Inmovilizacin

Enzimtica

Actividad Enzimtica
1. Resumen
Las enzimas son el medio por el cual los organismos canalizan el flujo de energa y
materia. En la actualidad, como resultado de la acumulacin de datos procedentes de la
dinmica de las protenas (estudios de movimiento conformacional) y del anlisis del
hacinamiento macro molecular, la investigacin de enzimas est experimentando
cambios revolucionarios. (URL)
Evaluar la cintica enzimtica de la invertasa durante el desarrollo de la reaccin
qumica y su relacin con el tiempo, permite comprender el efecto de los factores que la
pueden modificar la velocidad de reaccin. Principalmente para esta prctica, se
evaluara el efecto de concentracin, a temperatura constante 37C, tras la aplicacin del
GOD PAP, si se extraen volumen de muestras dentro de un determinado tiempo y se
llevan a refrigeracin, la actividad disminuye debido a que el enzima, como cualquier
otra protena, sufre procesos de desnaturalizacin y, por lo tanto, de inactivacin.
Pasado el periodo de incubacin se toman 1 ml en celdas de cuarzo determinndose la
absorbancia a 510nm de la mezcla problema utilizando como blanco la mezcla de
ensayo del blanco de sustrato. A partir de los valores de absorbancia y tiempo de
incubacin se pueden determinar los valores de actividad enzimtica.
2. Introduccin
Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que actan como catalizadores en
todas las reacciones del metabolismo. Las enzimas dems de ser consideradas como
catalizadores, son capaces de reconocer sobre que sustancia van a actuar y tambin son
capaces de provocar una transformacin (Sapag, M., et al)
La invertasa es una enzima que convierte la sacarosa en glucosa y fructosa, esta enzima
es procedente de cepas especiales de levadura. La invertasa es una Bfructofuranosidasa: el pH ptimo de inversin es de 4,5 y presenta una mxima
actividad a una temperatura entre 50-60C. El azcar invertido, por el alto contenido de
fructosa libre, es ms soluble en agua, presenta un poder edulcorante ms elevado (es
ms dulce) que una disolucin de sacarosa de igual concentracin y una viscosidad
mayor.
Los mtodos de ensayo enzimtico son mtodos que miden las actividades enzimticas,
mediante el cual se puede medir indirectamente la cantidad de enzima activa presente.
Especficamente la actividad enzimtica expresa la cantidad de sustrato convertido o la
cantidad de productos producidos, por unidad de tiempo, teniendo en cuenta el volumen
de reaccin (Herrera, C., et al., 2003)
En los ensayos espectrofotomtricos puede seguirse el curso de una reaccin
observando cmo cambia la luz absorbida por la solucin en la que se est dando la
reaccin. Para poder utilizar un ensayo de este tipo debe haber entre los sustratos o los
productos alguno que absorba luz a una longitud de onda determinada, y que sea la
nica molcula de la mezcla de reaccin que lo hace a la misma; de esta forma, se puede
observar el aumento o la disminucin de la absorbancia a dicha longitud de onda.

Inmovilizacin
Enzimtica

3. Mtodos y materiales utilizados

El mtodo utilizado fue anlisis cuantitativo por espectrofotometra, en donde se
determina la actividad enzimtica aprovechando la absorcin de radiacin
electromagntica en la zona del ultravioleta y visible del espectro de la muestra a
analizar y se emplean para su ejecucin, los siguientes materiales:

Agitadores de vidrio.
Agua destilada.
Balanza analtica.
Bao de termostato.
Beakers.
Celdas para espectrofotmetro.
Cinta para rotular.
Erlenmeyers.
Esferas de la Enzima invertasa inmovilizada en alginato de calcio.
Esferas de la Levadura inmovilizada en alginato de calcio.
Esptula.
Espectrofotmetro.
Kit GOD PAP (Reactivo para la determinacin fotomtrica de glucosa)
Micropipeta.
Pipetas.
Plancha de calentamiento
Reloj.
Sacarosa
Toallas absorbentes.
Tubos de ensayo.
Vidrio de Reloj.

La experimentacin se realiza con invertasa inmovilizada en alginato de calcio y

levadura inmovilizada en alginato de calcio. A continuacin se describe
cronolgicamente cada uno de los pasos realizados:
Actividad enzimtica Invertasa
Colocar

en un Erlenmeyer 20mL de solucin de sacarosa al 30%.

