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Ingeniera en Biotecnologa
Noveno cuatrimestre
Clave
190930933
Propsitos de la unidad
Competencia especfica
Temario
2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana
2.1. Sobrevivencia bacteriana: transferencia y recombinacin de ADN y resistencia
a drogas
2.1.1. Recombinacin
2.1.2. Transformacin
2.1.3. Conjugacin
2.1.4. Transduccin
2.1.5. Resistencia a drogas
2.2. Herramientas en la clonacin y expresin de genes para obtener bacterias
recombinantes
2.2.1. Los plsmidos como vectores de clonacin
2.2.2. Bacterifagos
2.2.3. Cepas bacterianas
2.2.4. Seleccin de bacterias recombinantes por resistencia a drogas
Por ejemplo, la capacidad infecciosa de una bacteria patgena reside en que contiene la
informacin gentica necesaria para colonizar, invadir y/o producir sustancias txicas
causantes de la enfermedad. Es importante puntualizar que dicha informacin se
transmite y se hereda a la siguiente generacin, por lo que resulta necesario conocer su
funcionamiento gentico. El hecho de que estos microorganismos sean de relativo fcil
manejo en el laboratorio, ha favorecido que podamos utilizarlas para sintetizar productos
tiles para distintos sectores (Betancor et. al. 2006).
Por ello, en esta unidad revisaremos las estrategias de transferencia que pueden
manifestar las bacterias con objeto de recombinar su material gentico y de este modo
adquirir cambios como la resistencia a ciertos antibiticos u otras drogas.
2.1.1. Recombinacin
La recombinacin es un proceso que combina elementos genticos contenidos en los
genomas de diferentes individuos, dando como resultado en algunos casos que se
adquiera una nueva funcin, como una mejor adaptacin a los cambios ambientales, lo
cual resulta ser un evento evolutivo de gran importancia, ya que implica una transferencia
de la informacin gentica que puede permitir a una especie adquirir una mejor capacidad
de adaptacin y por tanto, de sobrevivencia. En los procariontes, a diferencia de los
eucariontes, la recombinacin comprende una serie de mecanismos que son
independientes de su reproduccin sexual.
Un requisito comn de todas las formas de transferencia de genes entre bacterias,
exceptuando la transferencia de plsmidos (que pueden replicarse de forma
independiente), es que el fragmento de ADN, sujeto a ser transferido, debe ser insertado
en el cromosoma receptor, esto se logra a travs de la ruptura de ambas molculas de
ADN, su entrecruzamiento y su unin (Figura 1).
Una vez que las enzimas ejercen su accin, se produce un conjunto definido de diferentes
segmentos, mismos que pueden visualizarse si se utiliza una electroforesis, ya que los
fragmentos pueden separarse por su peso molecular, en un proceso que es anlogo a la
separacin de protenas:
Para que se renan las hebras cortadas, se requiere de la accin de otra enzima que es
la ADN ligasa, la cual cataliza la formacin del enlace fosfodister necesario para que se
unan las hebras del material gentico. Para que la recombinacin sea exitosa es requisito
que la nueva secuencia se transcriba y traduzca en una clula y que adems se replique.
La recombinacin sucede tanto en eucariontes como procariontes, e implica la generacin
de un nuevo genotipo como resultado del intercambio de material gentico entre
secuencias homlogas de ADN de dos orgenes diferentes.
Recombinacin gentica en bacterias
A diferencia de las clulas eucariontes, las bacterias slo tienen un nico cromosoma.
Por tanto, para que suceda la recombinacin, el cromosoma homlogo debe ser
transferido de una bacteria donadora a una receptora, si se considera que el cromosoma
donador debe ser homlogo con el receptor, entonces es de esperarse que ambas
bacterias pertenezcan a la misma especie o a especies muy relacionadas. Por tanto, la
recombinacin bacteriana sucede si y solo si sucede una transferencia del material
gentico, fragmento de ADN, de la bacteria donadora hacia una clula receptora y se
manifiesta porque dicho fragmento se puede transcribir, traducir y replicar en la clula
aceptor. Si no hay recombinacin, el fragmento de ADN de la bacteria donadora se
pierde, porque no se puede replicar de forma independiente.
Ahora bien, tambin puede suceder la recombinacin heterloga, la cual ha sido
ampliamente utilizada por la biotecnologa, donde hay muchos ejemplos de genes de
origen animal expresados en bacterias y plantas con la finalidad de obtener diversas
protenas recombinantes de gran inters en la industria farmacutica y alimentaria.
Por tanto, la recombinacin gentica bacteriana sucede cuando se transfieren fragmentos
de ADN de una clula donadora a una receptora, ahora es de nuestro inters conocer
dichos mecanismos de transferencia que tienen caractersticas, ventajas y desventajas
particulares, los cuales son: transformacin, conjugacin o transduccin.
