Programa Ingeniera de Alimentos

18 Mayo 2014.
Practica N. 1 Determinacin de la curva de crecimiento en organismos unicelulares.
1. Resumen
El crecimiento microbiano se define como el incremento ordenado e irreversible de
masa y estructura de todos los elementos componentes de este sistema, lo que implica
un aumento en la masa celular, que puede conducir a un aumento de la poblacin. El
organismo empleado en la determinacin de la curva de crecimiento fue Leuconostoc
Mesenteroides, bacteria Gram-positiva, que tiene una amplia distribucin en la
naturaleza encontrndose en vegetales verdes y races, el cual fue escogido por su
rpido crecimiento y su carcter no patgeno.
A lo largo de este artculo se explica el procedimiento llevado a cabo con dicha cepa, la
cual estuvo cropreservada a -70C, y activada en medio estndar de sacarosa, incubada
en distintos medios de cultivo con distintas concentraciones de sacarosa y fructosa; Con
el fin de comparar la curva de crecimiento de este microorganismo en cada uno de los
medios de cultivo y de esta manera lograr determinar cul es el medio ms adecuado
para su crecimiento. La concentracin de la biomasa es determina mediante la ecuacin
de la curva de calibracin. Segn los resultados se determina que el Leuconostoc
presento un mayor crecimiento en el medio G compuesto por 20g/L Sacarosa + 5g/L
fructosa, superando la concentracin de biomasa que se present en los otros medios y
con tendencia a continuar aumentando es decir a seguir en su fase exponencial.
2. Introduccin
Cuando se habla de crecimiento microbiano se deben entender los dos tipos de
crecimiento microbiano, crecimiento individual de clulas el cual es un incremento en el
tamao y peso y crecimiento poblacional, el incremento en el nmero de clulas como
consecuencia de la divisin celular. Existen diversos factores que influyen en el
crecimiento bacteriano, externos e internos, son las condiciones ambientales y
nutricionales del medio en el que se encuentra la clula, pH, temperatura, actividad de
agua, agitacin, humedad relativa, disponibilidad de oxgeno, dixido de carbono,
relacin entre contenido de carbono y nitrgeno. Los factores internos se consideran
como la capacidad metablica del microorganismo.
Es importante comprender el crecimiento microbiano, significa predecir cmo va a
evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose el substrato y cmo se van a ir
acumulando sus productos en el medio, son elementos que al ser controlados pueden ser
reproducidas al iniciar este tipo de cultivo, u otros cultivos a mayores escalas, para
produccin industrial.
El crecimiento microbiano se determina mediante la medida del cambio sucesivo en el
nmero de clulas o por la variacin en la masa de las clulas. Esta prctica de
laboratorio se bas en la determinacin de la curva de crecimiento en organismos
unicelulares por la variacin en la masa de las clulas por turbidimetra a travs del uso
del espectrofotmetro, midiendo el cambio en la turbidez en unidades de absorbancia,
transformando estas unidades en unidades de concentracin mediante una curva de
calibracin especfica para el organismo estudiado. El organismo estudiado en la

Efecto de Determinacin de la curva de crecimiento

en organismos unicelulares

determinacin de la curva de crecimiento fue Leuconostoc Mesenteroides, bacteria

Gram-positiva, que tiene una amplia distribucin en la naturaleza encontrndose en
vegetales verdes y races, es comercialmente usada en la produccin de vinos, lcteos,
azucares, con un rol esencial en la mezcla de aromas y texturas. Es quimiorganotrfica y
aerobia facultativa y su morfologa es principalmente esfrica y se encuentran en pares
o cadenas cocos. Se trabaja con ella en la prctica principalmente por no ser patgena, y
por presentar un rpido crecimiento en poco tiempo.
3. Mtodos y materiales utilizados
El mtodo utilizado fue anlisis cuantitativo, determinando la concentracin de
biomasa, por turbidimetra, que consiste en la medida de la cantidad de luz dispersada o
transmitida a travs del cultivo microbiano, y se emplean para su ejecucin, los
siguientes materiales:

Agua destilada.
Bao de termostato.
Celdas para espectrofotmetro.
Cinta para rotular.
Espectrofotmetro.
Gradilla para tubos de ensayo.
Reactivo DNS.
Medio Estndar Sacarosa 60g/L. (activacin)
Medios de cultivo en frascos de tapa rosca azul.
C. Sacarosa + 10g/L fructosa.
D. Sacarosa + 5g/L fructosa.
E. Sacarosa + 2g/L fructosa.
F. 20g/L Sacarosa.
G. 20g/L Sacarosa + 5g/L fructosa.
H. 40g/L Sacarosa.
Microorganismo cropreservado de Leuconostoc mesenteroides.
Nevera.
Pipetas.
Pipeteadores.
Plancha de calentamiento.
Reloj.
Tubos de Ensayo.