1 gramo de esferas de invertasa inmovilizada en alginato de calcio y
agregarlas al Erlenmeyer.
Llevar el Erlenmeyer al bao termostadado graduado a 45C
Con ayuda de una pipeta tomar 2mL de la solucin del beaker en el tiempo 0min,
y colocarlos en un tubo de ensayo en el refrigerador.
Con ayuda de una pipeta tomar 2mL de la solucin del beaker en el tiempo 1min,
y colocarlos en un tubo de ensayo debidamente marcado, colocar el tubo de
ensayo en el refrigerador.
Repetir este proceso para los tiempos 3min, 6min, 10min y 20 min.
Al finalizar los 20 minutos y tener los 6 tubos de ensayo, retirarlos del
refrigerador.
Pesar

Inmovilizacin
Enzimtica
Tomar

100L del tubo de ensayo tiempo 0 y depositarlos en otro tubo de ensayo,

agregarle 1mL de reactivo GOD PAP.
Colocar el tubo en el bao de agua termostato a 37C por 10 min.
Repetir este proceso para las muestras tiempo 1min, 3min, 6min, 10min y 20 min.
Leer las absorbancias de cada tubo a 510nm.
Actividad enzimtica Levadura
Colocar

en un Erlenmeyer 80mL de solucin de sacarosa al 30%.

Pesar 10 gramos de esferas de levadura inmovilizada en alginato de calcio y
agregarlas al Beaker.
Llevar el Erlenmeyer al bao termostatado graduado a 37C por 2 horas.
Transcurrido el tiempo observar las burbujas generadas.

Grupo de Imgenes N. 01 Resumen del Procedimiento.

4. Resultados

Inmovilizacin
Enzimtica
Imagen N. 01. Hidrolisis de la sacarosa.

Actividad enzimtica invertasa

Tiempo (min)
Blanco
0 min
1 min
3 min
6 min
10 min
20 min

Absorbancia
0
0,034
0,308
0,547
0,601
0,701
0,867

Tabla N. 01 Absorbancia a tiempos determinados.

Actividad Levadura
Transcurridas las 2 horas de reaccin se observa la aparicin de unas pocas y pequeas
burbujas.
La composicin del reactivo enzimtico es la siguiente:
Buffer fosfato pH 7.0
Glucosa oxidasa (Aspergillus Nger)
Peroxidasa
4-Aminoantipirina
Acido p-Hidroxibenzoico
Azida sdica
Estabilizantes y preservantes no reactivos

75mM
15000U/I
2000 U/I
0.5 mM
10mM
0.1 g/dL
c.s.

Tabla N. 02 Composicin del GOD PAP

Grafica N. 01. Seguimiento a la Produccin de glucosa.

Para cuantificar la glucosa producida en cada punto se emplea la relacin proporcionada

por el docente que dice que 0,1mg/mL de glucosa presentan un dato de absorbancia de
5

Inmovilizacin
Enzimtica

0,322, teniendo en cuenta esta relacin se haya la concentracin de glucosa para cada
punto.
Absorbancia
0.034
0.308
0.547
0.601
0.701
0.867

Concentracin glucosa
(mg/mL)
0,010
0,095
0,169
0,186
0,217
0,269

Tabla N. 03 Concentracin de glucosa.

Grafica N. 02. Concentracin de glucosa vs absorbancia

5. Discusin de los resultados

En esta prctica se determin la actividad enzimtica de la invertasa, mediante el
seguimiento a la reaccin de hidrolisis de la sacarosa. Inicialmente se puso a reaccionar
la invertasa inmovilizada en una matriz de alginato de calcio, en una solucin de
sacarosa a 45C, temperatura que es propicia para que la invertasa pueda catalizar la
reaccin y la sacarosa se hidrolice y produzca glucosa y fructosa.
La reaccin observada en la Imagen N. 01 Esta reaccin fue frenada por choque trmico
en diferentes momentos (Tiempo 0min, 1min, 3min, 6min, 10min y 20 min),
posteriormente se emple el kid reactivo GOD PAP para lograr cuantificar por mtodos
espectrofotomtricos la cantidad de glucosa producida en la reaccin de hidrolisis de
sacarosa.
Este kid reactivo GOD PAP se basa en que la glucosa reacciona con el reactivo
enzimtico que contiene una mezcla de las enzimas Glucosa Oxidasa (GOD) y
Peroxidasa (POD). En la primera etapa la Glucosa es oxidada a Ac. Glucnico por la
accin de la enzima GOD, liberndose como producto H2O2, el cual en una reaccin
mediada por la enzima POD, reacciona con el Ac. p-Hidroxibenzoico y 4Aminoantipirina producindose un compuesto coloreado con un mximo de absorcin a
6

Inmovilizacin
Enzimtica

505 nm., en cantidad proporcional a la cantidad de Glucosa presente en la muestra

(Grupo Mexlab).