2.1.2. Transformacin
La transformacin es un proceso de recombinacin gnica mediante el cual las bacterias
pueden incorporar ADN exgeno o extrao, que puede provenir de otras bacterias y que
se encuentra libre en el medio (Figura 4).
No todas las bacterias pueden captar este ADN exgeno, cuando lo conservan en
forma estable e interaccionan con el mismo, se dice que son competentes. Esta
competencia depende de la presencia de un sistema de captacin de ADN especfico y
que se encuentra asociado a la membrana celular. Como ejemplos de bacterias
competentes se encuentran Haemophilus influenzae, Neisseria sp, Streptococcus
pneumoniae, etc. Aun cuando no todas las especies de bacterias pueden ser
competentes, esta se puede inducir en el laboratorio al generar alteraciones en la
membrana celular (Betancor et al. 2006).
2.1.3. Conjugacin
En la conjugacin, la transmisin de ADN se realiza directamente de una clula
bacteriana a otra. Los plsmidos son los elementos genticos que con mayor frecuencia
se transmiten a travs de este mecanismo. Esta capacidad de transferencia va a
depender de la presencia de plsmidos conjugativos que contienen los genes necesarios
para realizar dicho evento (Betancor et al. 2006).
Pero qu caractersticas presenta y cmo es que se puede favorecer la conjugacin?
Resulta que para que se d la transferencia de genes generalmente contenidos en un
plsmido, ya sea de una bacteria a otra bacteria, o bien de una interaccin bacteria-clula
hospedera, debe existir primeramente un contacto fsico entre ambos tipos celulares y
establecerse un puente de unin entre las superficies de ambos, para poder introducir y
recombinar el material gentico. Aun con todos los avances tecnolgicos alcanzados,
dichos eventos an no han sido del todo dilucidados, pero se tiene conocimiento muy
valioso de cmo pueden operar estos sistemas (Thanassi et al. 2012; Arutyunov y Frost
2013).
Acorde a lo anterior, el primer requisito es que se establezca una unin entre las bacterias
involucradas sujetas a ser modificadas genticamente:
1) Debe existir un acercamiento fsico entre ambos tipos celulares, lo cual se alcanza a
travs de organelos de superficie como el pili, el cual se localiza en la bacteria donante
del plsmido y uno de sus objetivos es identificar y promover el acercamiento a la clula
receptora.
2) Una vez establecido el puente de comunicacin entre los dos tipos celulares, comienza
un flujo de material desde la bacteria hacia la clula receptora, donde los sistemas de
secrecin bacterianos, se encargan de producir y excretar diversas molculas que no solo
pueden favorecer el fortalecimiento del puente de unin, sino tambin la entrada de
factores de virulencia y el ADN candidato a ser insertado en el cromosoma de la clula
receptora. Hay que recordar que la recombinacin es exitosa si y solo si el fragmento de
ADN se transcribe, traduce y replica.
Transferencia de genes
Bacteria sensible al cido Nalidxico.
Bacteria donadora que acarrea el
Bacteria resistente al cido Nalidxico.
plsmido resistente a ampicilina
amp
MECANISMOS DE CONJUGACIN
Formacin de parejas de apareamiento
En la mayora de los casos, la incidencia de la conjugacin, depende de la presencia de
una cepa donadora que contenga un plsmido que contiene los genes requeridos para
promover la transferencia de ADN. En E. coli y otras bacterias Gram-negativas, las clulas
donadoras acarrean apndices sobre la superficie celular (pilis). Los pilis, varan
considerablemente en estructura, por ejemplo, el pili especfico para el plsmido F es
largo, delgado y flexible, mientras que el pili para el plsmido RP4 es corto, grueso y
rgido. Los pilis hacen contacto con receptores sobre la superficie de la clulas, as forman
las parejas de apareamiento (Figura 6). El pili, por tanto, atrae la clula para un contacto
ntimo y hacer un canal o un poro por medio del cual el ADN pase del donador al receptor.
Pilis
Plsmido
Donador
Cromosoma
bacteriano
Pareja de
apareamiento
Transconjugante
Donador
5 generado por el corte. Al mismo tiempo, el extremo terminal libre 3 de la hebra cortada
es extendido para remplazar el ADN transferido, por un proceso conocido como
replicacin en crculo rodante el cual es anlogo a la replicacin de hebras simples de
plsmidos y bacterifagos. La protena cortadora permanece unida al extremo terminal 5
del ADN transferido. La sntesis de ADN en el receptor convierte la hebra en una molcula
de hebra doble.
