Universidade de So Paulo

Instituto de Qumica

Biologia Molecular QBQ3401

Qumica-Noturno
2009

Professora:
Nadja Cristhina de Souza Pinto

Monitores:
Carolina Domeniche Romagna
Dbora da Silva Freitas

QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

QBQ-3401
Biologia Molecular
Qumica-Noturno - 2009
DOCENTE RESPONSVEL:
Prof. Nadja Cristhina de Souza Pinto (sala 1065 Bloco 10 superior)
MONITORES:
Carolina D. Romagna (sala 1065 Bloco 10 superior)

Dbora da Silva Freitas (sala Bloco

HORRIO E SALAS:
Aulas Expositivas e Exerccios (Discusso): 6as feiras das 19 s 22:40h - Sala 10 - Bloco 6 inferior
Aulas Prticas: 6as feiras das 19 s 22:40h - Laboratrio Didtico - Bloco 7 superior
ORGANIZAO DO CURSO:
O Curso envolve aulas expositivas, perodos para resoluo e discusso de exerccios e aulas prticas.
Utilizando as informaes das aulas expositivas e a bibliografia recomendada, os alunos devero resolver os
exerccios e entregar as resolues professora. Os exerccios sero discutidos em sala de aula com
acompanhamento da professora e das monitoras.
Nas aulas prticas sero realizadas experincias que envolvem algumas tcnicas bsicas utilizadas em
Biologia Molecular. Os alunos sero divididos em grupos e cada grupo dever apresentar um RELATRIO
contendo os resultados obtidos e a resoluo das questes correspondentes. S sero aceitos relatrios de
alunos que realizaram as aulas prticas. POR RAZES DE SEGURANA, O USO DO AVENTAL NAS
AULAS PRTICAS OBRIGATRIO.
AVALIAO:
A avaliao ser feita atravs da mdia ponderada das notas obtidas nas duas provas (P1, P2), nos
quatro relatrios (R) e nos exerccios (E), de acordo com a frmula abaixo:
Nota final= (P1 x 2) + (P2 x 2) + (mdia dos 4 relatrios)+ (mdia dos exerccios)
6
A matria das provas ser CUMULATIVA. No final do curso, ser oferecida uma prova substitutiva para
alunos que tenham sido impossibilitados de fazer uma das provas por motivo de doena, que incluir toda a
matria do curso. Um atestado mdico dever ser entregue neste caso. O peso da prova substitutiva ser igual
ao da prova perdida.
Os alunos que no atingirem Nota Final 5,0, porm atingirem 3,0 e 75% de frequncia podero realizar a
prova de recuperao, que ser administrada em fevereiro 2010.
A FREQUNCIA OBRIGATRIA MINMA S AULAS DE 75%.

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CRONOGRAMA QBQ-3401
21/8
28/8
04/9
11/9
18/09
25/09
02/10
09/10
16/10
23/10
30/10
06/11
13/11
20/11
27/11
04/12
11/12

Aula1 - Introduo Biologia Molecular. Estrutura e Funo dos cidos

Nuclicos. Exerccio 1
Aula 2 - Replicao do DNA. Exerccio 2
Experincia 1: Extrao de DNA de E. coli
Aula 3 - Mutao e Reparo de DNA. Exerccio 3
Aula 4 - Estrutura gnica e Transcrio. Exerccio 4
Experincia 2: Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) para deteco
de genes
Aula 5 - Cdigo Gentico. Exerccio 5
Prova 1
Aula 6 - Processamento do RNA e Traduo/Sntese de Protenas.
Exerccio 6
Aula 7 - Regulao da Expresso Gnica. Exerccio 7
Experincia 3: Transformao de bactrias com plasmdeos
Aula 8 - Transduo de Sinal e Cncer. Exerccio 8
Aula 9 - Tecnologia do DNA recombinante. Exerccio 9
CONSCINCIA NEGRA No haver aula
Experincia 4: Induo de Beta-galactosidase com IPTG
Prova 2
Prova substitutiva

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA:
Ingls:

Biochemistry - D. Voet & J.G. Voet - John Wiley & Sons 3rd edition. 2004.

Biochemistry J. M. Berg, J.L. Tymoczko & L. Stryer. W.H.Freeman 6th edition - 2006.

Genes IX Lewis, B. Jones & Bartlett Publishers; 9th edition. 2007

Lehninger Principles of Biochemistry - D.L. Nelson & M.M. Cox. Worth Publishers 4th edition 2004.

Molecular Biology of the Gene. James D. Watson, Nancy H. Hopkins, Jeffrey W. Roberts, Joan
Argetsinger Steitz ,Alan M. Weiner. 5th Edition - 2003
Portugus:

Bases Moleculares da Biotecnologia. A.H.Ulrich, W. Coli; P.L.Ho;M. Faria;C.A. Trujillo. Editora Roca.1
Edio. 2008

Biologia Molecular Bsica A. Zaha. Editora Mercado Aberto. - 3a edio. 2003

Biologia Molecular do Gene. James D. Watson, Nancy H. Hopkins, Jeffrey W. Roberts, Joan Argetsinger
Steitz ,Alan M. Weiner. Editora Artmed. 5a edio. 2006

Bioqumica - L. Stryer - Editora Guanabara Koogan - 5a edio. - 2004.

Fundamentos de Bioqumica D. Voet, J. G. Voet & C. W. Pratt Editora Artmed. 3a edio. 2006.

Princpios de Bioqumica - A.L. Lehninger, D.L. Nelson & M.M. Cox. Editora Sarvier -4a edio. 2007.

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Exerccios

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Exerccio 1. Estrutura e Funo dos cidos Nucleicos

1.Quais as diferenas de composio e estrutura entre RNA e DNA. Como se distingue entre uracila e
timina, e entre ribose e desoxirribose?
2. RNA facilmente hidrolizado por lcali, enquanto DNA no o . Por que?
3.Escreva a seqncia de bases da fita complementar do DNA dupla fita que apresenta uma fita com a
seqncia:
(5') ATGCCGTATGCATTGCATTC (3')
Exprima, em porcentagem, a composio de bases do DNA de fita dupla.
4. Uma molcula de cido nucleico tem a composio de bases abaixo. O que voc pode afirmar sobre
esta molcula?
C = 24,1%

