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INFORME:
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y VIVERO (SEMILLA)
INFORME DE LABORATORIO
PREAMBULO
En los procedimientos de cultivo descritos hasta la dcada de los ochenta, no se hace ninguna
referencia al control ambiental en el desarrollo de las plantas in vitro. Sin embargo, las tasas de
crecimiento, desarrollo y muchas de las caractersticas fisiolgicas y morfolgicas de las
plantas formadas in vitro estn influenciadas por el ambiente fsico, qumico y gaseoso de los
recipientes. El incremento de conocimientos acerca del control ambiental del cultivo de tejidos
en condiciones estriles, est provocando una evolucin de las distintas tcnicas empleadas en
la microopropagacion de plantas. El ambiente in vitro en recipientes con baja tasa de
ventilacin presenta unas tasas bajas de flujo de materia y energa, con mnimas variaciones
de temperatura, elevada humedad relativa y grandes cambios diarios de la concentracin de
CO2 en el interior de los recipientes. El tipo de recipiente de cultivo (tamao, forma, material y
sistema de cierre) puede condicionar la evolucin de la composicin gaseosa en su interior
durante el perodo de cultivo. Ante los distintos factores de estrs que tienen que soportar
durante las fases de la microopropagacion las plantas producidas en recipientes con nulo o
escaso intercambio gaseoso, pueden manifestar alteraciones o dficit en cuanto a su estructura
anatmica, morfolgica y fisiolgica. Como consecuencia, estas plantas presentan un fenotipo
incapaz de sobrevivir al transplante directo al invernadero o campo. Actualmente se pueden
utilizar diferentes mtodos para controlar el ambiente en las distintas fases de la
microopropagacion, ya sean cultivos hetertrofos, mixtrofos o auttrofos. La eleccin de la
mejor estrategia va a depender de varios factores, destacando la especie, el nmero de
transplantes requerido y la relacin calidad precio entre otros.
INTRODUCCION
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECIFICOS
EXPLANTE
Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin del explante apropiado para el
establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos:
OBJETIVO DEL CULTIVO
Si bien es difcil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos,
se podra esquematizarlas en aplicaciones para:
Estudios bsicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo nico que
se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algn proceso fisiolgico, se puede
cultivar cualquier rgano, tejido o clula viva. En este caso en que lo nico que se busca es la
induccin de callos, lo ideal es cultivar explantes jvenes, derivados de semillas en
germinacin, donde se obtienen respuestas rpidas y, en general, hay menores problemas de
contaminacin con microorganismos. A veces se hace uso del cultivo de tejidos porque
representa un sistema experimental que simplifica la complejidad generada por los fenmenos
de correlacin entre las distintas partes que normalmente estn presentes en una planta
entera. El explante que se usar estar condicionado por lo que se quiere estudiar. Ej: Lulo de
la selva.
Obtencin de plantas con sanidad controlada. Es muy comn la utilizacin del cultivo de
tejidos para la obtencin de plantas libres de virus. El explante ideal para ello es el meristema
(dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de
primordios foliares.
Micropropagacin. En este caso depender del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se
quiere explotar es la brotacin de meristemas, los pices terminales y los segmentos
uninodales de ramas jvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de
tejidos debe conocer perfectamente la biologa de la reproduccin de la planta para aprovechar
aquellos explantes que en forma natural son propgulos. En cambio, si se pretende
micropropagar mediante el empleo de semillas sintticas) el explante original deber posibilitar
la induccin de la embriognesis somtica. En este caso, la utilizacin de embriones zigticos
inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes.
Obtencin de hbridos interespecficos. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos
en la agricultura lo constituy su empleo como ayuda para la obtencin de hbridos derivados
de cruzamientos interespecficos, donde se produce el aborto temprano de embriones. En
estos casos, el explante cultivado es el embrin cigtico en estadios tempranos de su
desarrollo. Con la misma finalidad tambin se utilizan ovarios u vulos fecundados.
Obtencin de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta finalidad los
explantes pueden ser semillas (por ej. orqudeas) o bien, se aslan los embriones en un estado
temprano de desarrollo (corazn) como en el caso de yerba mate o de algunas variedades
de duraznero.
Obtencin de plantas haploides (considerando como haploide a un esporofito que
contiene el complemento gamtico de cromosomas). En este caso, los explantes ms utilizados
son las anteras, aunque tambin pueden emplearse microsporas aisladas, vulos y ovarios no
fertilizados.
Induccin de variacin somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la
finalidad de su utilizacin es la aplicacin en planes de mejoramiento gentico de plantas, los
explantes utilizados deben posibilitar la regeneracin de plantas enteras.
Produccin y/o conversin de sustancias tiles. Se puede utilizar una gran variedad de
explantes. Los de races suelen ser muy utilizados.
Obtencin de hbridos somticos. Para esta finalidad se recurre a la fusin de protoplastos.
En la mayora de los casos se aslan los protoplastos de mesfilos de hojas y de suspensiones
celulares.
Conservacin e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes preferidos
para el desarrollo de sistemas de conservacin a mediano y largo plazo (croconservacin con
nitrgeno lquido) y para el intercambio de material gentico.
Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los cultivos a
partir de explantes extrados de semillas en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledones,
races).
POSIBILIDAD DE CONTAMINACION CON MICROORGANISMOS.
De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen en condiciones de
invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminacin. Por otra parte, es
recomendable evitar el uso de explantes sucios (races, rizomas) que provienen de plantas
crecidas en macetas o en el campo, dado que en la mayora de los casos no es posible
conseguir una buena desinfeccin de los mismos.
EDAD FISIOLOGICA
Este es un aspecto de gran influencia en la morfognesis. Como regla general se puede decir
que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor ser su
respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados
en numerosas especies. En el caso de la micropropagacin de plantas leosas, la edad del
explante es un factor crtico. Si los tejidos son jvenes, la micropropagacin tiene mayores
posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de
realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes.
TAMAO
En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la
proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de
explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con
microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un tamao mnimo del
explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil
lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen requerir del
empleo de medios ms complejos o de los denominados medios acondicionados.
EPOCA DEL AO
ASEPCIA
Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos
es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos,
levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El ambiente generado por explante medio de cultivo
condiciones fsicas de incubacin es altamente propicio para la proliferacin de muchos de
estos microorganismos que pueden provocar la destruccin de los cultivos. Es difcil cuantificar
el impacto de estas prdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la
micropropagacin se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos
microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrientes del
medio de cultivo o bien lo modifican. Es muy difcil conseguir cultivos estrictamente aspticos
dado que en la mayora de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus y
fitoplasmas, por lo que en la prctica, cuando se refiere a cultivos aspticos, en general se
quiere significar que son cultivos donde no se produce la proliferacin de hongos y bacterias.
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo puede ser definido como una formulacin de sales inorgnicas y
compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen
numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para
dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col, luego de revisar ms
de 3.000 trabajos cientficos describen en dos tomos (casi 1.000 pginas en total) ms de 2.000
medios de cultivo. Tambin dos empresas multinacionales ofrecen para la venta ms de 60
medios cada una, listos para su utilizacin especialmente en la micropropagacin comercial de
plantas. En la siguiente tabla se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad.
Bsicamente, los medios de cultivo se componen de compuestos que suministran:
Una fuente de carbono
Nutrientes minerales
Sustancias vitamnicas
Sustancias reguladoras del crecimiento
Agente gelificante (en el caso de medios semislidos)
PROCEDIMIENTO
Preparacin de los medios de cultivo: Para esta prctica se deben preparar y esterilizar bajo
condiciones de calor hmedo (15 psi/ 121 C/ 20 minutos) los siguientes medios de cultivo:
1.Induccin de callos: preparar 60 ml de MS (pH: 5.7-5.8), suplementado con sacarosa (3%),
vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio
control enriquecido con las condiciones hormonales descritas por la instructora. Se sugiere
relacin auxina:citoquinina (1:1 o 2:1)
2.Crecimiento: preparar 60 ml de MS (pH: 5.7-5.8), enriquecido con sacarosa (3%), vitaminas,
gar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control
enriquecido con las condiciones hormonales descritas por el profesor. Se sugiere relacin
auxina:citoquinina (1:1 o 1:2)
3. Proceso de desinfeccin del material vegetal: Una vez lavado el material vegetal con agua y
jabn, se sumerge inicialmente en etanol (70%, 2 min) y posteriormente en 50 ml hipoclorito de
sodio (2%, 15 min.). Pasado este perodo de tiempo, de elimina el desinfectante, se hacen tres
lavados consecutivos (5 min. cada uno), se transfiere en condiciones estriles a los medios de
cultivo y se almacena bajo condiciones controladas de temperatura y fotoperiodicidad.
1. Revisar los cultivos de tejidos vegetales y anotar los avances que estos presenten,
incluyendo aparicin de callos, contaminaciones, organognesis y aumento en longitud o
tamao.
2. Realizar subcultivos rutinarios y continuar el desarrollo de estos.
UTILIZACIN DE REACTIVOS
*Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona que lo prepar
y la fecha de preparacin
*No arroje por los sumideros cidos, bases o algn otro reactivo, por favor depositelos en los
recipientes de desecho
*Evite derrames de sustancias en las mesas de trabajo, as se previene que algn compaero
se queme la piel o se deteriore la ropa.
*No arroje al piso ningn reactivo
*No arroje al piso papeles u otros elementos. Por favor utilice el recipiente para la basura.
VENTAJAS
GLOSARIO
BIBLIOGRAFIA
farmacia.udea.edu.co/~fsegura/tejidos.zip
Dodds J.H., Roberts L.W., 1985, Somatic embryogenesis, En: Experiments in
Plant Tissue Cultura, Cambridge University Press, 122-132.
Montoya H. L. M., 1991, Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de
Colombia, Seccional Medelln. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento
de Agronoma.
Murashige T., Skoog F., 1962, A revised mdium for rapid growth and bioassays
with tobacco tisuee cultures, Physiol. Plant., 15:473-97
Pierik R.L.M., 1990, Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones MundiPrensa, Madrid.
ANEXOS