Hay que hacer notar que este es un proceso de replicacin. As, si bien se ha
puntualizado la transferencia de plsmidos de una clula a otra, lo que realmente significa
es la transferencia de la copia de un plsmido. La cepa donadora todava tiene una
copia del plsmido y puede involucrarse en posteriores apareamientos con otros
receptores. Es tambin digno de mencin que, despus de la conjugacin, la clula
receptora tiene una copia del plsmido y puede transferir la copia a otra clula receptora.
Las consecuencias pueden ser la diseminacin de un plsmido a travs de una poblacin
mezclada.
Donador
Receptor
El plsmido es cortado
en un sitio especfico,
oriT
Pareja de
apareamiento
Sintesis de ADN en el
donador por extensin
del extremo terminal
3 de la hebra cortada
Hebra simple
transferida
ADN transferid
es copiado en la
clula receptora.
El plsmido F
El plsmido fue descubierto originalmente durante intentos para demostrar el intercambio
gentico en E. coli por cultivos mezclados de dos o ms cultivos auxotrficos, por tanto se
cultivaban sobre medios mnimos para permitir que nicamente los recombinantes
crezcan. Fue mostrado muy pronto que los recombinantes eran todos derivados de una
cepa progenitora y que una sola va de transferencia de informacin era la que estaba
involucrada, por parte del donador (macho) al receptor (hembra). La cepa donadora
acarreaba el plsmido (F+) mientras que el receptor es F-. Una caracterstica de este
sistema que parece ser curioso al mismo tiempo es que la co-cultivacin de una cepa F+ y
una cepa F- resulta en que las hembras son convertidas en machos. Esto es debido a que
la transmisin del plsmido F, por s mismo, ocurre muy frecuentemente, en contraste a la
transferencia de marcadores cromosomales, los cuales son ineficientes ante un F+
donador.
Cepas Hfr
La utilidad de la conjugacin para el anlisis gentico fue enormemente incrementada por
el descubrimiento de las cepas donadoras en las cuales la transferencia de ADN
cromosomal ocurra ms comnmente. Estas cepas Hfr (High Frequency of
Recombination, por sus siglas en ingles que significa alta frecuencia de recombinacin)
surgen de la integracin del plsmido F dentro del cromosoma bacteriano. Una
caracterstica adicional de una cepa Hfr es que la transferencia cromosomal empieza de
un punto definido y procede en una direccin especfica. El origen de la transferencia est
determinada por un sitio de insercin del plsmido F y la direccin est gobernada por la
orientacin del plsmido insertado. Esto puede quedar aclarado remarcando la molcula
circular en la Figura 7 que contiene un plsmido F integrado al ADN cromosomal. La
transferencia es as iniciada del sitio oriT del plsmido integrado, pero que ahora resulta
en la transferencia de una copia del cromosoma bacteriano en vez de solamente el
plsmido. Un donador F+, en contraste, transfiere genes de una forma ms o menos
aleatoria, ya que la transferencia no se inicia desde un sitio definido en el cromosoma. La
combinacin de la transferencia parcial de ADN cromosmico con la transferencia
ordenada de los genes, hizo de la conjugacin una herramienta importante en el mapeo
de los cromosomas bacterianos.
lac
Escisin
Cromosoma
Integracin
d
Escisin aberrante
b
Delecion
de lac
c
Plsmido F
produce una gama de feromonas y por lo tanto es capaz de aparearse con las clulas que
llevan plsmidos diferentes.
Despus de que la feromona se ha unido al receptor de la superficie celular, es
transportado al citoplasma por una protena de transporte especfica, donde interacciona
con una protena llamada TraA. Esta protena es un represor de los genes tra en el
plsmido y la unin del pptido alivia aquella represin, estimulando de este modo la
expresin de los genes tra. Un resultado es la formacin de productos de agregacin que
causan la formacin de un agregado de acoplamiento que contiene unidas las clulas
donantes y receptoras. Una consecuencia adicional de la expresin de los genes tra es la
estimulacin de los eventos necesarios para la transferencia del plsmido, que se produce
por un mecanismo similar al descrito anteriormente.
Una ventaja de este sistema es que las clulas que contienen el plsmido no expresan los
genes necesarios para la transferencia de plsmido a menos que exista un receptor
adecuado en las proximidades. Esto no slo reduce la carga metablica en la clula, sino
que tambin significa que no estn expresando antgenos de superficie (tales como pili
conjugativo) que podran ser reconocidas por el sistema inmune del husped.
Transposones conjugativos
E. faecalis tambin proporciona un ejemplo de una excepcin a la regla general de que la
conjugacin es mediada por plsmidos. Algunas cepas de E. faecalis contienen un
transposn conocido como Tn916. Los transposones no se cubren particularmente en
esta unidad, pero por el momento es suficiente saber que son elementos genticos
mviles que son capaces de moverse de un sitio a otro del ADN. Lo que diferencia a
Tn916 aparte de otros transposones es su capacidad de transferir de una clula a otra por
conjugacin.