G = 18,5%

T = 24,6%

A = 32,8%

5. Explique por que cidos nucleicos so desnaturados quando submetidos a alta temperatura ou pHs
extremos? Uma molcula de DNA desnaturada por aquecimento pode ser renaturada? Como?
6. O valor de Tm para o DNA pode ser calculado usando-se a frmula:
Tm = 69,3 + 0,41(%GC), onde GC a porcentagem de Guanina + Citosina
a) DNA de E. coli contm 50% GC. Calcular o Tm para o DNA desta bactria.
b) As curvas de fuso da maioria dos DNAs que ocorrem naturalmente revelam que o Tm
normalmente maior do que 65oC. Por que isto importante para a maioria dos organismos?
c) Como varia o Tm com a fora inica da soluo?
d) O que acontece com Tm quando se adiciona etanol soluo de DNA?
7. Quais das seguintes afirmaes sobre o DNA isolado de um cromossomo eucaritico so corretas?
- resistente quebra durante a extrao por seu grande tamanho.
- linear e no ramificado
- uma molcula nica
- Pode ter tamanho superior a 100 Mb
8. O ncleo de uma clula humana tem 6m de dimetro e a extenso total do DNA dos seus 46
cromossomos soma 1,8m. Como resolvida a discrepncia entre estas duas grandezas?

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Exerccio 2. Replicao do DNA

1. Combine as caractersticas da coluna da direita com o tipo de hlice do DNA da coluna da esquerda
(a) A-DNA
(b) B DNA
(c) Z-DNA

(1) As pirimidinas esto na configurao anti

(2) Os fosfatos na cadeia esto em ziguezague
(3) A sua formao favorecida por superenovelamento negativo
(4) Apresenta um sulco maior relativamente largo e profundo
(5) Apresenta uma estrutura helicoidal no sentido dextrgiro
(6) Tem 10,4 pares de bases por volta
(7) Tem a estrutura similar quela do RNA de fita dupla
(8) As fitas na hlice so anti-paralelas

2. Descreva o experimento de Meselson-Stahl. Qual seria o resultado deste experimento se a replicao

do DNA fosse conservativa?
3. Combine as propriedades ou funes na coluna direita com a DNA polimerase na coluna da
esquerda:
(a) DNA polimerase I
(1) envolvida na replicao
(b) DNA polimerase II
(2) requer um iniciador e um molde
(c) DNA polimerase III
(3) envolvida no reparo de DNA
(4) sintetiza a maior parte do DNA durante a replicao
(5) remove o iniciador e preenche as lacunas durante a replicao

4. O fragmento de DNA no esquema abaixo de fita dupla em ambas as extremidades, porm de fita
simples no meio. As extremidades da fita superior esto indicadas.
5'____________________________3'
__________P
HO_________
a) O fosfato (P) indicado na fita inferior est na extremidade 5' ou 3' do fragmento ao qual ele pertence
? (Indique no esquema).
b) Como voc esperaria que a lacuna fosse preenchida pelos processos de reparo do DNA "in vivo" ?
c) Quantos fragmentos voc esperaria encontrar na fita inferior se o experimento fosse realizado "in
vitro", na presena de todos os desoxirribonucleotdeos-trifosfato e DNA polimerase, mas na ausncia
de DNA ligase?
5. Explique porque certas variedades mutantes da DNA polimerase I podem apresentar atividade de
DNA polimerase praticamente ausente, mas podem ter atividade de exonuclease 5' 3' praticamente
normal.
6. Qual a atividade da DNA polimerase III que responsvel pela editorao durante a replicao? Por
que essa atividade importante?
7. Que propriedades do DNA e da DNA polimerase sugerem que a duas fitas no podem ser replicadas
pelo crescimento no mesmo sentido (como mostra a figura abaixo)? Como a clula supera o problema?
Esquematize a formao da ligao fosfodiester durante a replicao a partir do nucleotdeo trifosfato
livre, mostrando o grupo fosfato que incorporado.
6

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8. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction) utilizada para obter grandes quantidades de DNA a
partir de amostras contendo quantidades nfimas de DNA.
a) Descreva os passos envolvidos nesta tcnica.
b) Quais as caractersticas da DNA polimerase utilizada? Porque essas caractersticas so fundamentais
ao desenvolvimento dessa tcnica?
c) Exemplifique aplicaes desta tcnica.

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Exerccio 3. Mutao e Reparo do DNA

1. Quais os principais tipos de reparo de exciso e qual a especificidade de leses de cada via?
2. Descreva brevemente as etapas de reparo do DNA lesado por luz UV e as enzimas nelas envolvidas.
3. Como os dmeros de timina podem ser diretamente removidos do DNA?
4. Como a maquinaria de reparo de E. coli identifica a fita de DNA que tem um nucleotdeo no
complementar incorporado durante a replicao?
5. Bromouracila um mutagnico que produz troca de bases, enquanto acridina causa adies ou
delees de uma base no DNA. Mutaes causadas por acridina frequentemente podem ser
compensadas por mutaes secundrias, distantes vrios nucleotdeos da primeira mutao, enquanto
aquelas causadas por bromouracila geralmente requerem mudanas dentro do mesmo codon. Explique.
6. Explique como algumas cepas da bactria Salmonella so usadas para detectar substncias
carcinognicas. Por que extrato de fgado de mamfero est envolvido no teste?
7. Que propriedade da DNA polimerase I responsvel pela observao de que bactrias mutantes
polA1 so mais sensveis luz ultravioleta ? Explique.
8. Por que a taxa de mutacao observada em E.coli de 10-8 a 10-10 / par de bases replicado, apesar das
taxas de erro da Pol I e Pol III serem de 10-6 a 10-7 /par de bases replicado?

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Exerccio 4. Estrutura gnica e Transcrio

1. Genes de eucariotos so geralmente constitudos de introns e exons. Estas seqncias so tanto
transcritas como traduzidas? A remoo dos ntrons (splicing) tem que ser um processo extremamente
preciso. Por que? D um exemplo de "splicing" aberrante que leva a um tipo de talassemia em
humanos.
2. As DNA polimerases necessitam de um iniciador, ao qual se liga um novo nucleotdeo para o
crescimento da cadeia polinucleotdica. necessrio um iniciador para a ao da RNA polimerase?
3. Que subunidades da RNA polimerase bacteriana so necessrias para a iniciao da transcrio a
partir de um promotor? E para a terminao da transcrio? Explique como uma mutao poderia dar
origem a uma E. coli resistente ao antibitico rifamicina.
4. A seguinte fita simples de DNA vai se transcrita in vitro:
5'- ATGTACCGAAGTGGTTT - 3'
Coloque os grupos fosfato e um asterisco naqueles que sero radiativos quando a transcrio for feita
32
na presena de [ P]-ATP
(a?)
32
b) Faa o mesmo para [ P]-UTP
5. Defina "promotor", enumere as suas propriedades e diga como podem ser localizados atravs da
tcnica de "footprinting".
6. Combine as descries na coluna da direita com a RNA pol DNA-dependente eucaritica
apropriada:
a) RNA pol I
(1) localizada no nuclolo
(2) localizada no nucleoplasma
(3) sintetiza hnRNA
b) RNA pol II
(4) sintetiza tRNA
(5) sintetiza rRNA
(6) sintetiza precursores do rRNA
c) RNA pol III
(7) inibida por -amanitina
(8) sintetiza RNA na direo 5'-3'
(9) composta de vrias subunidades
7. Voc usaria num paciente, como agente teraputico anti-bacteriano, qual destes antibiticos: a)
rifamicina ou b) actinomicina D ? Justifique a sua escolha.
8. Quais as principais caractersticas das seqncias de promotores de genes eucariticos transcritos em
mRNAs? Qual a funo dos fatores de transcrio e enhancers?

