delgada uma tcnica de adsoro


lquido-slido, na qual a separao se d pela diferena de afinidade
dos componentes de uma mistura pela fase estacionria (DEGANI et
al., 1998). A CCD est embasada na separao de substncias por
meio das suas diferentes velocidades de migrao em razo da
afinidade relativa com solventes, fixando-se numa fase slida (XAVIER
et al., 2007). A CCD um mtodo simples, rpido e econmico, sendo
a tcnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de
reaes orgnicas (DEGANI et al., 1998).
Neste mtodo a fase estacionria uma camada fina formada por um
slido granulado (slica, alumina ou poliamida) depositado sobre uma
placa que deve atuar como suporte inerte. Na CCD gotas da soluo a
ser separada so aplicadas em um ponto prximo ao extremo inferior
da placa. Aps a secagem da placa, ela colocada em um recipiente
contendo a fase mvel, de modo que somente sua base fique
submersa. O solvente comea a molhar a fase estacionria e sobe por
capilaridade. Aps o deslocamento da fase mvel deixasse a placa
secar, e posteriormente realizada a revelao da placa com reativos
que deem cor as substncias de interesse (PERES, 2002).

O parmetro de maior importncia na CCD o fator de reteno, que


a razo entre a distncia percorrida pela substncia e a distncia
percorrida pela fase mvel. Esse fator determinar se a substncia
analisada confere com a substncia padro (DEGANI et al., 1998).

Rf = dc / de
sendo: dc: distncia percorrida pelo componente da mistura; de:
distncia percorrida pelo componente da mistura;

FIGURA: DESENHO DA PLACA COM A EXPLICAO DO RF E TUDO


MAIS.
DEIXE UM ESPAO IDEAL PARA DUAS IMAGENS.

Na prtica, os valores de Rf obtidos em uma placa raramente se


repetem em outra, devido a fatores, como tamanho da partcula do
adsorvente, composio do solvente grau de saturao da cmara de
eluio, ativao e condies de estocagem das placas, espessura da
camada do adsorvente, etc. Os valores de Rf so, todavia,
importantes quando se faz um estudo comparativo utilizando
solues de substncias-padro aplicadas na mesma placa.

J a cromatografia em coluna uma tcnica de partio entre duas


fases, slida e lquida, baseada na capacidade de adsoro e
solubilidade. O slido deve ser um material insolvel na fase lquida
associada, sendo que os mais utilizados so a slica gel (SiO2) e
alumina (Al2O3), geralmente na forma de p. A mistura a ser
separada colocada na coluna com um eluente(solvente) menos
polar e vai-se aumentando gradativamente a polaridade do eluente e
consequentemente o seu poder de arraste de substncias mais
polares. Uma sequncia de eluentes normalmente utilizada a
seguinte: ter de petrleo, hexano, ter etlico, tetracloreto de
carbono, acetato de etila, etanol, metanol, gua e cido actico.

O fluxo de solvente deve ser contnuo. Os diferentes componentes da


mistura mover-se-o com velocidades distintas dependendo de sua
afinidade relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor
com o adsorvente) e tambm pelo eluente. Assim, a capacidade de
um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na
coluna depende quase diretamente da polaridade do solvente com
relao ao composto.

medida que os compostos da mistura so separados, bandas ou


zonas mveis comeam a ser formadas; cada banda contendo
somente um composto. Em geral, os compostos apolares passam
atravs da coluna com uma velocidade maior do que os compostos
polares, porque os primeiros tm menor afinidade com a fase
estacionria. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com
todos os compostos da mistura, ela no se mover. Por outro lado, se
for escolhido um solvente muito polar, todos os solutos podem ser
eludos sem serem separados. Por uma escolha cuidadosa das
condies, praticamente qualquer mistura pode ser separada (Figura
2).

Figura 2: Cromatografia em coluna em funcionamento.


Outros adsorventes slidos para cromatografia de coluna em ordem crescente de capacidade
de reteno de compostos polares so: papel, amido, acar , sulfato de clcio, slica gel, xido
de magnsio, alumina e carvo ativo. Ainda, a alumina usada comercialmente pode ser cida,
bsica ou neutra.

SLIDO

MASSA INICIAL
(g)

MASSA FINAL
(g)

RENDIMENT
O

--------------

--------------

--------------

RECUPERA
O

TOTAL

SLIDO

HCl
20%

NaOH
10%

H2O

EtOH

ter
de
Petrl
eo

ter
Etlico

HAc
Glacial

REAGENTES
SLIDO

SLIDO

NaHCO3 (aq)

PONTO DE
FUSO
(TERICO)

p-N,NDimetilaminobelzald
edo

PONTO DE
FUSO
(DETERMINADO
)