Transposones conjugativos tales como Tn916 difieren de los plsmidos en que se replican
y heredan como parte del cromosoma. No hay forma estable de replicacin independiente
como la hay con un plsmido. Sin embargo, una inspeccin ms detallada del mtodo de
transferencia (Fig. 9) muestra que existe una similitud significativa a la transferencia de un
plsmido. En particular, Tn916 contiene un origen de transferencia (oriT) que es bastante
similar a la que se encuentra en muchos plsmidos. El primer paso en la transferencia es
la escisin del transposn a partir del cromosoma, usando enzimas transposncodificadas (Int y Xis) que estn relacionadas con los responsables de la integracin y la
escisin del bacterifago lambda. Produce una molcula circular que se asemeja a un
plsmido en todos menos un rasgo vital - que no tiene un origen de replicacin por lo que
es incapaz de ser copiados en la forma normal. Sin embargo, ya que tiene un sitio de oriT
y lleva los genes tra necesarios para la transferencia conjugacional, es como puede ser
transferido a una clula receptora.
Al igual que con los sistemas de transferencia de plsmido descrito anteriormente, la
transferencia de Tn916 implica la sntesis de ADN de hebra sencilla iniciado en oriT y la
transferencia de la cadena desplazada al receptor. La nica hebra transferida a
continuacin, se circulariz y convierte a una forma circular de doble cadena que se
inserta aleatoriamente en el cromosoma receptor por la accin de la integrasa.
Una caracterstica adicional de Tn916 que vale la pena considerar es, si la transferencia
se produjo sin la escisin a partir del cromosoma entonces, se esperara que la
movilizacin del cromosoma ocurriera con la transferencia incompleta del transposn.
Transferencia comienza a partir de oriT y tendra que trabajar justo a la vuelta del
cromosoma antes de llegar al resto del transposn. Esto no parece suceder. La razn es
que el promotor para la expresin de los genes tra se encuentra hacia el extremo
izquierdo del transposn (en la Fig. 9) y se encuentra lejos de los genes tra. En la forma
lineal no se pueden expresar los genes tra. Sin embargo, cuando el transposn se
escinde del cromosoma y es circularizado, esto trae al promotor a la posicin y orientacin
correcta para la transcripcin de los genes tra. Por lo tanto, se expresan a partir del
intermediario circular, pero no de la forma lineal. Esto asegura que el sistema de
transferencia slo se activar despus de haberse producido la escisin.
Escisin
Donador
Iniciacin
de la transferencia
a partir de oriT
Hebra sencilla
transferida y
circularizada
Sntesis de
la segunda
hebra
Receptor
Integracin
2.1.4. Transduccin
Transduccin es la transferencia mediada por fagos de material gentico. El paso clave
en la transduccin es el envase de ADN en las cabezas de fagos durante el crecimiento
ltico del fago. Este proceso es normalmente altamente especfico para el ADN del fago.
Sin embargo, con algunos fagos, los errores pueden ocurrir en fragmentos de ADN
bacteriano (producido por la degradacin del cromosoma del husped mediada por fagos)
se empaquetan de vez en cuando por error conduciendo a partculas tipo fago que
contienen un segmento de genoma bacteriano (vase la Figura 10).
Estas partculas de transduccin son capaces de infectar una clula receptora, ya que la
informacin necesaria para la unin y la inyeccin de ADN se realiza por las protenas de
la partcula del fago, cualquiera que sea el cido nucleico que contenga. El segmento de
ADN transducido se puede inyectar en una nueva clula husped.
No todos los bacterifagos son capaces de llevar a cabo la transduccin. Los requisitos
bsicos de un fago transductor eficaz son que, la infeccin debera dar como resultado un
nivel apropiado de la degradacin del ADN cromosmico para formar fragmentos de
tamao adecuado en el momento adecuado para el envasado y que la especificidad del
proceso de envasado debe ser comparativamente baja.
En algunos casos, el ADN transducido es un plsmido bacteriano, en cuyo caso la
molcula de ADN inyectado es capaz de ser replicado y heredado. Ms comnmente el
ADN incorporado en la partcula de transduccin es un fragmento de ADN cromosmico
que ser incapaz de replicarse en la clula receptora. Para que sea replica y heredada,
debe ser incorporada en el cromosoma receptor (por recombinacin homloga), como es
el caso con otros mecanismos de transferencia de genes.
Este proceso se conoce como transduccin generalizada (en oposicin a la transduccin
especializada), ya que prcticamente cualquier gen tiene la misma probabilidad de ser
transducido.