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Exerccio 5: O Cdigo Gentico

1. No desenho abaixo, da esquerda para a direita, indique as pontas 5' e 3' em cada uma das fitas. Selecione
uma das opes abaixo e explique o porqu de suas escolhas:
fita codificadora de DNA
___________________________________________________
fita complementar ou fita molde de DNA
___________________________________________________
fita de mRNA
___________________________________________________
fita de tRNA (anticdon para Metionina)

2. Faa um x no cido nucleico (pode ser mais de um) que corresponde aos conceitos abaixo:
cdigo gentico ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA
cdon ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA
anti-cdon ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA
moldura de leitura ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA
3. Baseando-se na lista de cdons e amino cidos abaixo, quais das seguintes afirmaes so corretas?
AGU = serina
AGC = serina
AAG = lisina
AAA = lisina
AUG = metionina
AUA = isoleucina
a) O cdigo gentico degenerado
b) A alterao de um nico nucleotdeo no DNA que dirige a sntese destes cdons poderia levar
substituio de uma isoleucina por uma lisina no polipeptdeo.
c) A alterao de um nico nucleotdeo no DNA que dirige a sntese destes cdons necessariamente levaria
substituio de um aminocido no polipeptdeo codificado.
4. Um tRNA com o anticdon ACU se ligaria a um ribossomo na presena de um dos cdons da questo 3.
Qual? Olhando a tabela ao final deste exerccio faa a previso do anti-cdon para terminao da traduo
e a seqncia das bases correspondentes no DNA codificador .
5. Uma globina de 146 aminocidos sofreu uma mutao no cdon correspondente ao sexto aminocido da
cadeia (ver tabela ao final do exerccio). A anlise do DNA indicou uma mudana de TTC para TAC na
fita molde. Pergunta- se:

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a) A mutao provocou a troca de um aminocido por outro? Em caso afirmativo, quais so estes
aminocidos?
b) Quais as implicaes para a estrutura da protena?
6. Uma fita de um fragmento de DNA isolado de E. coli tem a seguinte sequncia
5'...AGGTTACCTAGTTGC...3'
Qual a sequncia do polipeptdeo que seria codificado pelo mRNA sintetizado na questo 3 (no
intendi!). Assuma que o quadro de leitura comea com o primeiro nucleotdeo.
7. Abaixo est anotado o gene completo da insulina como se encontra no Banco de dados NCBI. Para
facilitar a leitura e a contagem, h um nmero que denota a primeira base da fila e as bases esto separadas
por um espao colocado a cada 10 bases. O cdon de iniciao e o cdon de terminao esto sublinhados
e em negrito. Qual o nmero de aminocidos na protena resultante da transcrio desta seqncia?
Explique porque.
1 gctgcatcag aagaggccat caagcacatc actgtccttc tgccatggcc ctgtggatgc
61 gcctcctgcc cctgctggcg ctgctggccc tctggggacc tgacccagcc gcagcctttg
121 tgaaccaaca cctgtgcggc tcacacctgg tggaagctct ctacctagtg tgcggggaac
181 gaggcttctt ctacacaccc aagacccgcc gggaggcaga ggacctgcag gtggggcagg
241 tggagctggg cgggggccct ggtgcaggca gcctgcagcc cttggccctg gaggggtccc
301 tgcagaagcg tggcattgtg gaacaatgct gtaccagcat ctgctccctc taccagctgg
361 agaactactg caactagacg cagcccgcag gcagcccccc acccgccgcc tcctgcaccg
421 agagagatgg aataaagccc ttgaaccagc
8. O gene de uma protena, cuja seqncia parcial est indicada abaixo, sofreu uma srie de mutaes
pontuais independentes, o que levar produo de diferentes RNAs mensageiros, Indique a seqncia de
aminocidos do peptdeo correspondente (a tabela se encontra no fim dos exerccios) e explique a
conseqncia do tipo de mutao que ocorreu em cada um dos RNAs resultantes.
5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUGGCUUGUAACU....3'
(a) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGGGGCUUGUAACU....3'
(b) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCAUGGCUUGUAACU.....3'
(c) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUCGCUGUAUACU......3'
(d) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUUGGCUUGUAACU....3'

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Exerccios 6. Sntese de protenas

1. Considere a seguinte sequncia de um fragmento de DNA isolado de bactria:
5'CTGATAAGGGATTTAAATTATGTGTCAATCACGAATGCTAATCGCTTAACACTTC 3'
a) Assumindo que esta seqncia corresponde seqncia da fita codificadora, qual seria a seqncia
de aminocidos do polipeptdeo produzido quando um mRNA transcrito deste gene for traduzido? Que
caractersticas na seqncia do mRNA determinam qual o cdon iniciador? Considere a primeira
base como o incio da transcrio.
b) De acordo com o princpio de oscilao no pareamento de bases ("wobble"), qual o nmero mnimo
de tRNAs necessrio para decodificar os seis cdons de leucina - UUA, UUG, CUU, CUC, CUA e
CUG ? Explique.
2. Num sistema de sntese de protenas in vitro, que permita o incio e trmino da sntese em qualquer
seqncia de RNA, que peptdeo seria produzido pelo poli-ribonucleotdeo 5'-UUUGUUUUUGUU-3'?
Indique qual o aminocido N-terminal e o C-terminal do polipeptdeo obtido.
3. O cdon AUG funciona tanto para iniciar uma cadeia polipeptdica quanto para dirigir a
incorporao de uma metionina em posies internas de uma protena. Quais os mecanismos de
seleo do cdon AUG para a iniciao da traduo em procariotos?
4. No que consiste a sequncia de Shine Dalgarno? Ela universal? Explique.
5. Escreva os produtos finais das seguintes reaes:
a) valina + ATP + tRNAVal + valil-tRNA sintetase
b) valina + ATP + tRNAIle + isoleucil-tRNA sintetase
6. Explique quais so os mecanismos de ao dos antibiticos que agem na clula procaritica. Se
muitos antibiticos exercem sua ao por inibio da sntese protica, como alguns destes antibiticos
podem ser usados em humanos para combater infeces microbianas sem causar efeitos txicos devido
inibio da sntese protica eucaritica?
7. O que se entende por chaperona?
8. Quais eventos podem acontecer com uma protena depois de terminada sua sntese?