Con los resultados obtenidos se realiza la grfica 1 que representa el seguimiento de la

reaccin de hidrolisis de sacarosa mediante la produccin de glucosa. de estos
resultados es posible obtener la grfica 2.
En la grfica 1 se observa el aumento en la absorbancia en los diferentes tiempos
demuestra que la enzima invertasa est ejerciendo su funcin como catalizador de la
hidrolisis de la sacarosa con la produccin de glucosa y fructosa, y a mayor cantidad de
glucosa producida la absorbancia y por consiguiente la concentracin de glucosa en la
muestra ser mayor.
Adicionalmente se observa que la grfica obtenida es de tipo exponencial, en donde en
la primera fase la actividad de la enzima crece rpidamente, luego se observa una
tendencia estacionaria, en donde la actividad enzimtica disminuye levemente.
Los resultados muestran que la inmovilizacin de la enzima invertasa en alginato de
calcio, no frena la actividad enzimtica de la misma, sin embargo no es posible
establecer si el proceso de inmovilizacin afecta o no la actividad enzimtica, es decir si
la disminuye, ya que para esto sera necesario determinar la actividad enzimtica de esta
enzima sin inmovilizar y compararla con la actividad de la enzima inmovilizada.
Sin embargo en otras investigaciones (Segura, E., et al) en las cuales realizaron la
comparacin de la actividad enzimtica de la invertasa sin inmovilizar, comparada con
la invertasa inmovilizada, reportan que la enzima inmovilizada es ms estable, ya que
mantiene su actividad hasta por ms de dos meses almacenada a -4C, despus de este
periodo de tiempo empieza a disminuir drsticamente la actividad de la invertasa.
Adicionalmente reportan que al ser la invertasa inmovilizada resiste condiciones de pH
y temperatura ms altos que la invertasa en su forma libre.
6. Conclusiones
En el presente artculo se evidencian de manera clara la actividad enzimtica de enzimas
y levaduras en una matriz de alginato de calcio, mediante el seguimiento a la reaccin
de hidrolisis de la sacarosa, demostrando la relacin de la concentracin contra la
absorbancia.
Tomando como base la experimentacin realizada, clculos, resultados, discusin y
anlisis, y al ser comparados con la teora existente en varias fuentes, se determina que:
-La metodologa utilizada de anlisis cuantitativo por espectrofotometra para
determinar la actividad enzimtica de la invertasa fue acertado ya que permiti observar
y cuantificar de manera clara y sencilla el transcurso de la reaccin.
-La cuantificacin de glucosa por espectrofotometra se realiz a una longitud de onda
de 510nm.
-El uso del kid reactivo GOD PAP fue efectivo, rpido y muy til en la determinacin
fotomtrica de glucosa en las muestras analizar.
-La inmovilizacin de la enzima invertasa en alginato de calcio, no frena la actividad
enzimtica de la misma, sin embargo a travs de los resultados obtenidos no es posible
7

Inmovilizacin
Enzimtica

establecer si el proceso de inmovilizacin afecta de alguna forma la actividad

enzimtica de la invertasa.
7. Referencias
(i) Manual del laboratorio
Florez, Y., (2014). Gua componente prctico: 211619 Biotecnologa Alimentaria.
Bogot: UNAD.
(iii) Sitios webs

Herrera, C., Bolaos, N., Lutz, G. Qumica de alimentos. Manual de laboratorio.

Editorial de la Universidad de Costa Rica. 2003. Recuperado de
https://books.google.com.co/books?
id=8VpJ8foyDiIC&pg=PA46&dq=invertasa&hl=es-419&sa=X&ei=bxbVY3oEIjCggSc1oA4&ved=0CCgQ6AEwAw#v=onepage&q=invertasa&f=false
Grupo Mexlab. Glucosa (GOD PAP) Reactivo lquido para la determinacin
fotomtrica de glucosa o suero en plasma y otros fluidos biolgicos. Recuperado
de http://www.grupomexlab.com/quimica/pdf/8001504.pdf
Segura, E., Mendoza, D., Valdes, M., Llina, A. Evaluacion de la actividad de
invertasa libre e inmovilizada en cera de Candelilla. Universidad Autonoma de
Coahuila.
2010.
Recuperado
de
http://www.smbb.com.mx/congresos
%20smbb/queretaro11/TRABAJOS/trabajos/I/carteles/CI-16.pdf