Bacteria donadora
Replicacin de ADN
Sntesis de partculas del fago
Infeccin ltica
Incorporacin del
ADN cromosomal
Infeccin del
receptor
Recombinacin con
el ADN del husped
Fragmento de ADN
transducido
frecuencia muy alta (efectivamente 100 por ciento por partcula de fago) una vez que el
fago transductor ha sido aislado. Dado que el ADN transferido se limita a una regin muy
pequea del cromosoma, el fenmeno se conoce como transduccin especializada (o
restringida). Esto es muy similar a la formacin de plsmidos F' mencionados
anteriormente (vase la Figura 8). Al igual que con los plsmidos F', ahora es mucho ms
fcil aadir genes lambda ADN creando recombinantes in vitro.
Otro fago que se ha empleado de forma similar es el fago Mu que tiene la ventaja de
insertarse en mltiples sitios en el cromosoma por un mecanismo tipo transposn. Por lo
tanto, es mucho ms fcil para crear una amplia gama de fagos transductores
especializados con Mu que se puede utilizar tanto en el mapeo gentica y en
mutagnesis.
por milln a uno por mil millones de clulas. Los elementos extra-cromosmicos
(plsmidos y transposones) son piezas ms pequeas de ADN circular, cada uno
equivalente en tamao a aproximadamente 1% del cromosoma bacteriano. Los plsmidos
pueden ser no conjugativos o conjugativos; este ltimo puede moverse desde una
bacteria a otra.
El intercambio gentico es otro mecanismo por el cual los plsmidos resistentes a drogas
se pueden mover entre bacterias (Figuras 6, 7 y 9). Algunas bacterias son consideradas
como "promiscuas", porque una vez que han adquirido plsmidos resistentes a drogas,
realizan la transferencia de la resistencia tanto entre la misma especie como con otras
especies bacterianas con independencia del medio ambiente (es decir, si las drogas estn
presentes o no).
Transferencia inusual de secuencias de ADN resistentes a los antibiticos entre especies
bacterianas y entre los diferentes nichos ecolgicos (por ejemplo, entre los seres
humanos y rumiantes) se han documentado. Por ejemplo, en Staphylococcus aureus, una
bacteria gram-positiva, el gen cromosmico para la resistencia a la meticilina se origin
como un gen de -lactamasa estafiloccica y un segmento de un gen de unin a penicilina
procedentes de una bacteria donante desconocido, tal vez Escherichia coli, un gramo
bacteria-negativo.
En lo que se refiere a mecanismos de resistencia, algunas especies de bacterias son
intrnsecamente insensibles a ciertos antibiticos, mientras que otras son sensibles. La
sensibilidad tiene 3 requisitos: 1) un objetivo para la reaccin, 2) un mecanismo para el
transporte en la clula antes de la accin de los antibiticos y 3) la ausencia de enzimas
que podran inactivar o modificar el antibitico. Un cambio en cualquiera de estos
requisitos previos podra hacer que una bacteria se vuelva resistente a la droga o
antibiotico. Por ejemplo, una o ms mutaciones pueden ser adquiridas al cambiar el
objetivo de la accin, la captacin, el flujo de salida de extrusin de los antibiticos, o la
capacidad de la bacteria para inactivar o modificar el antibitico.
Los frmacos antimicrobianos utilizados para la terapia humana a menudo tienen
importantes similitudes estructurales a los que se usan para los animales, lo que lleva a la
posibilidad de problemas adicionales. Por ejemplo, la resistencia a la ormetoprim, un
medicamento veterinario, podra fomentar la resistencia a la trimetoprima, un compuesto
estructuralmente similar que se especifica para su uso en seres humanos.
Las bacterias resistentes a la estreptogramina, quinupristina y dalfopristina se han
encontrado en los pavos que se haban dado virginiamicina, pero no cualquiera de los
otros antibiticos, sin embargo, todos estos compuestos tienen una estructura similar.
2.2.2. Bacterifagos
Los bacterifagos (fagos o para abreviar) son simplemente los virus que infectan
bacterias. Ellos jugaron un papel central en el desarrollo de la biologa molecular,
especialmente en nuestra comprensin de la estructura del gen, la expresin y son
tambin importantes en el laboratorio y en la naturaleza como proveedores de medios por
los cuales los genes se pueden transferir de una bacteria a otra. Con el desarrollo de la
clonacin de genes, los fagos se llevaron en un papel adicional como vectores para la
clonacin de ADN.
En muchas de sus propiedades bsicas, los fagos son similares a otros virus. Ellos
contienen ARN o ADN encerrado en una capa de protena. El fago infecta mediante la
unin a un receptor especfico en la superficie de la bacteria y el cido nucleico entra en la
clula. Algunos de los genes del fago (los genes tempranos) se expresan casi de
inmediato, utilizando enzimas del husped pre existentes, en general, stos codifican para
las protenas necesarias para la replicacin del cido nucleico del fago. A continuacin, se
realizan varias copias del cido nucleico del fago, y la expresin de los genes tardos
comienza: estos genes son los que se necesitan para la produccin de la partcula del
fago. La naturaleza de la transicin desde la primera expresin del gen a la expresin
tarda del mismo vara entre diferentes fagos. Las partculas de fago se ensamblan y la
clula sufre lisis, liberando una serie de partculas de fago, cada uno de los cuales pueden
luego pasar a infectar otra clula bacteriana (vase la Figura 12).