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Exerccio 7. Regulao da Expresso Gnica

1. Compare a expresso gnica em procariotos e eucariotos quanto a:
a) grau de acoplamento da transcrio e da traduo.
b) nmero de produtos gnicos em um transcrito primrio.
c) nmero de protenas resultantes da traduo de um transcrito primrio.
d) proporo de seqncias codificadoras no DNA.
e) organizao de genes em operons.
2. Defina expresso gnica constitutiva. Compare expresso gnica induzida com represso gnica.
Use o esquema proposto por Jacob e Monod para o operon da lactose e defina os termos operon, gene
estrutural, gene regulador, operador, promotor, indutor, repressor e co-repressor.
3. Numa cultura de E.coli em um meio contendo tanto lactose quanto glicose, qual dos acares
metabolizado preferencialmente? Qual o mecanismo que permite esta seletividade? O que acontece
quando a glicose se esgota durante o crescimento da bactria?
4. Para o cultivo de E.coli utilizaram-se meios contendo alm dos sais necessrios, os componentes:
a) lactose
d) glicose + cAMP
b) lactose + glicose
e) lactose + glicose + cAMP
c) glicose
Analise a produo de - galactosidase em cada caso, justificando a resposta segundo o modelo de
Jacob e Monod.
5. Qual o efeito da deleo do gene regulador do operon lac? Haveria outro tipo de mutao resultando
no mesmo efeito?
6. Um mutante incapaz de crescer tanto em galactose quanto em arabinose, alm de diversas outras
fontes de carbono, foi isolado de uma cultura de E. coli do tipo selvagem. Que tipo de mutao pode
ter produzido estes resultados?
7. Demonstrou-se que o operon para a biossntese do aminocido fenilalanina de certa bactria
regulado por um mecanismo de atenuao. O que pode ser afirmado sobre a seqncia de aminocidos
do peptdeo lder para este operon? Explique.
8. A cromatina que ativa transcricionalmente (eucromatina) tem estrutura dispersa, enquanto a
cromatina que inativa (heterocromatina) compacta. Quando ncleos de clulas de galinha
produzindo globina foram tratados brevemente com DNase pancretica, os genes de globina de adultos
foram seletivamente destrudos, mas os genes para globina embrinica e ovalbumina permaneceram
intactos. Quando os ncleos de clulas de oviduto foram tratadas com DNase, os genes de ovalbumina
foram destrudos. Explique estes resultados.

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Exerccio 8. Transduo de Sinal e Cncer

1. Descreva o mecanismo de ativao:
a. das Protenas G pelos receptores serpentina
b. da Protena Quinase A por cAMP
2. O que so protooncogenes e oncogenes? Que tipos de protenas estes genes podem codificar?
3. A protena c-src homloga protena viral oncognica conhecida com v-src e atua como tirosina
quinase citosslica, cuja atividade regulada por fosforilao. Qual a caracterstica de v-src que a torna
uma protena oncognica.
4. Qual o tipo de modificao covalente reversvel em protenas mais frequente nas cascatas de
sinalizao intracelular? Quais so as enzimas que catalisam esta modificao?
5. O cAMP (AMP cclico) um importante mensageiro secundrio para muitos hormnios. Como
pode ocorrer a ativao da enzima adenilato ciclase aps ativao de um receptor hormonal?
6. Como a transcrio de certos genes pode ser influenciada em resposta a um sinal extracelular?
7 A predisposio ao cncer pode ser hereditria. Explique este fato lembrando-se que existem
protenas que agem como supressores do crescimento celular.
8. Retinoblastoma, um cncer de retina que aflige crianas, est asssociado a uma deleo no
cromossomo 13. Proponha uma possvel funo para o gene selvagem (Rb) e que codifica uma
protena de 105 kD localizada no ncleo e capaz de se ligar ao DNA.

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Exerccio 9. Tecnologia do DNA recombinante

1. A figura na pgina seguinte mostra o autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA pelo
mtodo de Sanger. Escreva a seqncia deste fragmento de DNA lendo o gel de baixo para cima.
Traduza a seqncia obtida, considerando as trs fases de leitura. O que aconteceria se durante a leitura
do gel voc tivesse omitido uma base? Como voc faria para ter segurana absoluta da seqncia deste
fragmento de DNA?
2. O que a diferencia a tcnica de Southern blot da tcnica de Northern blot?
3. Voc gostaria de analisar os nveis de expresso do gene que codifica a protena A de um fungo em
resposta ao estresse hipertrmico. Que metodologias poderia utilizar? Por outro lado, se voc quiser
analisar simultaneamente os nveis de expresso de milhares de genes deste fungo na mesma condio,
qual seria a metodologia mais adequada?
4. Qual a diferena entre uma biblioteca genmica e uma biblioteca de cDNA? Explique como a
presena de ntrons em genes eucariticos complica a gerao de produtos proticos que eles codificam
quando a expresso feita em bactria. Como se pode resolver este problema?
5. A partir de uma biblioteca de cDNA voc isolou um cDNA completo que codifica para uma protena
que um potente estimulador do sistema imunolgico. Agora voc deseja clonar este cDNA em um
vetor de expresso para produzir grande quantidade desta protena em E. coli. O cDNA possui nas
suas extremidades stios para enzima BamHI e voc planeja clon-lo no stio de BamHI do vetor de
expresso. Esta sua primeira vez com experimentos de clonagem e voc decide seguir
cuidadosamente as instrues do manual de clonagem que recomenda que o vetor digerido deve ser
tratado com fosfatase alcalina para remover o fosfato da extremidade 5.
a) Por que deve ser feito o tratamento com fosfatase alcalina?
b) Como voc analisaria se a clonagem foi bem sucedida?
c) A protena de seu interesse afeta o crescimento das bactrias. Como voc faria para obter grande
quantidade desta protena recombinante?