La experimentacin se realiza con Leuconostoc Mesenteroides, el cual fue inoculado

en 100mL de medio estndar de sacarosa con una concentracin de 60g/L, y activado
durante un periodo de 12 horas a 30C en incubadora. A continuacin se describe
cronolgicamente cada uno de los pasos realizados:
Adecuacin de medios, a temperatura de 30C en bao de termostato.
Enumeracin de cada tubo de ensayo con la letra correspondiente al medio de
cultivo empleado y la hora de toma de cada muestra (La Toma de muestra se realiza
con intervalos de 0,5 horas iniciando desde tiempo 0 hasta tiempo 5.5).
Nota: Para cada medio de cultivo se marca un tubo como blanco.
2

Efecto de Determinacin de la curva de crecimiento

en organismos unicelulares

Para cada medio de cultivo se toma el blanco el cual corresponde a 5mL de medio
estril sin inocular con el microorganismo.
Posteriormente se realiza la incubacin con el Leuconostoc Mesenteroides en los
seis medios de cultivo compuestos de sacarosa y fructosa en distintas
concentraciones.
Inmediatamente se toman 2mL de cada medio inoculado y se llevan a cada uno de
los tubos marcado como tiempo cero, y se dejan en refrigeracin a 6C.
Los cultivos se introducen nuevamente en bao de termostato a 30C., y trascurridos
sesenta minutos se toman nuevamente 2mL de cada medio, se llevan al los tubos de
ensayo rotulados con tiempo de 1 hora y se dejan en refrigeracin.
Este paso se repite cada treinta minutos hasta completar 5.5 horas.
Terminado el proceso, se toman los tubos de ensayo del refrigerador y tras buena
agitacin se llevan para lectura espectrofotomtrica a 600nm.

Grupo de Imgenes N. 01 Resumen del Procedimiento.

4. Resultados
Tablas de recoleccin de datos obtenidos.

Efecto de Determinacin de la curva de crecimiento

en organismos unicelulares

Imagen N. 01 Incubacin de Leuconostoc mesenteroides en medio de

cultivo F.

Tiempo
(Horas)
Blanco
0
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5

C
0
0,256
0,27
0,281
0,327
0,299
0,308
0,308
0,299
0,313
0,303
0,315

D
0
0,272
0,284
0,297
0,296
0,3
0,307
0,314
0,312
0,314
0,33
0,357

Medio de cultivo
E
F
0
0
0,278
0,295
0,291
0,3
0,305
0,3
0,31
0,3
0,293
0,283
0,3
0,279
0,304
0,303
0,304
0,311
0,307
0,307
0,322
0,328
0,341
0,352

G
0
0,326
0,3
0,34
0,335
0,33
0,351
0,357
0,352
0,355
0,365
0,388

H
0
0,313
0,29
0,279
0,348
0,313
0,305
0,305
0,307
0,319
0,324
0,341

Tabla N. 01 Absorbancias para cada de medio de cultivo en los tiempos

establecidos.

Calculo de concentracin de biomasa mg/mL.

Se utiliza la ecuacin de la curva de calibracin especfica
para este microorganismo, como se muestra a continuacin:
y = 0,191x + 0,005 Donde:
y = Absorbancia (a 600nm).
x = Concentracin de la biomasa en mg/mL.
Despejando x en la ecuacin se tiene que
x = (y 0,005) / 0,191.
Obteniendo los siguientes resultados, para cada medio de
cultivo:

Tiempo
(Horas)

Medio de cultivo
E
F

Blanco
0
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5

0
1,314
1,387
1,445
1,686
1,539
1,586
1,586
1,539
1,613
1,56
1,623

0
1,398
1,461
1,529
1,524
1,545
1,581
1,618
1,607
1,618
1,702
1,843

Efecto de Determinacin de la curva de crecimiento

en organismos unicelulares
0
0
0
0
1,429
1,518
1,681
1,613
1,497
1,545
1,545
1,492
1,571
1,545
1,754
1,435
1,597
1,545
1,728
1,796
1,508
1,455
1,702
1,613
1,545
1,435
1,812
1,571
1,565
1,56
1,843
1,571
1,565
1,602
1,817
1,581
1,581
1,581
1,832
1,644
1,66
1,691
1,885
1,67
1,759
1,817
2,005
1,759

Tabla N. 02 Concentracin de Biomasa para cada medio de cultivo en

los tiempos establecidos.