Inyeccin del ADN del Fago
Infeccin
Lisis
Empaquetamiento
del ADN en las
cabezas del fago
Figura 13. Morfologa de algunos bacterifagos seleccionados. Hay que hacer notar que
la estructura filamentosa del fago M13 es muy larga y no puede ser tomada su
representacin en este esquema como representativa de su verdadero tamao (Dale y
Park, 2004).
La partcula de fago se compone de una molcula de cido nucleico contenido dentro de
una capa de protena. En los fagos ms simples, tales como MS2, la capa contiene un
nmero de copias de una sola protena importante que esencialmente polimeriza
espontneamente. La forma en que se asocian define tanto la forma como el tamao de la
partcula del fago. En principio, estructuras filamentosas tambin se pueden producir por
polimerizacin espontnea de subunidades proteicas, pero esto no es suficiente para
definir la longitud del filamento. Una forma comn de asegurar que se producen
filamentos de una longitud definida es utilizar una plantilla o molde, alrededor de la cual la
protena se polimeriza. Con fagos filamentosos tales como M13 el ADN del fago
proporciona la plantilla o molde.
El montaje de M13, donde las protenas de la cubierta del fago se polimerizan alrededor
del ADN, hace un marcado contraste con fagos ms grandes, tales como (lambda) y T4,
en donde el DNA se empaqueta en cabezas de fagos vacos pre formados y por lo tanto
el tamao de la cabeza del fago se define por las protenas de las que est compuesto. El
tamao y la complejidad de estas estructuras requiere un enfoque diferente para su
produccin, la polimerizacin espontnea sera demasiado ineficiente y las estructuras
son generalmente inestables hasta que estn completas. El ensamblaje de estos fagos se
dirige por lo tanto por la presencia temporal de un nmero de protenas adicionales, que
se eliminan antes de la maduracin final del fago (vase la Figura 14). Estos
componentes que ayudan con el montaje, pero no estn presentes en la partcula final se
denominan protenas de andamiaje.
Montaje del
andamio
Subunidad
de la cpside
Ensamble
Estructura
madura
Figura 14. Montaje del andamiaje. Ensamble de fagos complejos con la asistencia de
protenas andamios. Estas se eliminan una vez ensamblado la estructura (Dale y Park
2004).
Los bacterifagos tambin difieren en la naturaleza de su contenido de cido nucleico.
Los fagos M13 y X174 contienen ADN circular de cadena sencilla, MS2 tiene un genoma
de ARN, mientras y las partculas del fago T4 contienen ADN de doble hebra.
una sucesin de cultivos que en ltima instancia son derivados de una sola colonia inicial
(Dijkshoorn et al. 2000).
As, dada esta definicin, podemos mencionar que hay cuatro tipos de bacterias, de las
cuales se obtienen cepas bacterianas de inters prctico para la actividad humana. Estos
tipos de bacterias son:
Staphylococcus aureus
El Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva de forma esfrica que crece
entre los 10 y45C, con un pH de entre 4 y 9. Sin embargo, su temperatura ptima de
desarrollo est comprendida entre los 30 y 37C, y el rango ptimo de pH oscila entre 7 y
7,5.A pesar de no ser esporgenas, las bacterias estafilococos muestran una notable
resistencia a las condiciones ambientales desfavorables. Generalmente, se encuentra en
el agua, en la piel y en las mucosas. Cuando se introduce en nuestro organismo, puede
generar infecciones de distinta naturaleza.
Las infecciones provocadas por el Staphylococcus aureus, contradas en ambientes
hospitalarios, suelen estar causadas por estpites resistentes a las quimioterapias y, a
menudo, se manifiestan en forma epidmica. El brote de estas epidemias puede significar,
en determinadas salas, un evento de particular gravedad, que puede ocasionar serios
problemas profilcticos y teraputicos (Suzuki et. al. 2012, Rolo et. al. 2012).
Pseudomonas aeruginosa
La Peudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, que crece a temperaturas
que oscilan entre los 4 y 42C. Sin embargo, no puede desarrollarse con un pH inferior a
4,5. Generalmente se le encuentra en el agua, el suelo y, como husped, en la piel y el
intestino. Su desarrollo se vea favorecido por cualquier tratamiento con medicamentos
antibacteriales, ya que su desarrollo se ve favorecido por cualquier antibitico. Al reducir
el resto de la poblacin microbiana, permite que la bacteria incremente su nmero; bajo
otras circunstancias, este incremento resultara imposible (Haynes 1951).
