Biología Celular 4º Biología Luis Jesús Jiménez Cabello

Practica Biología Celular

Citoesqueleto

En esta practica de observación de citoesqueleto celular

observaremos los filamentos de actina, utilizaremos un cultivo de
células de fibroblastos de embrión de ratón, y Alexa Fluor® 488
faloidina como colorante, el cual veremos en luz UVA.

La faloidina es obtenida de la seta de Amanita phalloides. Es una

micotoxina del grupo de las falotoxinas. Su estructura es la de un
heptapéptido bicíclico. Impide en la despolimerización de filamentos
de actina, lo cual interfiere en las actividades esenciales de las
células, envenenándolas. La faloidina une la interfaz presente entre
monómeros de actina consecutivos en los filamentos de actina F; de
este modo, los estabiliza, disminuyendo la tasa de disociación en los
extremos del microfilamento. Más aún, la faloidina inhibe la actividad
hidrolasa de ATP de la actina F, redundando en una mayor
estabilización de los microfilamentos.

La actividad de la faloidina depende de la concentración en que se

encuentra en las células. A bajas concentraciones y en el citoplasma,
agrupa la actina poco polimerizada o libre y la agrega en pequeños
polímeros, sin interferir con las fibras de estrés; a niveles mayores,
induce contracción celular.

Esta toxina tiñe la F-actina en concentraciones nanomolares y es

extremadamente soluble en agua, y esta afinidad es tanto en
filamentos cortos como largos, uniéndose en un ratio estequiométrico
de una molécula de faloidina por una de actina en células musculares
y no musculares, de diferentes especies de plantas y animales;
además, el contraste entre las zonas teñidas y no teñidas es muy
grande. Se ha comprobado que las falotoxinas no son capaces de
unirse a los Monoceros de G-actina. Estas falotoxinas desplazan el
equilibrio monómero/polímero hacia el polímero, bajando la
concentración crítica de polimerización. También estabilizan la F-
actina inhibiendo su despolimerización, por citocalasinas, iones
potasio y elevada temperatura.

Las falotoxinas fluorescentes pueden también ser usadas para

cuantificar la cantidad de F-actina en las células.
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TINCIÓN

1) Tomamos la placa con los seis pocillos, en cada uno un

porta con un cultivo de células de fibroblasto de embrión
de ratón. Desechamos el medio de cultivo y procedemos a
lavar con medio PBS precalentado (para no matarlas), una
vez.

2) Fijamos las células con una solución de PBS y

paraformaldehído (PFA) al 4%. Se deja actuar durante diez
minutos.

Nos disponemos ahora a elegir qué cambios haremos en cada pocillo.

En nuestro caso, numeramos cada pocillo, y tomamos el pocillo
número 1 como control conteniendo esta solo un 0,3 % de Triton X-
100. El Triton es un detergente, que agujerea las membranas
celulares. El pocillo 2, 3 y 4 tendran la misma cantidad de la toxina
Faloidina pero variara la concentración de triton en las placa 3 y 4
que serán de un 0,5% y 0,1% respectivamente y el pocillo 2 tendra la
misma concentración que el pocillo de control. Luego en lo pocillos 5
y 6 se mantendrá la misma concentración de triton que el pocillo
control y lo que variara será los μl de toxina y que serán 7 μl y 3 μl
respectivamente.
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3) Se retira la solución y se lava dos veces con medio PBS.

Las células ya están fijadas, así que se puede trabajar
mejor con ellas.

4) Procedemos a fijar con una solución de Triton X-100 al

0,3% al pocillo 1(control), 2, 5 y 6; al 0,5% al pocillo 3 y al
0,1 al pocillo 4 durante 15 minutos. Se verterán 500µl por
pocillo. El Triton es un detergente, que agujerea las
membranas celulares, para que así la solución de tinción
actúe mejor.
5) Se retira la solución una vez pasado el tiempo y se prepara
la solución de tinción, y se deja entre 20 y 30 minutos. Se
vierten en cada pocillo 200µl de disolución.
6) Se incuba a 37ºC.

MONTAJE

Tras la incubación se retira el medio y se lava con PBS unas 3 veces.

Cogemos 6 portas, uno por pocillo, y en cada uno de ellos ponemos
una gota del medio de montaje (PBS y glicerol en relación 1:1).

Se saca el porta del pocillo, se seca un poco con papel de filtro, y se

coloca sobre el porta con solución de montaje, con la cara donde
están las células en contacto con la solución. Se sella con laca de
uñas.