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

6. O gene completo (contendo todos os exons e ntrons) do hormnio de crescimento de ratos pode ser
expresso em camundongos sob o controle de um promotor indutvel por Cd2+. Como podem ser
obtidos tais camundongos transgnicos? Quais as suas caractersticas? Como voc explica o fato da
expresso do gene do rato ser expresso perfeitamente em camundongos?
7. Planeje a obteno de cabras transgnicas que possam produzir o hormnio de crescimento humano
em seu leite.
8. H poucos anos, cientistas europeus realizaram a clonagem de uma ovelha (Dolly), a partir de
clulas de uma ovelha adulta. Compare este tipo de experincia com a obteno de um animal
transgnico.

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ROTEIRO PARA AS
AULAS PRTICAS

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ROTEIRO PARA AULAS PRTICAS

RECOMENDAES:
1. Por razes de segurana no ser permitido ao aluno frequentar as aulas sem avental. PROIBIDO
COMER, BEBER E FUMAR NO LABORATRIO.
2. Leia com detalhe o protocolo e preste ateno s instrues fornecidas antes de iniciar a experincia.
3. Procure utilizar reagentes, vidraria e equipamentos disponveis com cuidado, para evitar desperdcio
e quebra.
4. Mantenha sua rea de trabalho organizada. Ao terminar a experincia passe gua na vidraria
utilizada e coloque-a no local indicado.
5. O relatrio individual dever ser entregue no final de cada uma das aulas prticas. O relatrio dever
ser feito de acordo com modelo ao final de cada protocolo experimental. Aps preenchidas, as
respectivas folhas devem ser destacadas e entregues.
6. Qualquer dvida ou acidente pea auxlio s tcnicas, s monitoras ou professora.

USO DO AVENTAL NAS AULAS PRTICAS

OBRIGATRIO.

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

EXPERINCIA No.1: EXTRAO DE DNA (E RNA) DE Escherichia coli.

Fundamento
Freqentemente necessria a purificao de DNA de alto peso molecular para sua
manipulao e anlise subsequentes. Procedimentos mais comuns para preparao de DNA genmico
bacteriano consistem na lise das bactrias com a utilizao de lisozima e/ou detergente, seguida de
extraes com solventes orgnicos (fenol/clorofrmio) para remoo de protenas. Os cidos nuclicos
so ento precipitados com etanol na presena de concentraes relativamente altas de sal (0,1M
0,5M). Na obteno de DNA de alto peso molecular (molcula longa e fibrosa) devem ser tomados
cuidados para se evitar sua fragmentao.
Material
- 2 Tubos de ensaio mdio
-

1 Proveta de 50 mL

1 clice graduado

1 basto de vidro

1 tubo de centrifuga

1 recipiente de descarte c/ lisoforme

10 mL de SDS 10%

10 mL de NaCl 1%

1 frasco de Clorofrmio c/ lcool Isoamlico na Capela

- 1 frasco de Etanol no freezer -20 C

Procedimento Experimental
Ser utilizada uma cultura de bactrias E.coli HB101 que foi inoculada ontem no final da tarde em
meio de cultura lquido esterilizado (meio LB: triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, pH
final ajustado para 7,5 com NaOH) e mantida sob agitao vigorosa a 37C at hoje pela manh,
quando a cultura foi transferida para a geladeira.
1. Coletar as bactrias pela centrifugao de 20mL da cultura a 5000rpm por 5 min. Descartar o meio
de cultura em um frasco contendo Lisoform a 10 %. Secar bem o tubo, invertendo-o sobre papel
absorvente. Balancear os tubos!
2. Adicionar 6mL da soluo I (citrato de sdio 0,015M, NaCl 0,15M, pH final ajustado para 7,0 com
HCl). Tampar o tubo e ressuspender o precipitado de bactrias por inverso.
3. Remover a tampa e adicionar 0,7mL da soluo II [Dodecil Sulfato de Sdio (SDS) 10% (m/V)].
Fechar o tubo e incub-lo em banho-maria a 60C por 10 min, com agitao manual suave.
4. Retirar o tubo do banho, abrir e deix-lo a temperatura ambiente por 5min. Adicionar igual volume
(6,7mL) da soluo III (Clorofrmio:alcool isoamlico 24:1 V/V). No pipetar com a boca! Fechar
muito bem o tubo. Agitar suavemente por 10 min temperatura ambiente. Esta etapa deve ser realizada
na capela de exausto.
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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

5. Centrifugar 5 minutos a 5000 rpm.

6. Remover delicadamente a fase aquosa (fase superior) com pipeta Pasteur de ponta grossa para uma
proveta. Estimar o volume e transferir para um clice graduado.
7. Medir, na mesma proveta, 2 volumes de etanol resfriado a -20C e adicion-lo lentamente com
pipeta Pasteur, pela parede do clice.
8. "Enrolar" o DNA com uma pipeta Pasteur de ponta curva. Transfer-lo para um tubo de ensaio
contendo 10mL de Soluo IV (NaCl 1%). Aquecer a 50oC, por 10-20 minutos, at completa
dissoluo.
9. Identificar o tubo com o nmero do grupo. Tomar uma alquota e diluir em 1 mL de gua. Medir a
D.O.260nm e D.O.280nm e calcular a relao D.O.260nm /D.O.280nm. Estimar a quantidade de DNA obtida
assumindo que D.O.260nm (Densidade ptica a 260nm) = 1 equivale a 50g DNA/mL.

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

RELATRIO - EXPERINCIA No.1

Grupo No.
Nomes dos Integrantes do Grupo:

Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:_________________________________________
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_____________________________________________________________________
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RESULTADOS OBTIDOS :_____________________________________________
_____________________________________________________________________
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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

QUESTES:
1. Qual a funo do SDS, Clorofrmio: lcool Isoamlico e Etanol nas etapas da purificao?
Consultar tabela (no fim da apostila).

2. Por que possvel "enrolar" o DNA no basto de vidro?

3. Cite dois cuidados importantes para o sucesso da experincia realizada.

4. Se compararmos as medidas de absoro a 260nm e a 280nm da amostra de DNA obtida e de uma

soluo de DNA puro obtido a partir do mesmo volume inicial de cultura de bactrias, o que
observaramos? Por que?