Enterococcus faecalis
Dentro de las especies de procariontes clasificadas como Gram positivas, los enterococos
representan una especie que suele estar presente de forma natural en la microbiota
intestinal de los animales, aunque tambin pueden estar presentes en las plantas e
insectos. Acorde a lo anterior suelen ser empleados como indicadores de contaminacin
fecal en el agua y en los alimentos. Las condiciones de crecimiento que las favorecen,
involucran temperaturas entre los 10o y los 45o, incluso pueden sobrevivir a 60o durante un
tiempo de 30 minutos; en medios con soluciones de NaCl al 6,5% y pH de 9,6.
Los enterococos son bacterias dotadas de un bajo poder patgeno pero poseen genes
que codifican la resistencia a algunos antibiticos y, por consiguiente, logran sobrevivir en
ambientes en los que stos son muy utilizados. De hecho, en los ltimos 15 aos, han
sido frecuentemente causa de infecciones hospitalarias (Jett et. al. 1994).
Las cepas bacterianas relacionadas con las bacterias relacionadas anteriormente se
presentan en la siguiente tabla:
Nombre de cepa
Nmero
Identificacin
Sin nmero
Escherichia coli
ATCC 25922
Escherichia coli
ATCC 35218
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Enterococcus faecalis
ATCC 51299
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
Caracterstica
Bacilo gramnegativo
Enteropatgeno Grupo E. coli
Enterohemorrgico, ECEH. Cepa
No Toxignica
Bacilo gramnegativo, familia
Enterobacteriaceae
Bacilo gramnegativo
Familia Enterobacteriaceae
Coccea grampositiva
Coccea grampositiva, resistente a
vancomicina fenotipo Van B.
Bacilo gramnegativo, no
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
Staphylococcus aureus
ATCC BA 976
Staphylococcus aureus
ATCC BA 977
fermentador (BNF)
Coccea grampositiva, en racimo
Coccea grampostiva, negativa
resistencia inducible a clindamicina.
gen msrA
Coccea grampostiva, positiva
resistencia inducible a clindamicina.
gen ermA
Como las cepas bacterianas suponen cada vez mayores retos para la salud humana,
incluyendo aumento de la virulencia y la transmisibilidad, la resistencia a mltiples
antibiticos, la expansin de los espectros de acogida, y la posibilidad de manipulacin
gentica para el bioterrorismo. Se han creado nuevas herramientas para la tipificacin de
cepas bacterianas o la identificacin de las bacterias a nivel de cepa, es particularmente
importante para el diagnstico, tratamiento y vigilancia epidemiolgica de las infecciones
bacterianas. Este es especialmente el caso para las bacterias que exhiben altos niveles
de resistencia a los antibiticos o la virulencia, y aquellos implicados en las infecciones
nosocomiales o pandemias.
As, durante las dos ltimas dcadas, los mtodos moleculares han reemplazado
progresivamente ensayos fenotpicos para describir cepas bacterianas. En teora, hay dos
sistemas de tipificacin distintos: fenotipificacin y genotipificacin. El fenotipo bacteriano
es determinado por la morfologa de las colonias en diversos medios de cultivo, pruebas
bioqumicas, serolgicas, patogenicidad y susceptibilidad a los antibiticos. Ms
recientemente, la genotipificacin, que se refiere a la discriminacin de las cepas
bacterianas en funcin de su contenido gentico, se ha convertido en la tipificacin
ampliamente utilizada para una cepa bacteriana debido a su alta resolucin. El perfil
gentico de una cepa dada generada por un mtodo de determinacin del genotipo
especfico puede ser tan nico como una huella dactilar. Por lo tanto, genotipificacin
tambin se conoce como huella de ADN.
Mtodos de caracterizacin de cepas bacterianas actuales pueden clasificarse en tres
categoras principales: patrn de bandas de ADN, secuenciacin de ADN, y los mtodos
basados en la hibridacin de ADN. Los mtodos basados en el patrn de bandas ADN
discriminan las cepas estudiadas sobre la base de las diferencias en el tamao de las
bandas de ADN (fragmentos) generados por la amplificacin de ADN genmico o
mediante la escisin de ADN utilizando enzimas de restriccin (ER).
siguiente actividad:
1. Elabora un cuadro comparativo en el que describas las tres estrategias de
transferencia de material gentico donde incluyas las diferencias y similitudes
entre las mismas.
2. Compara las ventajas de cada tipo de mecanismo de recombinacin bacteriana
y describe un ejemplo en cada caso, puedes apoyarte en imgenes.
3. Guarda tu trabajo en un archivo de Power point y envalo a la seccin Tareas
con la siguiente nomenclatura: BGMB_U2_A2_XXYZ.