Transcurrido el periodo de tiempo establecido para las

distintas muestras, y realizando los clculos respectivos, se
relaciona absorbancia y concentracin, donde podemos
observar:

Grafica N. 01 Concentracin de Biomasa vs. Absorbancia para cada

medio de cultivo.

Ya con el fin de comparar la curva de crecimiento para cada

uno de los medios, se toma tiempo y concentracin de
biomasa donde se obtiene:

Efecto de Determinacin de la curva de crecimiento

en organismos unicelulares

Grafica N. 02 Curva de crecimiento Leuconostoc Mesenteroides en

diferentes medios de cultivo.

5. Discusin de los resultados

En los ltimos aos se ha prestado atencin particular a
mtodos y modelos que describen el comportamiento y
crecimiento de microorganismos como funcin de distintos
factores de control, usados para predecir los cambios en la
calidad de los alimentos, para estimar la vida til de los
mismos, y otros para ser aprovechados en la obtencin de
enzimas y otros compuestos de inters industrial.
Encontrar expresiones matemticas que describan el
crecimiento, la supervivencia, inactivacin o actividad
metablica son fundamentales en el estudio de
microorganismos sea cual sea el estudio o investigacin
sobre los mismos.
Para determinar la curva de crecimiento del Leuconostoc
Mesenteroides se procedi a inocular en diferentes medios
de cultivo que variaban en las concentraciones de sacarosa
y fructosa, para luego incubar en un periodo de tiempo
establecido, posteriormente se emple la determinacin de
turbidez mediante espectrofotmetro como mtodo para
medir la cantidad de luz absorbida por la solucin
(absorbancia). Segn los resultados obtenidos y tabulados,
se tiene en la Tabla N. 01 Concentracin de Biomasa para
medio de cultivo en los tiempos establecidos, con las
distintas absorbancias obtenidas a 600nm de longitud de
onda, las cuales son de gran inters y fundamentales, pero
como dicha turbidez no es una medida directa del nmero de
clulas o poblacin, su incremento es simplemente una
indicacin del crecimiento, prima mas, conocer algn tipo
6

Efecto de Determinacin de la curva de crecimiento

en organismos unicelulares

de concentracin que contemple cantidades con unidades de

medida, como lo es la concentracin de biomasa.
Para ello se toma la ecuacin de la curva de calibracin del
microorganismo en estudio que corresponde a y = 0,191x +
0,005, remplazando despejando x en la ecuacin y
remplazando valores de y, con las absorbancias obtenidas,
se determina la concentracin, concentracin de biomasa
mg/mL, datos relacionados en la Tabla N. 02 Concentracin
de Biomasa para medio de cultivo en los tiempos
establecidos.
Por otra parte, si se relaciona absorbancia y concentracin
grficamente podemos observar que a mayor absorbancia
mayor concentracin como se muestra en la Grafica N. 01
Concentracin de Biomasa vs. Absorbancia para cada
medio de cultivo.
De los resultados expresados se centran los anlisis
principalmente en la biomasa obtenida para cada medio de
cultivo a travs del tiempo, (remitirse a la Grafica N. 2
Curva de crecimiento Leuconostoc Mesenteroides en
diferentes medios de cultivo) comparndolos y determinando
en cual medio el Leuconostoc se acopla mejor, aprovecha el
substrato y se genera un mayor crecimiento del
microorganismo expresado en trminos de concentracin de
biomasa por mililitro de medio. Este conocimiento es de
gran importancia ya que tener en cuenta todos estos factores
bajo control puede permitir aprovechar este y otros
microorganismos al mximo a mayores escalas, para una
produccin de sustancias importantes a nivel industrial.
Se dice que en las curvas de crecimiento, expresan el ciclo
normal del crecimiento microbiano, por ende a partir de esta
curva de ordenadas logartmicas puede deducirse que la fase
de latencia en la cual las clulas se adaptan al nuevo
ambiente. Segn los resultados se determina que la fase de
latencia en todos los medios de cultivo fue de
aproximadamente 1 h, exceptuando el medio F cuya fase de
latencia fue de 2 h.
La fase exponencial se torna un poco compleja, se observan
picos y descensos que podran significar un comportamiento
diauxico este se explica por que hay diferentes sustratos
como fuente de carbono (sacarosa y fructosa) presentes en el
medio, claro esta, exceptuando medio F y H cuya fase
exponencial tuvo una duracin de aproximadamente 0,5 h a
1 h, mas bien corta.
Luego de este tiempo, Leuconostoc entra en un estado
estacionario la velocidad de crecimiento disminuye y deja de
reproducirse de igual forma, es decir el nmero de
microorganismos es aproximadamente constante, el tiempo
en dicha fase es de aproximadamente 2 horas, en este
apartado es importante considerar que cada uno de los tubos
7