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

5. Qual o espectro de absoro do DNA na luz ultravioleta. Como se compara com o espectro de
absoro de albumina?

6. Como voc faria para obter DNA puro a partir dessa preparao que contm DNA e RNA?

7. Por que ocorre o efeito hipercrmico na desnaturao do DNA?

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

EXPERINCIA No. 2: TRANSFORMAO DE BACTRIAS COM

PLASMDEOS CONTENDO GENES DE RESISTNCIA A ANTIBITICOS.
Fundamento

A tcnica de transformao permite a introduo de plasmdeo em uma bactria e sua

manuteno como um elemento autnomo auto-replicativo. Este plasmdeo pode conferir bactria
hospedeira certas propriedades (por exemplo, resistncia a drogas) que podem ter valor seletivo no
meio. Vrias tcnicas so disponveis para transformar uma bactria. Na aula prtica usaremos o
mtodo do CaCl2. Neste mtodo as bactrias so submetidas a um tratamento num meio hipotnico
contendo clcio que as torna competentes para a transformao pelo DNA plasmidial. Usaremos o
plasmdeo pBR322 (ver mapa abaixo).
O plasmdio pBR322 comumente usado para clonagem de genes inteiros ou de fragmentos de
genes. Alm da origem de replicao que permite sua propagao em bactrias (E. coli) o pBR322
apresenta duas marcas genticas, ou seja, genes que codificam para protenas que conferem resistncia
a ampicilina (ampr) e tetraciclina (tetr). Portanto a introduo de pBR322 em E. coli que normalmente
sensvel tanto ampicilina como tetraciclina, leva ao aparecimento de bactrias capazes de crescer
em meio (lquido ou slido) contendo estes antibiticos.
Note que a introduo de genes exgenos no stio da enzima de restrio Pst I leva perda da
resistncia ampicilina, uma vez que este stio est localizado na regio ampr. Da mesma forma,
clonagem no stio da enzima Bam HI leva perda da resistncia a tetraciclina.
Transformao de bactrias que so sensveis a um antibitico, em resistentes, ser revelada
atravs de plaqueamento (inoculao) de bactrias em placas de gar contendo meio LB (meio rico de
Luria Bertani) na ausncia e na presena de antibiticos (ampicilina ou tetraciclina).

Procedimento Experimental

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

O ideal seria fazermos a experincia em condies estreis, para evitar contaminao. Como isto no
ser possvel, manipule convenientemente o material estril fornecido. NO ABRA AS PLACAS DE
GAR AT O MOMENTO DE USO.
As bactrias competentes para transformao foram preparadas a partir de uma cultura em fase
exponencial do crescimento e atravs de sucessivas lavagens do precipitado de bactrias com uma
soluo de CaCl2 e mantidas congelads a -80oC.
1. Inocular 5 ml de meio LB lquido com uma colnia de bactrias HB101 (E. coli) e incubar 37C
at o dia seguinte sob forte agitao (200-250 rpm).
2. Diluir a pr-cultura 1/10 em 10 ml de meio LB, incubar 37C sob agitao at OD600nm =0,3 (fase
logartmica de crescimento).
3. Transferir a cultura para o gelo, coletar as bactrias por centrifugao (4000 rpm, 5min).
Ressuspender o sedimento de bactrias em 10 ml de tampo acetato de sdio (frio) 20 mM pH 6,5
contendo CaCl2 0,1M. Incubar no gelo por 20 minutos.
4. Coletar as bactrias (4000 rpm, 5 min) e ressuspender em 1 ml do mesmo tampo (frio).
5. Aps pelo menos 30 min no gelo estas BACTRIAS COMPETENTES podem ser transformadas.
6. Para transformar, distribuir 0,1 mL/tubo da suspenso de bactrias competentes para cada um de 2
tubos. Adicionar o DNA transformante (0,5 g DNA de pBR322 em 10 l de tampo 10 mM Tris pH
7,5 contendo 1 mM EDTA) a um dos tubos. O outro tubo ser usado como controle (bactria apenas).
7. Incubar em gelo por 15 min antes de dar o choque trmico (42C por exatamente 90 segundos).
Transferir os tubos novamente para o gelo por 2 min.
8. Adicionar 0,9 ml/tubo de meio LB e incubar a 37C sem agitao, em banho-maria, por uma hora.
9. Transferir 25l ou 250l da suspenso para placas de gar LB e LB-A (LB contendo ampicilina ou
carbenicilina) previamente identificadas conforme a tabela abaixo. Espalhar as bactrias com o auxlio
de uma ala de vidro, previamente flambada e em seguida resfriada na prpria tampa da placa de Petri.
10. Incubar as placas por __ h e contar as colnias formadas.
Nmero de colnias/ placa
#1 Bactrias controle 25L
#2 Bactrias controle 250L

Placa LB

#3 Bactrias transformadas 25L

#4 Bactrias transformadas 250L

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Placa LB-A

QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

RELATRIO - EXPERINCIA No.2

Nome:
Grupo No.

Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
RESULTADOS OBTIDOS:
1. Preencher a tabela com o nmero de colnias obtido em cada caso.
Nmero de colnias/ placa
Placa LB

Placa LB-A

#1 Bactrias controle 25L

#2 Bactrias controle 250L
#3 Bactrias transformadas 25L
#4 Bactrias transformadas 250L
2. Qual a eficincia de transformao obtida, em termos de n de colnias/ug de DNA?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

Nome:
QUESTES:
1. Por que se usa cultura em fase exponencial de crescimento para obter bactrias competentes?

2. Qual o papel do choque trmico?

3. Por que as bactrias devem ser incubadas por 60 min a 37C antes de espalh-las em placas de gar?

4. Que utilidade teria esta tcnica do ponto de vista biotecnolgico? D um exemplo.

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

EXPERINCIA No.3: INDUO DA -GALAGTOSIDASE POR IPTG.

Fundamento
A -galactosidase de E.coli uma enzima indutvel que hidrolisa -D-galactosdeos. A atividade desta
enzima pode ser medida com substratos cromognicos que quando hidrolisados do origem a produtos
coloridos. Um exemplo o orto-nitrofenil--D-galactosdeo (ONPG) que incolor, mas na presena de
-galactosidase convertido a galactose e orto-nitrofenol. O orto-nitrofenol amarelo e sua absoro
pode ser medida a 420nm. Altos nveis de -galactosidase s so medidos em culturas crescendo na
presena de lactose ou de um indutor no metabolizvel, o IPTG (isopropil-tiogalactosdeo).