4. Espera la retroalimentacin de tu Facilitador(a), quien aportar elementos
importantes para perfeccionar tu trabajo.
* Consulta la rbrica de evaluacin para conocer los criterios con los cuales ser
calificado tu trabajo.
Autoevaluacin
Realiza el siguiente cuestionario de autoevaluacin para medir tu aprovechamiento de
los temas estudiados a lo largo de la unidad 2. Al finalizar, compara tus resultados.
Encontrars las respuestas correctas junto con los materiales de la asignatura.
1. La recombinacin de material gentico es un evento que promueve:
a)
b)
c)
d)
Conjugacin
Transduccin
Replicacin
Transformacin
d) Transformacin
4. Tipo de recombinacin en el que participan bacterifagos:
a)
b)
c)
d)
Conjugacin
Transduccin
Replicacin
Transformacin
Bacterifagos
Plsmidos
Factores de virulencia
Todas las anteriores
6. Un vector de clonacin:
a)
b)
c)
d)
Observando su genotipo
Midiendo su tamao
Valorando su resistencia a drogas
Todas las anteriores
9. Bacterifago es:
a) Un protozoario
b) Una levadura
c) Una bacteria
d) Un virus
10. Elementos bsicos para obtener una BGM:
a)
b)
c)
d)
Cierre de unidad
En la presente unidad se revis bsicamente las bases moleculares que sustentan la
recombinacin bacteriana a travs de revisar detalladamente los mecanismos de
transferencia del material gentico.
Ciencias de la Salud Biolgicas y Ambientales | Ingeniera en Biotecnologa
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Para saber ms
Si te interesa conocer ms de la relacin que guardamos con los procariontes te
recomiendo revisar la lectura del microbioma humano:
Crdenas Guzmn G (2012). El microbioma humano. Cmo ves? 167:10-14 Recuperado
de http://www.comoves.unam.mx/assets/revista/167/el-microbioma-humano.pdf
Sabas que existe una normatividad para el manejo de los organismos genticamente
modificados? puedes enterarte al respecto:
Ley de bioseguridad de organismos genticamente modificados. Recuperado de
http://www.diputados.gob.mx/LeyesBiblio/pdf/LBOGM.pdf
Debemos o no producir organismos genticamente modificados, conoce la opinin de la
Academia Mexicana de Ciencias:
Comit de Biotecnologa de la Academia Mexicana de Ciencias (2007). Por un uso
responsable de los organismos genticamente modificados. Recuperado de
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/por_un_uso_responsable_ogms.pdf
Fuentes de consulta
Arutyunov, D., Frost, L. S. (2013). F conjugation: Back to the beginning. Plasmid 70:18-32.
Betancor, L., Gadea, P., Flores, K. (2006). Gentica Bacteriana. Temas de Bacteriologa y
virologa mdica. 2a Edicin. Uruguay: Universidad de la Repblica.
Birge, E. A. (2006). Bacterial and Bacteriophage genetics. 5a Edicin. Tempe: Springer.
Carattoli, A. (2013). Plasmids and the spread of resistance. J. Med. Microbiology, Vol.
303:298-304.
Dale, J. W. y Park, S. F. (2004). Molecular Genetics of Bacteria. 4 Edicin. West Sussex:
John Wiley and Sons Ltd.
Dijkshoorn L., Ursing, B. M., y Ursing, J. B. (2000). Strain, clone and species: comments
on three basic concepts of bacteriology. J. Med. Microbiol. Vol. 49:397-401.
Fredricks, D. N. (2001). Microbial ecology of human skin in health and disease. J. Invest
Dermatol Symp Proc 6:167-9.
Haynes, W. C. (1951). Pseudomonas aeruginosa its characterization and identification.
J. gen. Microbiol. 5:939-950.
Jafari, A., Aslani, M. M., Bouzari S. (2012). Escherichia coli: a brief review of diarrheagenic
pathotypes and their role in diarrheal diseases in Iran. Iran: J. Microbiol. Vol. 4:3, 102-117.
Jett, B. D., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. (1994). Virulence of Enterococci. Clin. Microbiol.
Rev. 7(4): 462478.
Li W., Raoult, D., Fournier, P. E. (2009). Bacterial strain typing in the genomic era. FEMS:
Mocrobiol Rev. 33:892-916.
Pobiega, M., Wojkowska-Mach, J., Et. Al. (2013). Molecular characterization and drug
resistance of Escherichia coli strains isolated from urine from long term care facility
residents in Cracow. Poland: Med. Sci. Monit. Vol 19:317-326.
Rolo, J., Miragaia, M., Turlej-Rogacka, Et. Al. (2012). High genetic diversity among
community-associated Staphylococcus aureus in Europe: Results from a multicenter
study. PLoS ONE 7:4.
Srivastava, S. (2013). Genetics of bacteria. New Deli: Springer.