Efecto de Determinacin de la curva de crecimiento

en organismos unicelulares

de medio de cultivo fue sometido a refrigeracin a 6C de

manera intermitente posiblemente quizs al encontrarse
cerca del mechero se pudo presentar mnimo crecimiento,
esto a nivel de incubacin de muestras, a nivel de medicin
espectrofotomtrica
muchas veces las muestras de
organismos forman agregaciones o biofilms y es necesario
realizar agitacin antes de pasar a leer la absorbancia en el
equipo, por alguno de estos motivos en la grafica se
evidencian algunos picos y descensos.
Por ltimo, generalmente en las curvas de crecimiento los
cultivos entra en la fase de muerte, en la que el nmero de
clulas que mueren se va haciendo mayor, para Leuconostoc
en las condiciones dadas, no ocurre este hecho, pues a las
5,5 horas posiblemente el microorganismo no haba
consumido todo el sustrato, y las condiciones de incubacin
seguan siendo optimas para su crecimiento, simplemente se
determino un periodo de tiempo para esta experiencia dados
los trminos de las dems experiencias a desarrollar. Sin
embargo segn los resultados obtenidos es posible
determinar que el Leuconostoc presento un mayor
crecimiento en el medio G compuesto por 20g/L Sacarosa +
5g/L fructosa, ya que la concentracin de biomasa supero a
los otros medios y al finalizar la recoleccin de muestras
(5,5 h) se evidencia que an segua en su fase exponencial.
Finalizando, y en vista de que la informacin recolectada, es
acorde a los objetivos de la gua de trabajo, se puede
afirmar, que el procedimiento en el manejo de muestras y
disoluciones, fue el adecuado.
En opinin personal, al hablar de crecimiento microbiano
son muchas las variables que deben tenerse en cuenta, si
bien es en esta oportunidad analizado solo el medio de
cultivo, hubiese sido interesante enfocar adems
comportamientos a otras temperaturas con los mismos
medios de cultivo obteniendo a su vez resultados de gran
debate que al ser estudiados tambin, permitiran aun mas la
apropiacin de conceptos sobre este tema.
6. Conclusiones
El crecimiento microbiano se determina mediante la medida
del cambio sucesivo en el nmero de clulas o por la
variacin en la masa mediante turbidez de las clulas en
cada uno de los tubos llevados a espectrofotometra. El
organismo estudiado en la determinacin de la curva de
crecimiento fue Leuconostoc mesenteroides, la prctica
arroja unidades de absorbancia, las cuales se transforman en
unidades de concentracin mg/mL de biomasa mediante una