Procedimento Experimental
Ser utilizada uma pr-cultura de bactrias E.coli CSH23 que foi semeada ontem no final da tarde em
meio de cultura lquido esteril e mantida at hoje pela manh, quando a cultura foi transferida para
geladeira.
1. Tomar uma alquota da pr-cultura de bactrias e diluir em meio lquido na presena e ausncia de
IPTG (1mM) sob agitao vigorosa a 37C at a cultura atingir D.O.600nm (Densidade ptica a 600nm)
= 0,7. Esfrie as culturas no gelo por 20 min.
2. Retirar 0L, 50L e 100L de cada cultura, transferindo separadamente para 3 tubos Eppendorf
previamente identificados. Complete com gua para um volume final de 100L. Adicione 0,7mL de
tampo de ensaio (tampo fosfato de sdio 0,1M pH 7,0 contendo KCl 10mM, MgSO4 1mM e mercaptoetanol 50mM).
No descarte o restante das culturas, mantendo-as no gelo.
3. Adicionar 50 L de cloroformio. Agitar bem. Incubar os tubos em banho de gua a 30oC por 5 min.

-IPTG

+IPTG

50
l

100
l

50
l

100
l

H2O

100
l

50
l

50
l

T.E.

700
l

700
l

700
l

700
l

700
l

Clorofrmio

50
l

50
l

50
l

50
l

50
l

Cultura

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

4. Iniciar a reao pela adio de 200 L de ONPG (4mg/mL) e incubar a mistura de reao em banho
de gua a 30oC por 10 min.
5. Interromper a reao adicionando 0,4mL de Na2CO3 1M.
6. Centrifuguar os tubos por 5 minutos na minicentrfuga.
7. Remover delicadamente o sobrenadante de cada tubo para a cubeta sem retirar o clorofrmio, e faa
a leitura da D.O.420nm (Densidade ptica a 420nm). Enxaguar as cubetas com gua entre a cada leitura.
8. Fazer uma diluio 1:10 das culturas de E.coli e faa a leitura da D.O.600nm (Densidade ptica a
600nm).
9. Calcular a atividade de -galactosidase das duas culturas:
Atividade de -galactosidase =

1000 D.O.420 nm
UNIDADES
tempo (min) volume (mL) D.O.600nm da cultura

RELATRIO - EXPERINCIA No.3

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

Nome:
Grupo No.

Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:________________________________________
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RESULTADOS OBTIDOS :_____________________________________________
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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

Nome:
QUESTES:
1. O que voc pode concluir sobre o gentipo da cepa CSH23?

2. O que voc esperaria encontrar em um experimento semelhante utilizando uma cepa cujo gentipo
I-O+Z+? E no caso de uma cepa I+O-Z+? Proponha um experimento para distinguir entre estas cepas.

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

EXPERINCIA No. 4: DIGESTO DE DNA PLASMIDIAL COM ENZIMAS DE

RESTRIO e ELETROFORESE DE DNA EM GEL DE AGAROSE
Fundamento
Preparaes de DNA plasmidial ou cromossomal purificadas podem ser submetidas a digesto com
enzimas de restrio para identificao e caracterizao do DNA. A escolha das enzimas de restrio
deve ser baseada no mapa de restrio (quando disponvel) ou opta-se pelo emprego de um conjunto de
enzimas de forma a permitir a caracterizao do DNA em questo, ou seja, obter seu mapa fsico. As
enzimas de restrio classificam-se em 3 gupos quanto a fora inica para a atividade (alta, mdia e
baixa). As enzimas de restrio comercialmente disponveis costumam vir acompanhadas do tampo
correspondente e instrues para realizar a reao.
Procedimento experimental
A - Digesto do DNA com enzimas de restrio
Na experincia a ser realizada o DNA do plasmdeo ser digerido com 4 enzimas de restrio
diferentes.
Cada grupo (ver tabela abaixo) receber um tubo Eppendorf contendo os componentes da
reao com exceo do DNA plasmidial. Manter o tubo em banho de gelo.
- Cada aluno dever providenciar uma folha de papel monolog para construo do grfico
(Questo 3).
1. Acrescentar 10L da soluo de plasmdeo (DBQ1, 150ng/10L) no tubo.
GRUPOS

1,7,13,19

2,8,14,20

3,9,15,21

4,10,16,22

5,11,17,23

6,12,18,24

EcoRI

BglII

7 L
2 L

7 L
2 L

EcoRI e
XbaI
6 L
2 L

BglII e
XbaI
6 L
2 L

sem enzima

H2O
Tampo da
enzima (10X)
Enzima (1 U)

EcoRI e
BglII
6 L
2 L

1L

1L

1L / 1L

1L / 1L

1L / 1L

Plasmdeo

10L

10L

10L

10L

10L

10L

Volume total

20L

20L

20L

20L

20L

20L

10L
-

2. Misturar o contedo dos tubos por agitao e centrifugao rpida.

3. Incubar a reao em banho maria a 37C durante 60min.
4. Interromper a reao pela adio de 1L EDTA 0,1 M (Opcional). Transferir o tubo para um banho
a 65C, durante 15min. Retirar o tubo do banho e rapidamente coloc-lo em gelo.
5. Adicionar a cada um dos tubos 5L de tampo da amostra. Misturar e centrifugar. A amostra est
pronta para ser analisada em eletroforese em gel de agarose.

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

Tampo de digesto 10X

Tris-HCl 100mM - 500mM*
NaCl 500mM-1M*
MgCl2 100mM
DTT 10mM
*(depende da enzima)

Tampo da amostra
Tris 10mM pH 8,
EDTA 1mM pH 8,
azul de bromofenol 0,25% p/v
xileno cianol 0,25% p/v
sacarose 40% p/v

B. Fracionamento do DNA em gel de agarose.

Preparo do gel de agarose 1,0%
OBS: Sero montados dois gis com espao para aplicao de at 14 amostras
1. Pesar 1,0 g de agarose. Adicionar 100mL de tampo TBE (Tris-borato 89mM, EDTA 2mM pH 8).
2. Aquecer em banho fervente e misturar at completa dissoluo da agarose. Enquanto espera-se a
dissoluo da agarose, preparar a forma para o gel. Resfriar at 40C (at conseguir segurar com as
mos) e acrescentar 5L de uma soluo de brometo de etdio 10mg/mL. CUIDADO BROMETO DE
ETDIO CARCINOGNICO!
Despejar sobre a forma para o gel previamente preparada, incluindo a colocao do pente. Deixar
solidificar por pelo menos 30min.
3. Retirar o pente e transferir o gel para a cuba. Adicionar tampo TBE cuba de modo a cobrir o gel
com menor volume possvel.
4. Aplicar as amostras preparadas na experincia anterior. Ligar a fonte de eletroforese e aplicar
aproximadamente 100V. Cuidado para no tocar o tampo.
5. Interromper a eletroforese quando o corante azul estiver a 0,5cm do fim do gel.
6. Tranferir o gel para o transiluminador e, em seguida observar o gel sob luz UV, utilizando culos
protetores. Fotografar o padro de bandas observado com uma rgua posicionada na lateral do gel.
OBS: Ordem de aplicao das amostras nos gis
GEL 1: 1 - 2 - 3 - 4 -5 6 - Padro de tamanho - 7 - 8 - 9 10 11- 12
GEL 2: 13 - 14 -15 16 17 18 - Padro de tamanho - 19 20 21 22 23 24

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

RELATRIO - EXPERINCIA No.4

Nome:
Grupo No.

Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:________________________________________
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RESULTADOS OBTIDOS: :____________________________________________
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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

Nome:
QUESTES:
1. Por que se observam duas bandas no plasmdeo que no foi incubado com a enzima?

2. Por que se utiliza EtBr (Brometo de Etdio) no gel e no tampo da eletroforese?

3. Gis de agarose podem ser usados para anlise de fragmentos de DNA que tenham entre 70 e
800.000 pares de base. Assim, possvel estimar o tamanho e a quantidade dos fragmentos de DNA. O
tamanho pode ser estimado tomando-se por base a sua mobilidade em relao de outros de tamanho
conhecido. Se o gel foi fotografado com uma rgua ao lado, a mobilidade relativa pode ser lida
diretamente da foto. O grfico da mobilidade em cm (M) contra o tamanho em pb (L) dar uma curva
que pode ser usada para leitura do tamanho com relao a uma determinada mobilidade. Entretanto, a
interpolao muito mais precisa se a funo puder ser encontrada em uma linha reta: grfico de log L
versus M. Desenhe a reta utilizando papel monolog (eixo x, mobilidade em cm, eixo y, tamanho em
pb). Usando-se a mistura de padres de tamanho em pb conhecida calcule o tamanho dos fragmentos
obtidos da digesto do pQBQ com as enzimas utilizadas. Faa um desenho do pQBQ indicando a
posio dos stios de clivagem para estas enzimas.

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DOS CIDOS NUCLEICOS

DNA

RNA

Fora inica
baixa ("Salting in")
alta ("salting out)

Solubiliza
Precipita

Solubiliza
Precipita

Meio cido 0,5N

(brando) frio

Precipita
Despurina

Precipita
Despurina

Meio alcalino brando

(0,3N KOH; 37C; 18h)

ss: estvel
ds: desnatura

Hidrolisa
2' e 3'nucleosdeos

Solvente orgnico
(cte dieletr. < que da H2O)
ex.: etanol, isopropanol

Precipita

Precipita

Agentes desnaturantes que

quebram pontes de H
ex.: formamida, uria

ss: estvel
ds: desnatura

1ria: estvel
2ria: destruda

Luz UV (260 nm)

ss: absorve mais

ds: absorve menos

Absorve

Calor

ss: estvel
ds: desnatura (Tm)

1ria: estvel
2ria: destruda
+

Nucleases

Exonucleases

Endonucleases

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

INIBIDORES DE TRANSCRIO OU DE TRADUO

ANTIBITICOS
Rifamicina (Streptomyces) Rifampicina (sinttica)
Inibe iniciao da transcrio (impede a formao da la. ligao fosfdieser) mas no inibe
elongao da cadeia de mRNA. Liga-se subunidade de RNAP.
Actinomicina D: Estrutura: 2 peptdeos + 3 anis benzeno fenoxazona (ver p 715 Stryer). Extrada de
Streptomyces. Inibe transcrio. Liga-se a dsDNA impedindo que seja usado como template. Anis
fenoxazona intercalam-se entre as bases nitrogenadas do RNA. Usado em tratamento de cncer.
-Amanitina (octapeptdeo cclico) de um cogumelo (Amanita)
Inibe RNAPII (muito) e III (um pouco, em maior concentrao).
Liga-se a RNAPII bloqueando a formao de mRNA ou de precursores de mRNA. Inibe
elongao.
Puromicina: Inibe traduo. Anlogo de aminoacil-tRNA. Liga-se ao stio A do ribossomo, impedindo
a entrada de aminoacil-tRNAS.
Foma ligao peptdica com a cadeia polipeptdica nascente (peptidil transferase). Peptidilpuromicina: peptdeo liberado do ribossomo contendo puromicina ligada covalentemente ao Cterminal.
Tetraciclina: Liga-se ao stio A do ribossomo, impede ligao de aminoacil-tRNA neste stio.
Cloranfenicol: S inibe a sntese de protenas de procariotos e mitocndira (no inibe a sntese protica
extramitocondrial de eucariotos).
Cicloheximida: Inibe a formao dos ribossomos de eucariotos (80S), mas no de procariotos (70S).
Estreptomicina: Causa leitura incorreta do cdigo gentico.
TOXINAS
Diftrica: Inibe sntese protica. Alvo EF2 que cataliza a translocao do peptdeo.
O fragmento A da toxina cataliza a transferncia de ADP para EF2 (ADP-ribosilao)
inativando este fator de elongao da cadeia polipeptdica.
Ricina: Inativa a subunidade 60S dos ribossomos eucariticos.

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

UUU
UUC
UUA
UUG
CUU
CUC
CUA
CUG
AUU
AUC
AUA
AUG
GUU
GUC
GUA
GUG

Phe
Phe
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
Ile
Ile
Ile
Met
Val
Val
Val
Val

UCU
UCC
UCA
UCG
CCU
CCC
CCA
CCG
ACU
ACC
ACA
ACG
GCU
GCC
GCA
GCG

CDIGO GENTICO
Ser UAU
Tyr
Ser UAC
Tyr
Ser UAA STOP
Ser UAG STOP
Pro CAU
His
Pro CAC
His
Pro CAA
Gln
Pro CAG
Gln
Thr AAU
Asn
Thr AAC
Asn
AAA
Thr
Lys
Thr AAG
Lys
Ala GAU
Asp
Ala GAC
Asp
Ala GAA
Glu
Ala GAG
Glu

UGU
UGC
UGA
UGG
CGU
CGC
CGA
CGG
AGU
AGC
AGA
AGG
GGU
GGC
GGA
GGG

Cys
Cys
STOP
Trp
Arg
Arg
Arg
Arg
Ser
Ser
Arg
Arg
Gly
Gly
Gly
Gly

AUG parte do sinal de iniciao e tambm o cdon para as metioninas internas

cadeia.

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