Efecto de Determinacin de la curva de crecimiento

en organismos unicelulares

ecuacin de la curva de calibracin especfica para el

organismo estudiado.
En el presente artculo se ha podido constatar, los efectos
que causan distintas concentraciones de sacarosa y fructosa,
teniendo como objetivo, observar y determinar
cuantitativamente su evolucin en el tiempo sealado.
Tomando como base la experimentacin realizada, clculos,
resultados, discusin y anlisis, y al ser comparados con la
teora existente en varias fuentes, se determina que:
-La tasa de crecimiento de una poblacin a analizar indica
un aumento en la masa celular, con un consecuente aumento
de poblacin microbiana.
-Los factores que influyen en el crecimiento bacteriano,
estn determinados por condiciones ambientales y
nutricionales del medio.
-Comprender el crecimiento microbiano, significa predecir
cmo va a evolucionar un cultivo en determinadas
condiciones.
-Comparar la curva de crecimiento para cada uno de los
medios de cultivo permite identificar cul de los medios es
ms apto para su crecimiento.
-Las expresiones matemticas que permiten comprender el
crecimiento, activacin o actividad metablica son
fundamentales en el estudio de microorganismos.
- La turbidimetra, consiste en la medicin de la cantidad de
luz dispersada o transmitida a travs del cultivo microbiano,
en valores de absorbancia.
-Cuanto mayor es el nmero de clulas en suspensin, tanto
menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio, por
ende mayor absorbancia.
-Las curvas de crecimiento, expresan el ciclo normal del
crecimiento microbiano, de las cuales de deducen, las fases
de latencia, exponencial, estacionaria y de muerte.
-A mayor tiempo de incubacin, mayor concentracin de
Biomasa ser encontrada en el medio de cultivo, la cual a su
vez variara de acuerdo al sustrato presente.
7. Referencias
Informacin
sobre
Leuconostoc
Mesenteroides,
microorganismos en general, crecimiento, variables y
factores de crecimiento, y dems compendios del tema
desde:
(i) Manual del laboratorio
Ortiz, F., (2014). Gua componente prctico: 305689
Biotecnologa. Pasto: UNAD.
9

Efecto de Determinacin de la curva de crecimiento

en organismos unicelulares

(ii) Libros
Stainer, R., Inhagram, J., Wheelis, M., y Painter, P.
(1992). Microbiologa. (2da Ed). Editorial Revert S.A.
Barcelona.
Recuperado
de:
http://books.google.com.co/books?id=2u6Q2XCMDgC&pg=PA195&dq=crecimiento+microbian
o&hl=es&sa=X&ei=H9xyU8S4EOvmsAShm4DQDg&
ved=0CDYQ6AEwAQ#v=onepage&q=crecimiento
%20microbiano&f=false
Pars, R., Jurez, A. (1997). Bioqumica de los
Microorganismos. Editorial Revert S.A. Barcelona.
Recuperado de: http://books.google.com.co/books?
id=eHK7eHXBRk4C&pg=PA13&dq=biomasa+microbi
ana&hl=es&sa=X&ei=At5yU9bhB5WhsATQqIE4&ved
=0CC4Q6AEwAA#v=onepage&q=biomasa
%20microbiana&f=false
(iii) Sitios webs
Arnaiz, C. Isac, L., y Lebrato, J. (2000).
Determinacin de la Biomasa en procesos Biolgicos.
Universidad de Sevilla: Grupo de tratamiento de aguas
residuales. Articulo Tcnico N. 205. Recuperado de:
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/tvolke/00_Dete
rmin-BM.pdf

Benintende, S. y Snchez, C. (s.f.). Unidad temtica

3: Crecimiento Bacteriano. Universidad Nacional entre
ros: Facultad de ciencia agropecuaria. Recuperado de:
http://www.fca.uner.edu.ar/academicas/deptos/catedras/
microbiologia/unidad_3_crecimiento_bacteriano.pdf

Rodrguez, O. Hanssen, H. (2007). Obtencin de

dextrano y fructosa, utilizando residuos agroindustriales
con la cepa leuconostoc mesenteroides nrrl b512-f.
Revista EIA. N.7 Jun/2007. Envigado. Recuperado de:
http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S179412372007000100015&script=sci_arttext
Vsquez, I. (2011). Densidad ptica (absorbancia) y
turbidimetra para cuantificacin de biomasa.
Universidad Central del Ecuador: Facultad de ciencias
qumicas, Qumica de alimentos. Recuperado de:
https://www.google.com.co/url?
sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CC
sQFjAA&url=http%3A%2F
%2Fbiotivr9.wikispaces.com%2Ffile%2Fview
%2FTurbidimetria.docx&ei=QuFyU8vFcLnsATS34DAAw&usg=AFQjCNFHCY9EL70YFGb
PVwsjmSzJaQmg6g&sig2=Si_HUnmor1iACMT3SxdEw

10

Efecto de Determinacin de la curva de crecimiento

en organismos unicelulares

11